Name: Asamblea y purificación del prototipo Virus espumoso de los Intasomes (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-03-19T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 20 s
Description: Aprende a ensamblar y purificar intasomas del virus espumoso prototipo para estudios bioquímicos y estructurales en retrovirología. Este método permite aislar complejos de integración con alta pureza.

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Este trabajo fue apoyado por NIH AI099854 y AI126742 a la clave.

1. recocido de vDNA
<ol><li>Combinar 1 X Buffer 10 (10 X 10 stock: 100 mM Tris-HCl, pH 8,0, 1 M NaCl, 10 mM EDTA), 10 μm 1 Oligo (5' ATTGTCATGGAATTTTGTATATTGAGTGGCGCCCGAACAG 3', 100 acciones μm) y 10 μm 2 Oligo (5' CTGTTCGGGCGCCACTCAATATACAAAATTCCATGACA 3', 100 acciones μm) en un volumen final de 1.5 mL . Alícuota de 25 μL en tubos de reacción en cadena (PCR) de 0.2 mL polimerasa sesenta. Nota: Dependiendo de la aplicación, oligómeros pueden modificarse con fluoróforos o etiquetas en el extremo 5'-2 Oligo o como un interno amino-T 13 base desde el extremo 5' de Oligo 1. Oligómeros modificados deben ser purificados por cromatografía líquida de alto rendimiento (HPLC) antes del recocido. Hemos encontrado que 5'-end Cy3 o Cy5 fluoróforo etiquetado de Oligo 2 reduce la eficacia de la Asamblea de intasome 10 veces. Fluoróforo interno etiquetado no reduce la eficiencia de montaje.</li>
	<li>Recueza utilizando un termociclador con los siguientes tiempos y temperaturas: 1 ciclo a 94.0 ° c 3 min, 99 ciclos en (94.0 ° c 1 min, ° c 93,6 1 min) disminuyendo ambas temperaturas por 0,8 ° c por ciclo (el último ciclo es de 14,8 ° c 1 min, 14,4 ° c 1 min) y conservarlo a 4.0 ° c.</li>
	<li>Se combinan las reacciones recocidas de sesenta todos los tubos. Carga de 500 μl a dos 0.5 mL 3 kDa peso molecular límite (MWCO) filtro ultracentrífugo concentración unidades. El recocido vDNA se concentran mediante centrifugación en una microcentrífuga a 14.000 x g por 10 min a temperatura ambiente (RT). Nota: El volumen retenido debe ser ~ 50 μL en cada unidad de concentración.</li>
	<li>Deseche el flujo a través. Añadir 250 μl de la restante vDNA recocido a cada unidad de filtro. Repetir la vuelta y desechar el flujo a través. De búfer lavándola tres veces con 450 μl TE intercambio en buffer TE (10 mM Tris-HCl, pH 8.0, 1 mM EDTA).</li>
	<li>Invierta la unidad de filtrado y centrifugado a 1.000 x g durante 2 min a TA. El volumen retenido final para cada unidad de filtro debe ser ~ 50 μl. combinar el retentates y transfiéralo a un tubo de tapón de rosca de 1.5 mL.</li>
	<li>Medir la absorbancia de 260 nm ultravioleta (UV) de la vDNA. Utilice este valor para calcular la concentración molar final de la DNA. El coeficiente de extinción (ε260) de este vDNA es 622.803 cm-1 M-1 y su peso molecular es 23.972 da. tienda a-20 ° c.</li>
</ol>2. Intasome Asamblea
<ol><li>Si es posible, realizar la Asamblea de intasome en una pequeña habitación con un termostato variable. Ajuste el termostato entre 18-22 grados centígrados. Nota: En nuestra experiencia, montaje de intasome a 4 ° c es ineficiente.</li>
	<li>Preparar 1 L de tampón de diálisis (Bis-tris propano de 20 mM, pH 7,5, 200 mM NaCl, 2 mM Ditiotreitol (DTT), 25 μm vivencias2) en un vaso de precipitados de 2 L con una barra de agitación en una placa de agitación. Equilibrar el búfer en la sala de 18-22 ° c durante al menos 6 h.</li>
	<li>Para montar el intasomes, combinan propano 50 mM Bis-tris, pH 7,5, 500 mM NaCl, 120 μm en PFV y 50 μm vDNA en un volumen total de 150 μL. Nota: El en PFV debe estar libre de contaminantes actividad nucleasa de7,8. Si la concentración de PFV es demasiado diluida para dar cabida a 120 μm IN en volumen de 150 μL, entonces es posible aumentar el volumen final a 200 μl. Los factores críticos de este paso son para mantener la proporción molar de IN a vDNA (2.4:1) y tener suficiente complejo visualizar durante la cromatografía.</li>
	<li>Limpiar un pedazo largo de ~ 10 cm de tubo de diálisis de 10 mm 6-8 kDa MWCO y clips con agua bidestilada (ddH2O), o agua de pureza más alto disponible. Clip de uno de los extremos de la tubería. Nota: La tubería de la diálisis debe manejarse con cuidado para evitar cualquier posible contaminación del espacio lab.</li>
	<li>Tomar 15 mL de solución de enjuague de tubo de diálisis (propano 50 mM Bis-tris, pH 7,5, 500 mM NaCl). Enjuague el interior de la tubería de la diálisis tres veces con 1-2 mL de tampón de enjuague. Eliminar gran parte de la solución de enjuague como sea posible con una pipeta y gel fina punta de carga.</li>
