Name: De Novo Generación de células somáticas por YAP/TAZ (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-05-07T14:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 5 s
Description: Aprende a reprogramar células diferenciadas en progenitoras mediante la expresión transitoria del factor de transcripción YAP. Este método genera células madre específicas de tejido para aplicaciones en medicina regenerativa y estudios de plasticidad celular.

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Agradecemos el regalo de tetO-YAPS127A ratones; F. Camargo R26-rtTAM2 ratones (stock #006965) se adquirieron en el laboratorio de Jackson. Agradecemos a Chiara Frasson y Giuseppe Basso para ayuda con los procedimientos de FACS. Este trabajo es apoyado por AIRC especial programa clínico Oncología Molecular '' 5 por mil '' y una PI-subvención de AIRC a Alexis y epigenética proyecto CNR Miur concede a S.P. Este proyecto ha recibido financiación del Consejo Europeo de investigación (ERC) bajo programa de innovación e investigación de horizonte 2020 de la Unión Europea (acuerdo DENOVOSTEM no. 670126 la concesión).

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<li>Yanger, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Robust+cellular+reprogramming+occurs+spontaneously+during+liver+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">Robust cellular reprogramming occurs spontaneously during liver regeneration.</a> Genes Dev. 27 (7), 719-724 (2013).</li>
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</ol>

Los autores no declaran a intereses financieros en competencia.

Aquí presentamos los protocolos para reprogramar ex vivo terminalmente diferenciadas las células epiteliales de diversos tejidos en sus correspondientes células progenitoras de tejidos específicos (o ySCs) por expresión transitoria de YAP, como se informó anteriormente1. Detallamos dos procedimientos: uno que permite la reprogramación de células de FACS-purificado a través de vectores lentivirales y una segunda que evita la infección viral y se aprovecha de la expresión transgénica de YAP. Cada protocolo presenta una estrategia eficiente para aislar y células diferenciadas primaria cultura y una estrategia de fuerza exógena YAP expresión génica en células diferenciadas, generando de nuevo somática tejido expandible células madre específicas (véase esquemas en las figuras 1A y 2A).
Hemos demostrado que las estrategias de aislamiento aquí presentadas efectivamente aislar a una población pura de células diferenciadas, como lo demuestra el hecho de que nunca detectamos cualquier derivación de las muestras control negativo (figuras 1 y 2 C).
Los vectores lentivirales utilizados en este estudio para la reprogramación de células mamarias primarias de LD son doxiciclina inducible, ofreciendo la posibilidad de un control estricto de la expresión del transgen; Esto permite para encender y fuera exógena YAP expresión a voluntad. Especial atención debe colocarse en evitar el uso de un título viral excesiva, ya que esto puede ser perjudicial en términos de eficiencia de reprogramación. En el caso de las células acinares primarias, hemos cambiado a un enfoque totalmente transgénico para obtener una reprogramación de YAP-dependiente con mínima manipulación. Esta estrategia esta última también es especialmente adecuada para primarios acinos pancreáticos, como grupos acinares aislados son apenas susceptibles a la infección lentivirales y muy frágiles. La estrategia transgénica empleada ofrece la misma ventaja de vectores lentivirales dependiente de la doxiciclina para el estricto control de la expresión génica. Por otra parte, la estrategia transgénica explotada con acinos pancreáticos principal tiene la ventaja adicional de una eficiencia mucho más alta reprogramación en comparación con la reprogramación inducida por el virus de células mamarias de LD. Más allá de la diferente plasticidad intrínseca asociada a células de diferentes tejidos, la mayor tasa de reprogramación pancreático podría derivar la eficacia más alta de expresión asociada a la expresión de YAP autónoma y uniforme en todos células explanted. En particular, hemos demostrado que YAP exógeno ya no es necesario después de la generación de ySCs (colonias de yMaSC y yDucts), sin afectar a su capacidad de auto renovación. Esto es porque ySCs reactivación endógena YAP/TAZ y utilizarlas para autorenovación cuando YAP exógeno se apaga1.
Validamos la noción ySCs de hecho resultantes de células diferenciadas mediante el control de la célula del origen de nuestros experimentos de reprogramación a través de validaciones linaje trazado genético1.
Amplia caracterizaciónde ySCs muestra que YAP-inducida reprogramación genera normal somático SCs1 como yo) a nivel transcriptómico, ySCs exhibición masiva se traslapa con SCs nativos; II) ySCs Mostrar la diferenciación potencial y puede generar una progenie del multilineage siempre restringida a la identidad de su tejido de origen; III) ySCs son no-transformado y cuando no tumorigenic trasplantadas en vivo.
Aquí describimos también procedimientos para mantener y ampliar en la cultura yMaSCs y yDucts como organoides incrustado en la membrana del sótano 100% matriz hidrogeles. Estas condiciones permiten la autoorganización de ySCs en organoides tridimensional que garantiza el mantenimiento de las propiedades de la troncalidad a largo plazo en la cultura, lo que permite ampliar estas tallo poblaciones a voluntad para posteriores análisis y aplicaciones. Por razones desconocidas, no pudimos obtener yMaSC organitas colocando infectaron células LD directamente en las condiciones de cultivo de organoide 7 días después del tratamiento del doxycycline en placa de cultivo de tejidos de plástico; en otras palabras, el paso intermedio de crecimiento en condiciones de Colonia mamaria es esencial. En nuestras manos, incluso nativos MaSCs requieren condiciones colonia mamaria antes de pases en cultivo de organoide. Por otra parte, la consecuencia de organoide más eficiente se obtiene cuando evitar disociar las colonias primarias en células individuales, sino más bien transferir las colonias intactas en condiciones de cultivo de organoide.
Condiciones de cultivo de organoide también tienen la ventaja de dar la posibilidad de criopreservar ySCs, siempre que el organitas están recuperados de sus matrices, evitando la disociación celular antes de la criopreservación en el baño de nitrógeno.
El YAP reprogramación procedimiento presentado puede convertir tipos de célula diferenciada distintos derivados de diversos tejidos adultos en sus correspondientes células de tejidos específicos (hemos probado con células mamarias, pancreáticas y neuronales)1. A diferencia de otros esfuerzos de reprogramación o de iPSCs, YAP, inducido SCs pueden mantener los recuerdos de su tejido de origen. De nota, la diferenciación de las células somáticas en células con propiedades similares a la madre es la única forma de plasticidad de destino celular y reprogramación observada in vivo, por ejemplo después de daño de tejido y para apoyar la cicatrización5,17 , 18 , 19 , 20. es notable que YAP y TAZ son en gran parte prescindibles para homeostasis normal pero crucial para la reparación de los tejidos en múltiples tejidos11,21. Constantemente con una función fisiológica de las reprogramación pasos aquí descritos, YAP/TAZ ha demostrado recientemente para ser requerido en la regeneración intestinal en modelos de ratón de los pacientes de colitis ulcerosa haciendo una conversión de las células intestinales adultos en un reparación epitelio que muestra características del intestino fetal19. YAP reprogramación amplía así las estrategias actuales de la plasticidad de la célula inducida por proporcionar un medio para generar células madre somáticas, un estado que ha sido hasta ahora un desafío para capturar in vitro. Este enfoque, si extendió también a las células derivadas de humanos, podría tener amplia relevancia desde las aplicaciones de la medicina regenerativa para el estudio del estado somático de la troncalidad y para expansión de somática del tallo las células en vitro.

