Evaluación de colágeno y elastina Microarchitectures dependiente de la presión en las arterias de resistencia viva, humana por microscopía de fluorescencia etiqueta-libre

El objetivo general de esta metodología es proporcionar un procedimiento estandarizado para la obtención de imágenes de arterias humanas vivas de resistencia para el análisis de la relación entre la microarquitectura de la matriz extracelular y la mecánica de la pared arterial. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en biología y mecánica vascular, como cómo la presión induce cambios en la geometría general, así como en la microarquitectura de la pared vascular. La principal ventaja de la técnica es que no tiene que etiquetar su muestra para la toma de imágenes.

Aunque este método puede proporcionar información sobre la mecánica de las arterias de resistencia, una versión modificada del protocolo se puede aplicar a otros órganos en forma de tubo como los bronquios o a tiras de la vejiga humana o la pared intestinal. Para comenzar, recoja muestras de tejido de interés inmediatamente después de su escisión durante la cirugía y prepare los vasos como se describe en el protocolo de texto adjunto. Presurizar una arteria cánula a cinco milímetros de mercurio.

A continuación, configure la trayectoria óptica para la obtención de imágenes activando el láser de dos fotones y ajustando la longitud de onda de excitación a 820 nanómetros. Inserte un espejo dicroico de paso largo de 460 nanómetros para dividir la luz de emisión entre los fotomultiplicadores y recoger la emisión simultáneamente en dos canales. Utilice filtros de paso de banda ancha de 30 a 60 nanómetros centrados a 520 nanómetros para recoger la autofluorescencia de elastina y otro centrado a 410 nanómetros para recoger la señal de generación de segundo armónico de colágeno.

Ahora configure el tiempo de permanencia del láser y el píxel en 10 microsegundos. Establezca la resolución en 512 por 512 píxeles para un campo de visión del 100%. Habilite el escaneo continuo y utilícelo lo más bajo posible con una potencia de luz de excitación y un tiempo de permanencia de píxeles como sea posible para evitar que las fotos dañen la arteria activa.

A continuación, escanee manualmente la arteria para encontrar el avión con el diámetro máximo. A continuación, elija un corte rectangular que cubra el diámetro más ancho de la arteria y escanee un solo marco con un tamaño de píxel de 300 nanómetros por píxel o menos. Guarde esta imagen para analizarla más adelante.

Para determinar el diámetro del lumen y el grosor de la pared en el diámetro máximo de la arteria, primero cargue la imagen en Fiji. Establezca la escala haciendo clic en el menú principal y luego vaya a analizar seguido de establecer escala. Aquí introduzca el micrómetro por píxel y la relación de píxeles.

A continuación, elija la herramienta de línea de Fiji y dibuje una línea entre las dos láminas elásticas internas a cada lado de la luz arterial. A continuación, haga clic en Control M para informar de la longitud en la tabla de resultados. Continúe dibujando más líneas para medir el grosor de cada pared y guarde la medición final.

Cambie a un objetivo de 60X con una apertura numérica de uno o más. Imagen de la microarquitectura de colágeno y elastina a cinco milímetros de mercurio escaneando todo el grosor de la pared arterial. A continuación, defina la profundidad inicial y final de la pila Z y el espaciado de pasos Z y la densidad de píxeles.

Cuando diseñe sus pilas Z, asegúrese de que su región de interés sea lo suficientemente pequeña como para evitar cualquier inferencia de curvatura en su análisis posterior. Cuando haya terminado, configure cada canal para que se guarde por separado. Por último, encuentre de una a tres regiones de interés diferentes y obtenga pilas de imágenes 3D de buena calidad.

Si su autofluorescencia de elastina es blanqueadora, está utilizando una potencia de luz de excitación demasiado alta. Esto debe evitarse. Para terminar su experimento en curso, puede agregar una concentración diluida de eosina para mejorar la autofluorescencia de elastina.