	<li>Si es necesario, use una limpia hoja de afeitar o bisturí para cortar el tubo de diálisis de forma que una carga de gel fina punta puede alcanzar el extremo de la tubería.</li>
	<li>Transferir el conjunto de intasome de paso 2.3 a la tubería de la diálisis con una pipeta y un gel fino carga punta. Enganche el extremo abierto del tubo de diálisis, minimizando la cantidad de aire introducido en el tubo. Coloque el tubo en el buffer de diálisis.</li>
	<li>Dializarse durante la noche (16-20 h) con agitación suave para que el tubo gira, pero no es en un vórtice. Asegúrese que el tubo de diálisis sumergida y móviles. Después de aproximadamente una hora, observar un precipitado visible dentro de la tubería. Nota: Con Cy3 y Cy5 fluorescencia etiquetada vDNA el precipitado es más obvio. Esto es cierto para finalizar etiquetado e internamente etiquetado vDNA fluorescente.</li>
</ol>3. Intasome solubilización
<ol><li>Preparar dos alesaje ancho puntas de pipeta mediante la eliminación de 2-4 mm del extremo de una punta de 200 μL con una cuchilla de afeitar o bisturí nuevo sobre una superficie limpia. Nota: Las puntas se utilizará en el paso 3.3 y 3.5.</li>
	<li>Quite los tubos de diálisis desde el buffer de diálisis. Con el fin de evitar la dilución de la muestra intasome con buffer de diálisis que puede permanecer en el extremo de la tubería cerca del clip, utilice una micropipeta con una pequeña pipeta para quitar cualquier buffer de diálisis exceso. Retire el clip de uno de los extremos de la tubería de la diálisis.</li>
	<li>Uso una amplia agujereada pipeta de paso 3.1 para transferir la muestra incluyendo el precipitado dentro de la tubería de la diálisis a un tubo de 1,5 mL en hielo. Tenga en cuenta el volumen total del material recuperado; el volumen total es típicamente ~ 140 μl.</li>
	<li>La muestra con precipitado es a 200 mM de NaCl; aumentar la sal a una concentración final de 320 mM de NaCl añadiendo el volumen adecuado de una solución de NaCl de 5 M madre. Por ejemplo, para una muestra de 150 μL, añadir μl 3,9 5 M NaCl y 1,1 μl ddH2O para un volumen final de 155 μl. transferencia de cubo de hielo con la muestra en una cámara fría de 4 ° c.</li>
	<li>Uso una amplia agujereada pipeta de paso 3.1 a suspender y solubilizar el precipitado mediante pipeteo. Repetir cada 20 min para por lo menos 1 h. Observe que la mayor parte del precipitado en solución. Nota: Pipeteo para Resuspender el precipitado puede suspenderse cuando es evidente que el precipitado no perceptiblemente se reduce entre puntos de tiempo. Cuando vDNA internamente es indicado o no está etiquetado, el precipitado se reduce por el ~ 90% basado en la inspección visual. En el caso de Cy5 final etiquetado vDNA, el precipitado se reduce sólo ~ 20%; la mayor parte del precipitado con el fluoróforo final etiquetado vDNA no se solubilizan. La cantidad de precipitado que efectivamente es solubilizado es variable y debe determinarse empíricamente.</li>
</ol>4. Intasome purificación
<ol><li>Preparar 250 mL de cromatografía por exclusión de tamaño (SEC) funcionamiento tampón (propano 20 mM Bis-tris, pH 7,5, 320 mM NaCl, 10% glicerol). Filtro estéril el buffer con un 0.2 μm filtro unidad y almacenar a 4 ° c. Nota: Todos los pasos de purificación se realizan en una cámara fría de 4 ° c.</li>
	<li>Equilibrar una columna de agarosa reticulado SEC (diámetro = 10 mm; longitud = 300 mm, volumen de la cama = 24 mL, volumen de muestra = 25-500 μl; presión máxima = 1,5 MPa, límite de exclusión = 4 x 107 Da; separa pesos moleculares entre 5.000 y 5 kDa, ver la de la estera de tabla erials) con el almacenador intermediario corriente seg con un caudal de 0,4 mL/min. Nota: Esta purificación puede adaptarse a columnas de exclusión de diverso tamaño si son capaces de separar eficazmente 300 kDa de 44 kDa, como Superose 12 10/300 GL Superose 6 aumentar. Superose 12 10/300 GL tiene menor resolución, llevando a más superposición de picos. Por el contrario, Superose 6 aumentar ofrece mayor resolución y mejor separación.</li>
	<li>Centrifugue la muestra de intasome en una microcentrífuga a 14.000 x g durante 10 min a 4 ° c a cualquier precipitado restante de pellets. Retire con cuidado el sobrenadante. Cargar el sobrenadante a un bucle de inyección de 200 μl (tubería que puede contener ~ 200 μL). Aplicar la muestra a la columna de seg. Nota: Volúmenes más pequeños de la carga permiten una mayor resolución de la SEC.</li>
	<li>Eluir con 25 mL seg funcionando del almacenador intermediario y cobrar 95 fracciones de 270 μl. observar que el cromatograma de la SEC muestra picos de260 A280/A (figura 1) tres. Nota: La primera debe ser un agregado (~9.0 - elución mL 11,5), seguido de la PFV tetrámero intasome pico (~12.0 - elución mL 14,75) y monómero en PFV con pico vDNA libre (~15.0 - 18,0 mL).</li>
