De Novo Generación de células somáticas por YAP/TAZ

El objetivo general de este procedimiento es convertir las células primarias diferenciadas en células progenitoras del mismo linaje mediante la expresión transitoria del factor de transcripción YAP. Este procedimiento de reprogramación ofrece la posibilidad de generar in vitro células progenitoras o similares a células madre de varios tejidos a partir de sus contrapartes diferenciadas, incluso cuando las células madre endógenas son raras o difíciles de identificar. La posibilidad aquí fuera de expandir células somáticas ex vivo tiene implicaciones para la medicina regenerativa, para la comprensión de los mecanismos de plasticidad celular que también es relevante en el cáncer y para el tejido celular, y para el desarrollo de estudios de biología.

Este procedimiento llena una caja negra en el campo actual de la reprogramación, ya que no pretendemos crear células especializadas a través de la diferenciación de células madre embrionarias, sino células madre específicas de tejidos a partir de células diferenciadas. Después de sacrificar 10 ratones hembra de acuerdo con el protocolo de texto, diseccione las glándulas mamarias haciendo una incisión en forma de Y a lo largo de la piel abdominal. A continuación, utilice unas pinzas de Dumont para separar cuidadosamente las glándulas del peritoneo tirando suavemente.

Coloque las glándulas disecadas en un plato adhesivo no celular con 10 mililitros de HBSS+PS helado. Bajo una campana de cultivo de tejidos, use 10 mililitros de HBSS+PS fresco para lavar cada glándula una vez y colóquelas en un plato adhesivo vacío que no sea celular. A continuación, utilice dos bisturíes estériles para picar finamente las glándulas en fragmentos de un milímetro cúbico.

La picado adecuado de las glándulas es esencial para un aislamiento celular eficiente. Junte 20 glándulas e intente realizar este paso dentro de tres a cinco minutos para una viabilidad celular óptima. Utilizando una pipeta serológica de 25 mililitros y 10 mililitros de medio de disociación, recupere el tejido picado de cada placa y transfiera la suspensión en un tubo cónico de 50 mililitros pipeteando al menos cinco veces para desagregar los grumos de tejido.

Incubar el tejido a 37 grados centígrados durante una hora con agitación vigorosa y continua. A continuación, centrifugar el tejido digerido a 400 veces g a temperatura ambiente durante cinco minutos. Después de desechar el sobrenadante, use tres mililitros de solución hemolítica para resuspender el tejido e incubar en hielo durante tres minutos.

A continuación, con 10 mililitros de medio de lavado número uno, lavar las células. Después de centrifugar el tejido digerido y desechar el sobrenadante, vuelva a suspender el pellet de tejido en 10 mililitros de medio de lavado número dos y coloque las células en placas de cultivo de tejidos de 10 centímetros. Luego incubar los platos a 37 grados centígrados durante una hora.

Recupere la suspensión celular en un tubo cónico de 50 mililitros y haga girar el tubo a 400 veces g durante cinco minutos. A continuación, utilice 10 mililitros de la solución quelante de calcio para resuspender el pellet. Después de la centrifugación y después de repetir el lavado, vuelva a suspender el pellet en cinco mililitros de tripsina al 0,25%-EDTA.

Después de incubar la muestra, agregue cinco mililitros de solución de dispasa suplementada con un microgramo por mililitro de DNasa uno encima de la solución de tripsina. Para desagregar los grumos, use una punta de pipeta de un mililitro para pipetear hacia arriba y hacia abajo al menos cinco veces e incube la muestra a 37 grados centígrados durante 10 minutos, agitando cada tres minutos. Agregue 10 mililitros de medio de lavado número dos y filtre la solución a través de un colador de celdas de 40 micrómetros en un nuevo tubo cónico de 50 mililitros.

A continuación, gira hacia abajo la suspensión de la célula. Para llevar a cabo la purificación celular por FACS, utilice 200 microlitros de medio de lavado número uno para resuspender cada pellet. A continuación, añada 44,5 microlitros de mezcla de anticuerpos, pipetee bien e incube la muestra en la oscuridad sobre hielo durante 30 minutos.

