Immunophenotyping de Orthotopic la homoplastia (Syngeneic) de Adenocarcinoma Ductal pancreática KPC primaria murinas por citometría de flujo

Este mensaje puede ayudar a responder preguntas clave en Inmunofenotipado en modelos Murine, como marcadores utilizados para identificar diferentes linajes de inmunidad y estrategias de envejecimiento. La principal ventaja de esta técnica es que el marcador y los estados de envejecimiento, al inmunofenotipado, se pueden aplicar a una variedad de modelos murinos. Monitoriza el peso corporal de los ratones C57 Black 6 usando un equilibrio.

Además, controlar el volumen tumoral de los ratones donantes variables del tumor por medición de calibre. Después de la eutanasia del animal en una capucha de riesgo biológico según el protocolo, esterilizar la piel alrededor del tumor utilizando hisopos de iodofor. Después de extirpar el tumor como se detalla en el protocolo de texto, coloque el tumor en una placa de petri que contenga 20 mililitros de PBS que haya sido pre-enfriado a 4 grados Celsius.

Si hay sangre contaminante, transfiera el tumor a otra placa de Petri y lave el tumor con PBS. Corta el tumor por la mitad. Retire cualquier piel, vasos, calcificación y necrosis adicionales.

Elija sólo piezas intactas de tumor y colóquelas en un tubo estéril de centrífuga de 50 mililitros. Añadir 20 mililitros de PBS antes de transportar el tubo a una sala de animales separada para estudios de farmacología. Para prepararse para la implantación ortotópica, fije un ratón completamente anestesiado en una placa de experimento en la posición lateral derecha.

Desinfectar la piel alrededor del bazo con idodine y luego des-yodinate con 75%alcohol etílico. Encuentra el punto medio del bazo y haz una incisión vertical de 1 centímetro en el abdomen para exponer el bazo. Suavemente, extraiga parte del tejido del páncreas debajo del bazo usando pinzas de punta planas.

Y pieza tumoral homoinjerto de ratón sutro del ratón C en el páncreas del ratón receptor por sutura quirúrgica bsorbible de 9-O. Cierre el abdomen con una sutura de seda 6-O por costura doble. Lograr la homeostasis por compresión.

Después de terminar la implantación del tumor, mantenga al animal en una jaula caliente mientras no se produzca sangrado o fuga de tejido tumoral. Monitorear al animal hasta que recupere la conciencia suficiente para mantener la recumbencia esternal. Devolver el animal a la habitación del animal después de la recuperación completa de la anestesia.

Monitoree los ratones que varían del tumor palpando el abdomen cerca del bazo y seleccione los ratones que tienen tumores ortotópicos. Para cada tumor, prepara un tubo C con tampón de digestión tumoral. Utilice 3 mililitros de tampón de digestión para fragmentos tumorales inferiores a 0,8 gramos para garantizar que el tumor se digiere por completo.

Etiquete el tumor con el código de estudio, el tumor, la identificación del ratón, el grupo de tratamiento y el peso del tumor. Recoge el tumor del ratón. Lave el tumor en PBS frío y limpie el tejido conectado al tumor.

Coloque el tumor en medios de digestión en un pozo de una placa estéril de 6 pozos. Sostenga el tumor en su lugar con pinzas estériles o fórceps y corte con un bisturí. Corta el tumor lo suficientemente bien como para romperse en trozos más pequeños.

Ahora, vuelva a colocar las piezas del tumor en el tubo C y use el tampón de digestión restante para lavar la placa. Transfiera el líquido al tubo C y colóquelo sobre hielo hasta la digestión. A continuación, encienda el disociador con calentadores.

Coloque el tubo C de disociación tumoral boca abajo en la manga de la posición vacante. Ajuste el estado de la posición del tubo de Libre a Seleccionado. Elija un programa de disociación seguido de la selección de la carpeta requerida donde se muestra la lista de programas.

Después de la terminación del programa, quite el tubo C del disociador y gire brevemente para paletr la muestra. Ahora, vuelva a suspender las muestras y colóquelas en un colador celular por encima de un tubo de 50 mililitros. Lave la célula a través del colador celular con 10 mililitros de tampón de lavado para proporcionar una suspensión de una sola célula.

Después de centrifugar el tubo a 300 G durante 5 minutos, deseche el sobrenadante y vuelva a suspender las células con 5 mililitros de tampón de lavado. Cuente las células viables y ajuste la concentración celular a 1 millón de células por tubo o por muestra. Realizar el diseño del panel inmune, inmunosuculción y fluorescencia menos un control como detalle en el protocolo de texto.

Prepare las perlas UltraComp mientras los instrumentos de flujo se calientan vórticándolos a fondo antes de su uso. Etiquete un tubo de muestra separado de 12 x 75 milímetros para cada anticuerpo conjugado fluorocromo. Añadir 100 microlitros de tampón de tinción a cada tubo seguir por una gota completa de las cuentas.

Añadir anticuerpos y realizar el procedimiento de tinción como se describe en el protocolo de texto. A continuación, agregue 0,5 mililitros de tampón de tinción a cada pellet de cordón y vuelva a suspender completamente a través del vórtice. Ahora, establezca el voltaje de citometría de flujo PMT por tejido objetivo para el experimento dado.

Ejecute la muestra a través de la citometría de flujo para la adquisición de datos ganando en la población de cuentas de un solo lado por dispersión hacia delante y lecturas de dispersión lateral. Establezca el caudal de alrededor de 200 a 300 eventos por segundo. Establezca la compensación adecuada para un determinado anticuerpos de conjugación FITC de fluoresceína utilizando una gráfica de puntos FL1 frente a FL1.

Coloque una puerta cuadrante para que las cuentas negativas estén dentro del cuadrante inferior izquierdo y las cuentas positivas estén dentro del cuadrante superior o inferior derecho. Ajuste los valores de compensación hasta que la intensidad media de fluoresceína de cada población sea aproximadamente igual. Repita estos pasos para todos los tubos.

Ahora, proceda a la adquisición de muestras de manchas reales. Ejecute el asistente de compensación y guarde la configuración con el format:date, experiment y sus iniciales. La implantación ortotópica del adenocarcinoma ductal pancreático dio lugar a un rápido crecimiento tumoral similar al observado en la implantación subcutánea.

Se muestran imágenes representativas de tinción de hematoxilina y eosina y demuestran un crecimiento similar de implantes subcutáneos y ortotópicos. Se obtuvieron rendimientos razonablemente altos de células viables a partir de la muestra tumoral de ambos tipos de implantación. El splat representativo FACS muestra células viables del tumor separado de las células muertas y los desechos celulares.

Aquí se muestra un tumor que se infiltra en una comparación de perfil inmune de la población de células principales y numeradoras de varios subconjuntos clave de células inmunitarias tumorales. Se muestran homoinjertos subcutáneos frente a ortotópicos del cáncer de páncreas. Los datos muestran claramente que el tumor ha aumentado significativamente la infiltración de células inmunitarias en comparación con el páncreas de ratones sanos.

Además, se encontraron diferentes porcentajes de subconjuntos de células inmunitarias infiltrantes de tumores en homoinjertos ortotópicos frente a subcutáneos. Por ejemplo, hay significativamente más células B en ortotópicas que en subcutáneas. Al intentar este procedimiento es importante recordar preparar todos los materiales y reactivos asociados con antelación.

Después de ver este video, usted debe tener una buena comprensión de cómo realizar el análisis FACS para modelos murine.