</ol>5. integración del filamento transferencia ensayo, selección de la fracción y almacenamiento
<ol><li>Combinar 2 μl de cada fracción de pico intasome y 50 ng superenrollado 3 kb ADN plásmido (stock concentración es de 50 ng/μL) en buffer de reacción (gas propano 10 mM Bis-tris, pH 7,5, 110 mM NaCl, 5 mM MgSO4, 4 μm vivencias2, 10 mM DTT) en un volumen de reacción final de 15 μl. Incubar a 37 ° c durante 5 minutos.</li>
	<li>Incluir un control negativo con ningún agregado intasome PFV. Detener la reacción con proteinasa μl 0.75 K (20 mg/mL de solución stock) y 0,75 μl SDS (solución stock al 10%). Incubar a 55 ° c para las muestras de la tienda 1 h. según sea necesario en-20 ° c para posteriores análisis. Nota: Este ensayo es una evaluación cualitativa de la actividad de integración. Antes este análisis no es determinar la concentración molar de intasome de cada fracción. Fracciones incluidas en el análisis de transferencia de cadena de integración pueden ser almacenados en hielo (incluido el almacenamiento durante la noche) hasta integración actividad es confirmada y las fracciones alícuotas. Aquí utilizamos pMP2, un derivado de pUC199. Hemos utilizado también con éxito el 5,4 kb plásmido pcDNA 3.1. Cualquier plásmido que puede resolverse a relajado círculo, lineal, y superenrolladas formas pueden utilizarse como un objetivo de integración.</li>
	<li>Preparar un peso de 1% de 120 mL por gel de agarosa de volumen (p/v) en tampón de TAE X 1 (40 mM Tris acetato, EDTA 1 mM) con 0,1 μg/mL etidio bromuro (EtBr, solución stock de 10 mg/mL)10. La solución de agarosa del derretimiento y vierta en una bandeja de fundición de gel de 15 cm x 10 cm. Inserte un peine de 15 pozos con 5 mm ancho, 0,75 mm espesor pozos. Nota: Pozos de menos rendimiento mejor resolución de banda en comparación con los pozos de espesor 1,5 mm.</li>
	<li>Permita que el gel se solidifique a temperatura ambiente. Sumergir el gel en 1 X TAE con EtBr de 0.1 μg/mL.</li>
	<li>Agregar 3 μl 50% de glicerol a cada reacción de integración del paso 5.2. El volumen de reacción todo el gel de la carga. Carga 1 μl del marcador de tamaño de DNA de 10 kb (concentración stock de 150 ng/μL) a carriles a ambos lados de las muestras; en otras palabras, el marcador del tamaño de ADN debe flanquean las calles de la muestra.</li>
	<li>En un carril exterior, carga tinte de G anaranjado de 6 μl (0,25% naranja G, glicerol 30%). Correr el gel a tensión constante, 10 V/cm (100 V) a temperatura ambiente durante 1 hora o hasta que el frente de tinte naranja G llega al final del gel.</li>
	<li>Inmediatamente la imagen del gel de agarosa con un analizador fluorescente para detectar EtBr (532 nm excitación, filtro de emisión de 610 nm). Si se utilizaron fluoróforo con la etiqueta vDNAs, también imagen con ajustes de fluoróforo adecuado. Nota: por ejemplo detectar Cy5 etiquetado ADN, imagen con 633 nm excitación y filtros de emisión de 670 nm. Productos de integración concertada (CI, ADN lineal) deben ejecutar tallaje a ~ 3 kb plásmido superenrollado (SC) debe correr más rápido (~ 2 kb) y productos de integración de media página (HSI, círculo relajado DNA) deben ejecutar más lento (~3.5 kb). VDNA debe ejecutarse tallaje en ~ 40 bp.</li>
	<li>Cuantificar las bandas en cada carril con proyección de imagen de software7. Calcular la fracción de ADN en cada carril CI, HSI o SC; vDNA no está incluido en este cálculo. Nota: Eficiencia de la integración o la fracción de SC convertida en un producto lineal, se calculó dividiendo el volumen de píxeles de productos de integración concertada (IC) por el volumen total de píxeles de tres bandas (HSI + CI + SC). Si intasomes son fluoróforo con la etiqueta, los productos de HSI y CI pueden cuantificarse por fluorescencia.</li>
	<li>Seleccione fracciones que tienen la actividad de integración más concertada. Nota: En nuestra experiencia, la actividad de integración concertada de pico coincide con el pico de la proteína identificado como intasomes PFV tetramérica. Mida A280 de cada una de estas fracciones y calcular la concentración final de intasome. Ε280 por un tetrámero de tipo salvaje en PFV con dos vDNAs descrito aquí es 908.339 cm-1M-1 y el peso molecular es 225,5 kDa. Las concentraciones deben seguir el mismo patrón como el pico del cromatograma de SEC y en el análisis de transferencia de cadena.</li>
	<li>Distribuir cada fracción en 5 alícuotas μl y snap congelar en nitrógeno líquido. Guardar alícuotas a-80 ° c. Fracciones seleccionadas para el almacenamiento son típicamente entre 200-600 nM.</li>
</ol>