Difuminar la suspensión celular en 10 mililitros de medio de lavado número uno y centrifugar la muestra. Vuelva a suspender el pellet de la célula en dos mililitros de solución clasificadora y filtre a través de un tubo FACS del filtro de tapas antes de proceder a la separación FACS de las poblaciones celulares. Use la solución de lavado número uno para lavar las células recuperadas de FACS.

Después de eliminar el sobrenadante, use un medio de cultivo mamario 2D para resuspender el pellet de células y la placa de 500 microlitros por pocillo en una placa tratada con colágeno. Siete días después de la inducción de doxiciclina de células LD primarias infectadas con lentivirus, agregue 150 microlitros por pocillo de 05% de tripsina-EDTA a las células e incube a 37 grados centígrados durante 10 minutos. Una vez lavadas y contadas las células, utilizar medio de colonia de memoria, suplementado con dos microgramos por mililitro de doxiciclina para resuspenderlas.

A continuación, siembre 1.000 células por pocillo en placas de fijación ultra bajas de 24 pocillos para cultivar YAP que expresan mascarillas como colonias. Para subcultivar y enmascarar, recoja cada muestra y agregue un volumen de 10 a un volumen de HBSS helado, luego incube las muestras en hielo durante una hora para solubilizar la matriz de la membrana basal. Después de centrifugar las colonias, use HBSS helado para lavar las celdas tres veces.

A continuación, añadir 05%tripsina-EDTA a las colonias e incubarlas a 37 grados centígrados durante 10 minutos. Pase las colonias a través de una punta de pipeta P1000 10 veces para obtener una suspensión de una sola célula. A continuación, cuente y vuelva a sembrar las células en medio de colonia mamaria sin doxiciclina en placas de fijación ultra bajas de 24 pocillos a una densidad colonogénica de 1.000 células por pocillo.

Antes del tercer paso, transfiera y enmascare las colonias en condiciones de cultivo de organoides recuperando las colonias del medio de la colonia mamaria y utilice una matriz de membrana basal reducida al 100% del factor de crecimiento para resuspenderlas. Después de la incubación, cuando la matriz de la membrana basal se ha solidificado, superponga los geles con 500 microlitros del medio organoide mamario. Pase los cultivos recogiendo cada muestra de organoide e incubándolas en un volumen excesivo de HBSS en hielo durante una hora.

Luego use HBSS helado para lavar los organoides tres veces. Tripsinice los organoides como se demostró anteriormente en este video y vuelva a sembrar suspensiones unicelulares en una gota de matriz de membrana basal reducida al 100% del factor de crecimiento, luego use 500 microlitros de medio organoide mamario para superponer los geles. Después de lavar el tejido pancreático de ratón digerido de acuerdo con el protocolo de texto, use seis mililitros de medio de recuperación acinar para resuspender cuidadosamente el tejido digerido y dividirlo entre dos pocillos de una placa de cultivo de tejido de seis pocillos.

Bajo un microscopio estereoscópico, evalúe cuidadosamente la calidad del aislamiento acinar y elimine cualquier grupo de tejido grande que eventualmente esté presente. Para sembrar acinos pancreáticos primarios, después de incubar los racimos durante dos horas para la recuperación celular, recoja la suspensión de células acinares en un tubo cónico y centrifugue las muestras a 100 veces g y 18 grados centígrados durante cinco minutos. Después de resuspender los acinos en un medio de cultivo acinar, diluya la suspensión con un volumen igual de colágeno de cola de rata neutralizado en una solución, manteniendo los tubos en hielo.

Mezcle con cuidado y rápidamente y siembre la suspensión celular en 16 pocillos encima de la almohadilla de colágeno. Para una siembra óptima de acinos pancreáticos, es crucial mantener todos los tubos en hielo antes de enchapar y proceder con rapidez, pero al mismo tiempo, es esencial un pipeteo cuidadoso para evitar la formación de burbujas de aire para crear una matriz de colágeno homogénea. Incubar las células a 37 grados centígrados durante una hora para permitir que se forme un hidrogel.