Al terminar, repita todo el proceso a presiones que varíen hasta 100 milímetros de mercurio, reemplazando el tampón en la cámara del micógrafo con HBS fresco de 37 grados Celsius después de cada paso de presión. Para comenzar el análisis de imágenes, abra la pila de imágenes de elastina en Fiyi. A continuación, ve a la imagen, haz clic en pilas y selecciona Proyecto Z para elegir las imágenes con las que trabajar y elegir la intensidad máxima para el tipo de proyección.

Guarde la proyección de intensidad máxima como una imagen TIFF. A continuación, elija tantos puntos de ramificación de fibra de lámina elástica interna como sea posible y mídalos con la herramienta de ángulo. Trabaje sistemáticamente a través de cada imagen y cuando termine, guarde la hoja de resultados de Fiji.

Para medir la ondulación del colágeno adventicio, abra la pila de imágenes de colágeno en Fiji. A continuación, vaya a la imagen hacia abajo hasta las pilas y seleccione Proyecto Z para elegir las imágenes con las que trabajar y establecer la proyección de intensidad máxima. Ahora cambie el tipo de imagen a una imagen TIFF de ocho bits haciendo clic en imagen, escriba y, a continuación, en ocho bits.

Guarde la proyección de intensidad máxima como una imagen TIFF. Abra el complemento Neuron J haciendo clic en Fiji y seleccionando Neuron J en complementos. Luego abra el archivo TIFF de ocho bits en Neuron J.Una vez abierto, haga clic en agregar trazados y seleccione las fibras para analizar haciendo clic en el inicio y el final de cada fibra.

A continuación, vaya a Medir trazados y elija Mostrar trazado y mediciones de vértices en el cuadro de diálogo. Para calcular la rectitud de la fibra del collage, primero copie los valores de la ventana Trazados de Fiji en Excel. Los valores de longitud en la ventana de trazados son medidas de las longitudes completas de las fibras de colágeno analizadas Lf.En segundo lugar, copie para cada haz de fibras de colágeno analizado la primera y la última coordenada XY de la ventana de vértices de Fiji a Excel.

A continuación, calcule la longitud de la línea recta que conecta cada extremo de la fibra de colágeno L0 analizada utilizando el teorema de Pitágoras. La rectitud de la fibra de colágeno se calcula finalmente como L0/Lf. Siguiendo el protocolo que acabamos de mostrar, se identificó la parte más ancha de la arteria y en este punto se escaneó la arteria mediante microscopía de fluorescencia sin marcaje para medir el diámetro máximo del vaso y el grosor de la pared del vaso.

Utilizando un objetivo de mayor aumento a alta apertura numérica, no solo se puede medir el diámetro del vaso y el grosor de la pared, sino también las microarquitecturas de colágeno y elastina. Las microarquitecturas de los ángulos de ramificación de la fibra de elastina y la rectitud del colágeno se pueden determinar en secciones de imagen consecutivas utilizando el software de análisis de imágenes adecuado. Esto permite un análisis directo de la relación entre los cambios inducidos por la presión en las microarquitecturas del colágeno y la elastina y el módulo elástico incremental a diferentes presiones.

Siguiendo este procedimiento, también se puede extraer otra información de las imágenes. Esto podría ser los ángeles de orientación del colágeno adventicio a lo largo del eje longitudinal del vaso o podría ser la microarquitectura de la matriz extracelular en la túnica media. Las medidas cuantitativas extraídas de las imágenes utilizando este método se pueden introducir en modelos matemáticos para dilucidar cómo la circulación humana sana y la fallecida responden a diferentes condiciones.

Después de ver este video, debe tener una comprensión profunda de cómo diseñar sus experimentos de imágenes y el posterior análisis de imágenes para extraer información sobre cómo la presión induce cambios en la microarquitectura de la pared arterial de resistencia. Recuerde que debe evitar cualquier exposición a la luz visible e invisible cuando trabaje con microscopía de fluorescencia por excitación de dos fotones.