<ol><li>Coffin, J. M., Hughes, S. H., Varmus, H. E. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aCoffin%2C+JM+%22Retroviruses%22">Retroviruses</a>. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. (1997).</li>
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<li>Lopez, M. A., Mackler, R. M., Yoder, K. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Removal+of+nuclease+contamination+during+purification+of+recombinant+prototype+foamy+virus+integrase%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol+Methods%22%5BJournal%5D)">Removal of nuclease contamination during purification of recombinant prototype foamy virus integrase.</a> J Virol Methods. 235, 134-138 (2016).</li>
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<li>Ballandras-Colas, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cryo-EM+reveals+a+novel+octameric+integrase+structure+for+betaretroviral+intasome+function%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Cryo-EM reveals a novel octameric integrase structure for betaretroviral intasome function.</a> Nature. 530 (7590), 358-361 (2016).</li>
<li>Ballandras-Colas, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+supramolecular+assembly+mediates+lentiviral+DNA+integration%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">A supramolecular assembly mediates lentiviral DNA integration.</a> Science. 355 (6320), 93-95 (2017).</li>
<li>Passos, D. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cryo-EM+structures+and+atomic+model+of+the+HIV-1+strand+transfer+complex+intasome%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Cryo-EM structures and atomic model of the HIV-1 strand transfer complex intasome.</a> Science. 355 (6320), 89-92 (2017).</li>
<li>Yin, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crystal+structure+of+the+Rous+sarcoma+virus+intasome%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Crystal structure of the Rous sarcoma virus intasome.</a> Nature. 530 (7590), 362-366 (2016).</li>
<li>Maertens, G. N., Hare, S., Cherepanov, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mechanism+of+retroviral+integration+from+X-ray+structures+of+its+key+intermediates%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The mechanism of retroviral integration from X-ray structures of its key intermediates.</a> Nature. 468 (7321), 326-329 (2010).</li>
<li>Maskell, D. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+basis+for+retroviral+integration+into+nucleosomes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Structural basis for retroviral integration into nucleosomes.</a> Nature. 523 (7560), 366-369 (2015).</li>
</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

