Asamblea y purificación del prototipo Virus espumoso de los Intasomes

El objetivo general de este procedimiento es ensamblar y purificar prototipos de intasomas de virus espumosos que luego se puedan utilizar para estudios bioquímicos, estructurales y cinéticos. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la retrovirología, como la mecánica y la dinámica de la integración. La principal ventaja de esta técnica es que permite el aislamiento de complejos de integración en lugar de una mezcla heterogénea de especies.

La demostración visual de este método es beneficiosa, ya que la recuperación y la solubilización de los complejos de integración son fundamentales para garantizar un rendimiento óptimo del intasoma. Para empezar, combine el tampón 1XTEN, 10 oligo-1 micromolares y 10 oligo-2 micromolares en un volumen final de 1,5 mililitros. A continuación, se alicucuentan 25 microlitros de la mezcla en 60 tubos de reacción de cambio de polimerasa de 0,2 mililitros.

Recocer el ADN usando un termociclador con los tiempos y temperaturas enumerados en el protocolo de texto. Después de la reacción, combine las reacciones de recocido de los 60 tubos. A continuación, cargue 500 microlitros de dos unidades de concentración de filtro ultracentrífugo de corte de peso molecular de 0,5 mililitros y tres kilodalton.

Concentrar el ADN viral recocido por centrifugación en una microcentrífuga a 14.000 veces por g durante 10 minutos a temperatura ambiente. Después de desechar el flujo, agregue 250 microlitros del ADN viral recocido restante a cada unidad de filtro. Repita el centrifugado hasta que queden aproximadamente 50 microlitros y deseche el flujo.

A continuación, el insecto intercambia la muestra en tampón TE lavándola tres veces con 450 microlitros de TE. Después del cambio de tampón, invierta la unidad de filtro y gire a 1000 veces g durante dos minutos a temperatura ambiente. El volumen final retenido para cada unidad de filtrado debe ser de aproximadamente 50 microlitros. Combine los retenidos y transfiéralos a un tubo con tapón de rosca de 1,5 mililitros.

Finalmente, mida la absorbencia ultravioleta de 260 nanómetros del ADN viral para calcular la concentración de ADN. Para ensamblar los intasomas, combine 50 milimolares de propano bis-tris pH 7.5, 500 milimolares de cloruro de sodio, 120 micromolares PFV integrasa y 50 micromolares de ADN viral en un volumen total de 150 microlitros. Limpie un tubo de diálisis de corte de peso molecular de 10 centímetros de largo de 10 milímetros de diámetro y seis a ocho kilodalton y los clips asociados con agua destilada doble o agua de la más alta pureza disponible.

Sujete un extremo del tubo, enjuague el interior del tubo de diálisis tres veces con uno o dos milímetros de tampón de enjuague. Retire la mayor cantidad posible de tampón de enjuague con la pipeta y la punta de carga de gel fino. A continuación, transfiera el conjunto del intasoma al tubo de diálisis con la pipeta y una punta de carga de gel fina.

Asegúrese de que el conjunto se expulse directamente en la parte inferior del tubo de diálisis. Sujete el extremo abierto del tubo de diálisis para minimizar la cantidad de aire introducido dentro del tubo. A continuación, coloque el tubo en el tampón de diálisis.

Diálisis durante la noche con movimientos suaves para que el tubo gire pero no esté en un vórtice. Asegúrese de que el tubo de diálisis esté sumergido y móvil. Después de aproximadamente una hora, el precipitado debe ser visible dentro de la tubería.

Prepare dos puntas de pipeta de diámetro ancho retirando de dos a cuatro mililitros del extremo de una punta de 200 microlitros con una nueva hoja de afeitar o bisturí sobre una superficie limpia. Retire el tubo de diálisis del tampón de diálisis. Para evitar la dilución de la muestra de intasoma con tampón de diálisis que pueda quedar en el extremo del tubo cerca del clip, utilice una micropipeta con una punta de pipeta pequeña para eliminar cualquier exceso de tampón de diálisis.

Retire el clip de este extremo del tubo de diálisis. Al recuperar el ensamblaje, es importante recolectar la mayor cantidad posible de solución y precipitado. Utilice la punta de propette de diámetro ancho para transferir la muestra, incluido el precipitado, dentro del tubo de diálisis, a un tubo de 1,5 mililitros en hielo.