Luego, para inducir organoides pancreáticos, superponga los hidrogeles de colágeno con 500 microlitros de medio de cultivo acinar suplementado con doxiciclina. Para subcultivar los organoides, deseche el medio de cultivo, extraiga cuidadosamente los hidrogeles y transfiéralos a tubos cónicos que contengan cuatro mililitros de solución B de colagenasa I, luego incube los tubos a 37 grados centígrados con agitación vigorosa durante 30 minutos antes de girar las células y eliminar el sobrenadante. Después de intentar tripsinizar las células y eliminar el sobrenadante PBS, use una matriz de membrana basal helada para resuspender la célula y sembrar la suspensión en placas de fijación ultra bajas.

Deje que el hidrogel de la matriz de la membrana basal se solidifique incubando las placas a 37 grados centígrados durante 40 minutos y luego cúbralas con medio organoide pancreático. Los conductos crecerán como organoides similares a quistes en siete a 10 días. La activación cuidadosa de las células epiteliales LD mamarias primarias en las tres subpoblaciones que se muestran aquí es esencial para aislar una preparación pura de células LD que están completamente diferenciadas y cuyo crecimiento se detiene completamente cuando se siembran en condiciones de formación de colonias de glándulas mamarias.

Por el contrario, cuando se les induce a expresar YAP exógeno, las células LD comienzan a proliferar para formar colonias epiteliales densas fácilmente reconocibles en cultivos en suspensión de matriz de membrana basal al 5%. En condiciones de cultivo de organoides de matriz de membrana basal, las células luminales reprogramadas se autoorganizan en estructuras complejas similares a organoides que se desarrollan alrededor de múltiples lúmenes y se renuevan incluso en ausencia de doxiciclina. Dentro de los cinco a siete días de cultivo en hidrogel 3D a base de colágeno I en presencia de doxiciclina, los acinos pancreáticos diferenciados se convierten fácilmente en grupos similares a conductos o conductos compuestos por una delgada monocapa de células epiteliales que proliferan alrededor de una cavidad central en expansión.

La eficiencia de la reprogramación se puede medir fácilmente puntuando el número de racimos en forma de conducto sobre el número total de acinos sembrados. Los yDuctos reprogramados pueden ser conducidos a nivel de una sola célula a condiciones de cultivo de organoides basadas en matrigel mostrando una notable capacidad de autorrenovación incluso en ausencia de expresión endógena de YAP. Hemos detallado dos procedimientos.

Uno permitió la reprogramación de células purificadas con FACS a través de vectores lentivirales y un segundo que evita la infección viral y aprovecha la expresión transgénica de YAP. Al intentar la reprogramación de las células mamarias, es importante evitar el uso de un título viral excesivo, ya que esto puede ser perjudicial para la eficiencia de la reprogramación. La estrategia totalmente transgénica es apropiada para los acinos pancreáticos primarios, ya que estos son escasamente susceptibles a la infección lentiviral.

También ofrece la misma ventaja que los vectores lentivirales dependientes de doxiciclina para el control de tipo de la expresión génica. Además de los ejemplos demostrados aquí, este protocolo de reprogramación YAP ha demostrado ser exitoso para convertir neuronas diferenciadas en neuronas proliferantes. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo realizar una reprogramación dependiente de YAP para convertir tipos de células diferenciadas de diferentes tejidos adultos en sus correspondientes células madre específicas de tejido.

Este procedimiento amplía las estrategias de reprogramación actuales al proporcionar un medio para generar células madre somáticas que pueden tener relevancia para la medicina regenerativa, para el estudio de la madre somática y para la expansión de células madre somáticas in vitro. Tenga en cuenta que la manipulación de la preparación lentiviral puede ser extremadamente peligrosa y, según el nivel de seguridad, siempre se deben adoptar medidas al realizar este procedimiento.