Retroviral INs forman un complejo con DNA genómica viral para realizar integración y continuar el ciclo de vida viral multimérica. El número de monómeros por intasome puede ser tetrámeros, octamers o posiblemente mayor orden Multímeros11,12,13,14. Intasomes PFV son un tetrámero de recombinante con oligómeros de ADN bicatenario que imitan la DNA genomic viral termina3...

Integración del genoma viral en el genoma del anfitrión es un paso obligatorio en el ciclo de vida de todos los retrovirus1. La enzima viral integrasa (IN) cataliza la unión covalente de los extremos del genoma viral de la DNA al anfitrión DNA. Durante una infección celular, en forma parte de un complejo de pre-integración que media integración. Recombinante en complexed con oligómeros de ADN de doble trenzados mímico los extremos del ADN virales también puede realizar la integración en un ADN en vitrode objetivo2. Un común integración análisis en vitro utiliza un plásmido superenrollado como el ADN diana. Integración de ambos oligómeros de ADN virales (vDNA) para el plásmido da lugar a un producto lineal y se denomina integración concertada (figura 2A). La integración análisis de vitro también se pueden producir productos con sólo un vDNA covalentemente unido al plásmido de blanco dando como resultado un círculo relajado. Este producto de la integración de medio sitio parece ser un artefacto del ensayo in vitro.
Recombinante en y vDNA pueden realizar integración en vitro, pero no son reactivos ideal para el estudio de la dinámica o estructura de los complejos de integración cuando IN monomérica oscurecería visualización pertinente. Complejos de integración purificado, o "intasomes," son necesarios para estudios de análisis o estructural dinámico a la sola molécula. EN PFV y vDNAs puede ser montada por diálisis de un búfer relativamente alta concentración de sal a una baja concentración de sal3,4. Durante la diálisis, un precipitado formas. Este precipitado se elimina de la diálisis y se aumenta la concentración de sal. La mayor concentración de sal solubiliza el precipitado que contiene intasomes PFV. El intasomes entonces se purifican por cromatografía por exclusión de tamaño (SEC). Prototipo recombinante virus espumoso (PFV) IN se ha demostrado que existe como monómero en solución a concentraciones de hasta 225 μm5. Fraccionamiento s efectivamente separa la intasomes PFV (225,5 kDa), que incluye un tetrámero en PFV y dos vDNAs, PFV monomérica en (44,4 kDa) y vDNA gratis (24.0 kDa). La intasomes PFV pueden congelar y conservar actividad de integración para al menos seis meses de almacenamiento a-80 ° c.
Recombinante intasomes PFV también puede ser modificada para incluir en las substituciones del aminoácido o mutaciones de truncamiento o vDNAs con fluoróforos o biotina4,6. Las intasomes PFV purificados fácilmente realizar integración en un objetivo de plásmido superenrollado ADN en vitro. Ensayos de integración bioquímica a granel con intasomes pueden probar los efectos de en mutaciones, inhibidores, o otros aditivos químicos. Biotinilado intasomes puede utilizarse para sonda afinidad con proteínas o ácidos nucleicos. Intasomes PFV funcionan a temperatura ambiente permitiendo análisis de microscopia sola molécula por pinza magnética para medir el tiempo entre la Unión de los dos extremos de vDNA o fluorescencia de la reflexión interna total para visualizar la búsqueda intasome en blanco De ADN6. Además, PFV intasomes fueron los primeros en ser estructuralmente caracterizan impactando significativamente el campo de la integración retroviral3.