Anote el volumen total del material recuperado. El volumen total suele ser de aproximadamente 140 microlitros. La muestra con precipitado está a 200 milimolares de cloruro de sodio.

Aumente la sal hasta una concentración final de cloruro de sodio de 320 milimolares añadiendo el volumen adecuado de una solución de cloruro de sodio de cinco molares de caldo. Transfiera la cubitera con la muestra a una cámara frigorífica de cuatro grados centígrados. Utilice la punta de pipeta de diámetro ancho para volver a suspender y solubilizar el precipitado mediante pipeteo.

Repita cada 20 minutos durante al menos una hora. La mayor parte del precipitado debe ir a la solución. Para purificar el intosoma, equilibre una columna de cromatografía de exclusión por tamaño de agarosa reticulada o una columna SEC con tampón de funcionamiento SEC a un caudal de 0,4 mililitros por minuto.

Centrifugar la muestra de intasoma en un microfugo a 14.000 veces g durante 10 minutos a cuatro grados centígrados para granular cualquier precipitado restante. Después de retirar cuidadosamente el sobrenadante, cárguelo en un circuito de inyección de 200 microlitros. Aplique el ejemplo a la columna SEC.

Eluir con 25 mililitros de tampón de funcionamiento SEC y recoger 95 fracciones de 270 microlitros. Observe que el cromatograma SEC muestra tres picos A280 y A260. Combine dos microlitros de cada fracción pico del intasoma, en 50 nanogramos, de ADN plasmático superenrollado de tres kilobases en tampón de reacción en un volumen de reacción final de 15 microlitros.

También se incluye un control negativo sin intasoma PFV añadido. Incubar a 37 grados centígrados durante cinco minutos. Detenga la reacción con 0,75 microlitros de proteinasa K y 0,75 microlitros de SDS.

A continuación, incubar la muestra a 55 grados centígrados durante una hora. A continuación, agregue tres microlitros de glicerol al 50 por ciento a cada reacción de integración. Cargue todo el volumen de reacción a un uno por ciento de peso por volumen de gel de agarosa.

Además, cargue un microlitro de marcador de tamaño de ADN de 10 kilobases en los carriles a ambos lados de las muestras. En un carril exterior, cargue seis microlitros de tinte G naranja. Pasa el gel a voltaje constante, 10 voltios por centímetro, a temperatura ambiente durante una hora, o hasta que el frente del tinte naranja G llegue al final del gel.

Visualice inmediatamente el gel de agarosa con un escáner fluorescente configurado para detectar bromuro de etidio. Esta imagen debería mostrar la integración concertada como una banda que corre fiel al tamaño a tres kilobases. Después de cuantificar las bandas en cada carril con un software de imágenes, seleccione las fracciones que tienen la actividad de integración más concertada.

Distribuya cada fracción en alícuotas de cinco microlitros. Finalmente, congele las alícuotas en nitrógeno líquido antes de almacenarlas a menos 80 grados centígrados. Se muestra un cromatograma representativo de una purificación de ensamblaje de intasoma PFV.

Se ven tres picos. El pico central se correlaciona con los intasomas ensamblados correctamente. Se muestra la eficiencia de integración como una fracción desde el pico de cromatografía central.

Los intasomas se probaron para la actividad sin y con congelación y descongelación. La congelación y descongelación no mostraron diferencias en el gel de agraosa teñido con bromuro de etidio de los productos de la reacción de integración. En este caso, se indican los productos de integración superenrollada, los productos de integración a media vista y el ADN viral sin reaccionar.

La cuantificación de la eficiencia de integración a partir de la imagen de bromuro de etidio también confirma que no hay pérdida de actividad de integración después de la congelación y descongelación. Esto permite el almacenamiento a largo plazo. La molécula de etiqueta y la posición afectan la eficiencia del ensamblaje del intasoma.

Los intasomas sin etiquetar y una etiqueta Cy5 interna muestran una eficiencia de ensamblaje equivalente. Sin embargo, la etiqueta final Cy5 o biotina reduce la eficiencia del montaje. Una vez dominada, esta técnica se puede realizar en dos días si se realiza correctamente.

Siguiendo este procedimiento, se pueden realizar otros métodos, como ensayos bioquímicos y de moléculas individuales, para responder a preguntas adicionales sobre la integración, la cinética y la dinámica. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo ensamblar, purificar y evaluar funcionalmente los intasomas PFV.