<table><tbody><tr><td>Oligómeros de ADN</td><td>IDT N</td><td>/A</td><td>Oligos de ADN personalizados</td></tr><tr><td>Tris Ultra Pure</td><td>Gojira Fine Chemicals</td><td>UTS1003</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td></td><td>P212121 RP-S23020</td><td></td></tr><tr><td>UltraPure EDTA</td><td>Invitrogen/Gibco</td><td>15575</td><td></td></tr><tr><td>Amicon Ultra 0.5 mL filtros centrífugos</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z677094-24EA</td><td>3 kDa MWCO</td></tr><tr><td>TDT</td><td>P212121</td><td>propano SV-DTT</td><td></td></tr><tr><td>BIS-TRIS, >=99,0% (valoración)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B6755-500G</td><td></td></tr><tr><td>ZnCl2</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>208086</td><td></td></tr><tr><td>MgSO4</td><td>Amresco</td><td>0662</td><td></td></tr><tr><td>Glycerol</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>G37-20</td><td></td></tr><tr><td>Puntas de carga de gel, 1 - 200 &mu; L</td><td>Corning</td><td>CLS4853-400EA</td><td></td></tr><tr><td>Hoja de afeitar; De un solo filo; 100/paquete; Paquete de 100 unidades de</td> filtro desechables <td>estériles Fisher Scientific</td><td>12-640</td><td></td></tr><tr><td>con membrana PES > 250 ml</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>568-0020</td><td></td></tr><tr><td>Pinzas para tubos de diálisis</td><td>Spectrum Labs</td><td>132734</td><td></td></tr><tr><td>6-8 kDa 10 mm Tubo de diálisis</td><td>Spectrum Medical</td><td>132645</td><td></td></tr><tr><td>Superose 6 10/300 GL</td><td>GE Healthcare Ciencias de la Vida 17517201</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Estándar de alta resolución Agarosa</td><td>AGTC Bioproducts</td><td>AG500D1</td><td></td></tr><tr><td>Bromuro de etidio</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>BP1302</td><td></td></tr><tr><td>Naranja G</td><td>Fisher Scientific 0-267</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Hyladder 10kb, 500 carriles</td><td>Denville Scientific</td><td>CB4225-4</td><td></td></tr></tbody></table>

asamblea y purificación del prototipo virus espumoso de los intasomes

Assembly and Purification of Prototype Foamy Virus Intasomes

A definición de función y paso necesario del ciclo de vida de retrovirus es la integración del genoma viral en el genoma del anfitrión. Los retrovirus codifican enzima integrasa (IN) que cataliza la unión covalente de viral a anfitrión DNA, que se conoce como transferencia de cadena. Integración puede ser modelada en vitro con IN retrovirus recombinante y oligómeros de ADN mímico los extremos del genoma viral. Con el fin de recapitular más de cerca la reacción de integración que se presenta en vivo, integración complejos son ensamblados de oligómeros sintéticos y recombinante IN por diálisis en un tampón de menor concentración de sal. La integración compleja, llamada un intasome, puede ser purificada por cromatografía por exclusión de tamaño. En el caso de virus espumoso de los prototipos (PFV), el intasome es un tetrámero de IN y oligómeros de ADN dos y se separa fácilmente en monomérica y oligómero gratuito ADN. La eficacia de la integración de intasomes PFV puede ensayarse bajo una variedad de condiciones experimentales para comprender mejor la dinámica y la mecánica de integración retroviral.

Intasomes PFV son ensamblados de IN recombinante y vDNA. Después del montaje, intasomes son purificadas por segundos (figura 1). Actividad de integración de cada fracción se ensayaron con un superenrollado ADN blanco y agarosa electroforesis en gel (figura 2). Este gel es reflejado con un analizador fluorescente para detectar EtBr (y fluoróforo, si se utiliza el fluoróforo vDNA). Usando software de análisis de imagen, volúmenes d...

Integrasa de retrovirus recombinante y oligómeros de ADN mímico extremos de DNA virales pueden formar un complejo enzimático activo conocido como un intasome. Intasomes puede ser usada para estudios bioquímicos, estructurales y cinéticos. Este protocolo detalla cómo montar y purificar el prototipo virus espumoso de los intasomes.

Asamblea y purificación del prototipo Virus espumoso de los Intasomes

A defining feature and necessary step of the retrovirus life cycle is the integration of the viral genome into the host genome. All retroviruses encode an ...

El objetivo general de este procedimiento es ensamblar y purificar prototipos de intasomas de virus espumosos que luego se puedan utilizar para estudios bioquímicos, estructurales y cinéticos. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la retrovirología, como la mecánica y la dinámica de la integración. La principal ventaja de esta técnica es que permite el aislamiento de complejos de integración en lugar de una mezcla heterogénea de especies.La demostración visual de este método es beneficiosa, ya que la recuperación y la solubilización de los complejos de integración son fundamentales para garantizar un rendimiento óptimo del intasoma. Para empezar, combine el tampón 1XTEN, 10 oligo-1 micromolares y 10 oligo-2 micromolares en un volumen final de 1,5 mililitros. A continuación, se alicucuentan 25 microlitros de la mezcla en 60 tubos de reacción de cambio de polimerasa de 0,2 mililitros.Recocer el ADN usando un termociclador con los tiempos y temperaturas enumerados en el protocolo de texto. Después de la reacción, combine las reacciones de recocido de los 60 tubos. A continuación, cargue 500 microlitros de dos unidades de concentración de filtro ultracentrífugo de corte de peso molecular de 0,5 mililitros y tres kilodalton.Concentrar el ADN viral recocido por centrifugación en una microcentrífuga a 14.000 veces por g durante 10 minutos a temperatura ambiente. Después de desechar el flujo, agregue 250 microlitros del ADN viral recocido restante a cada unidad de filtro. Repita el centrifugado hasta que queden aproximadamente 50 microlitros y deseche el flujo.A continuación, el insecto intercambia la muestra en tampón TE lavándola tres veces con 450 microlitros de TE. Después del cambio de tampón, invierta la unidad de filtro y gire a 1000 veces g durante dos minutos a temperatura ambiente. El volumen final retenido para cada unidad de filtrado debe ser de aproximadamente 50 microlitros. Combine los retenidos y transfiéralos a un tubo con tapón de rosca de 1,5 mililitros.Finalmente, mida la absorbencia ultravioleta de 260 nanómetros del ADN viral para calcular la concentración de ADN. Para ensamblar los intasomas, combine 50 milimolares de propano bis-tris pH 7.5, 500 milimolares de cloruro de sodio, 120 micromolares PFV integrasa y 50 micromolares de ADN viral en un volumen total de 150 microlitros. Limpie un tubo de diálisis de corte de peso molecular de 10 centímetros de largo de 10 milímetros de diámetro y seis a ocho kilodalton y los clips asociados con agua destilada doble o agua de la más alta pureza disponible.Sujete un extremo del tubo, enjuague el interior del tubo de diálisis tres veces con uno o dos milímetros de tampón de enjuague. Retire la mayor cantidad posible de tampón de enjuague con la pipeta y la punta de carga de gel fino. A continuación, transfiera el conjunto del intasoma al tubo de diálisis con la pipeta y una punta de carga de gel fina.Asegúrese de que el conjunto se expulse directamente en la parte inferior del tubo de diálisis. Sujete el extremo abierto del tubo de diálisis para minimizar la cantidad de aire introducido dentro del tubo. A continuación, coloque el tubo en el tampón de diálisis.Diálisis durante la noche con movimientos suaves para que el tubo gire pero no esté en un vórtice. Asegúrese de que el tubo de diálisis esté sumergido y móvil. Después de aproximadamente una hora, el precipitado debe ser visible dentro de la tubería.Prepare dos puntas de pipeta de diámetro ancho retirando de dos a cuatro mililitros del extremo de una punta de 200 microlitros con una nueva hoja de afeitar o bisturí sobre una superficie limpia. Retire el tubo de diálisis del tampón de diálisis. Para evitar la dilución de la muestra de intasoma con tampón de diálisis que pueda quedar en el extremo del tubo cerca del clip, utilice una micropipeta con una punta de pipeta pequeña para eliminar cualquier exceso de tampón de diálisis.Retire el clip de este extremo del tubo de diálisis. Al recuperar el ensamblaje, es importante recolectar la mayor cantidad posible de solución y precipitado. Utilice la punta de propette de diámetro ancho para transferir la muestra, incluido el precipitado, dentro del tubo de diálisis, a un tubo de 1,5 mililitros en hielo.Anote el volumen total del material recuperado. El volumen total suele ser de aproximadamente 140 microlitros. La muestra con precipitado está a 200 milimolares de cloruro de sodio.Aumente la sal hasta una concentración final de cloruro de sodio de 320 milimolares añadiendo el volumen adecuado de una solución de cloruro de sodio de cinco molares de caldo. Transfiera la cubitera con la muestra a una cámara frigorífica de cuatro grados centígrados. Utilice la punta de pipeta de diámetro ancho para volver a suspender y solubilizar el precipitado mediante pipeteo.Repita cada 20 minutos durante al menos una hora. La mayor parte del precipitado debe ir a la solución. Para purificar el intosoma, equilibre una columna de cromatografía de exclusión por tamaño de agarosa reticulada o una columna SEC con tampón de funcionamiento SEC a un caudal de 0,4 mililitros por minuto.Centrifugar la muestra de intasoma en un microfugo a 14.000 veces g durante 10 minutos a cuatro grados centígrados para granular cualquier precipitado restante. Después de retirar cuidadosamente el sobrenadante, cárguelo en un circuito de inyección de 200 microlitros. Aplique el ejemplo a la columna SEC.Eluir con 25 mililitros de tampón de funcionamiento SEC y recoger 95 fracciones de 270 microlitros. Observe que el cromatograma SEC muestra tres picos A280 y A260. Combine dos microlitros de cada fracción pico del intasoma, en 50 nanogramos, de ADN plasmático superenrollado de tres kilobases en tampón de reacción en un volumen de reacción final de 15 microlitros.También se incluye un control negativo sin intasoma PFV añadido. Incubar a 37 grados centígrados durante cinco minutos. Detenga la reacción con 0,75 microlitros de proteinasa K y 0,75 microlitros de SDS.A continuación, incubar la muestra a 55 grados centígrados durante una hora. A continuación, agregue tres microlitros de glicerol al 50 por ciento a cada reacción de integración. Cargue todo el volumen de reacción a un uno por ciento de peso por volumen de gel de agarosa.Además, cargue un microlitro de marcador de tamaño de ADN de 10 kilobases en los carriles a ambos lados de las muestras. En un carril exterior, cargue seis microlitros de tinte G naranja. Pasa el gel a voltaje constante, 10 voltios por centímetro, a temperatura ambiente durante una hora, o hasta que el frente del tinte naranja G llegue al final del gel.Visualice inmediatamente el gel de agarosa con un escáner fluorescente configurado para detectar bromuro de etidio. Esta imagen debería mostrar la integración concertada como una banda que corre fiel al tamaño a tres kilobases. Después de cuantificar las bandas en cada carril con un software de imágenes, seleccione las fracciones que tienen la actividad de integración más concertada.Distribuya cada fracción en alícuotas de cinco microlitros. Finalmente, congele las alícuotas en nitrógeno líquido antes de almacenarlas a menos 80 grados centígrados. Se muestra un cromatograma representativo de una purificación de ensamblaje de intasoma PFV.Se ven tres picos. El pico central se correlaciona con los intasomas ensamblados correctamente. Se muestra la eficiencia de integración como una fracción desde el pico de cromatografía central.Los intasomas se probaron para la actividad sin y con congelación y descongelación. La congelación y descongelación no mostraron diferencias en el gel de agraosa teñido con bromuro de etidio de los productos de la reacción de integración. En este caso, se indican los productos de integración superenrollada, los productos de integración a media vista y el ADN viral sin reaccionar.La cuantificación de la eficiencia de integración a partir de la imagen de bromuro de etidio también confirma que no hay pérdida de actividad de integración después de la congelación y descongelación. Esto permite el almacenamiento a largo plazo. La molécula de etiqueta y la posición afectan la eficiencia del ensamblaje del intasoma.Los intasomas sin etiquetar y una etiqueta Cy5 interna muestran una eficiencia de ensamblaje equivalente. Sin embargo, la etiqueta final Cy5 o biotina reduce la eficiencia del montaje. Una vez dominada, esta técnica se puede realizar en dos días si se realiza correctamente.Siguiendo este procedimiento, se pueden realizar otros métodos, como ensayos bioquímicos y de moléculas individuales, para responder a preguntas adicionales sobre la integración, la cinética y la dinámica. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo ensamblar, purificar y evaluar funcionalmente los intasomas PFV.

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Asamblea y purificación del prototipo Virus espumoso de los Intasomes

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