Específicas de tejido células somáticas (SCs) son críticas para la renovación de tejidos y reparación después de la lesión. La posibilidad de aislar fácilmente y ampliar ilimitadamente ex vivo somática SCs representa un problema crítico para potenciales terapias regenerativas, así como para aplicaciones de SC en investigación básica y modelado de la enfermedad. Progreso en esta dirección, sin embargo, ha sido limitado por la dificultad de captar el estado de SC de varios órganos epiteliales in vitro. De hecho, en varios tejidos adultos SCs residente pueden no existir, o no estar fácilmente disponible o su número y potencial regenerativo pueden ser erosionados por condiciones de envejecimiento o enfermedad. En 2016, comenzó a llenar este vacío al reportar que la expresión de un único del coactivator transcripcional, YAP (proteína asociada a YES) o su proteína estrechamente relacionado TAZ (activador transcripcional con un motivo PDZ), en las células terminalmente diferenciadas eficientemente crea poblaciones autólogo, no tumorigenic, extensible y funcional de la célula que son operacionalmente y molecularmente indistinguibles de sus correspondientes específicas de tejido SCs1. Un pulso sostenido ladrido o TAZ actividad durante algunos días es suficiente para inducir la aparición de uno mismo-renovar SCs somáticas. Esta es una condición estable que ya no depende de la expresión del transgen continua, como puede ser transmitida a través de generaciones de células sin más expresión de ectópico YAP/TAZ1. El protocolo presentado aquí detalles el procedimiento utilizado para generar células progenitoras epiteliales de novo de la glándula mamaria y el páncreas, a partir de células diferenciadas de estos tejidos. Este procedimiento llena una caja negra en el escenario actual de reprogramación/transdifferentiation. Principales esfuerzos en estas direcciones de hecho hasta el momento se han centrado en la transición de células a un estado de pluripotentes inducidas (iPSC) de la célula de vástago, seguido por la conversión de estas embrionarias y SCs pluripotente en células más diferenciadas. Sin embargo, iPSCs son tumorigenic una vez introducido en los tejidos adultos, elevar la necesidad de desarrollar protocolos para su diferenciación completa y eficiente2. Sin embargo, este paso de diferenciación, incluso cuando es posible, viene en el precio de los potenciales de repoblación a largo plazo capacidad de expansión, organización y órgano. Estos son atributos esenciales para la regeneración del órgano que de hecho son típicos sólo de SCs de tejidos específicos endógenos y de SCs YAP-inducida actualmente descrito (ySCs). Del mismo modo, transdiferenciación directa del tipo de una célula a otra mediante el uso de cócteles de la transcripción de diversos factores generan células que carecen de esencial proliferativa y troncalidad potencial3diferenciadas.
El procedimiento descrito aquí también aprovecha la tecnología de organoide recientemente introducido, que CS endógenos pueden ampliarse y distinguen ex vivo4. SCs YAP-inducida pueden generar SCs formando organoides incluso en condiciones experimentales, biológica o enfermedad en que SCs endógenos no están presentes. Nos gustaría señalar que, en la diferencia con otros procedimientos de reprogramación, el tipo de plasticidad celular impartido por YAP puede corresponder a la forma única de la reversión a un estado SC que se produce en los tejidos vivos. Readquisición de SC-como características se ha asociado con la reparación de los tejidos o activación oncogénica5. Aunque prescindibles para la homeostasis de los tejidos adultos varios, YAP y TAZ es absolutamente esencial para la regeneración, el crecimiento del tumor y expansión de SCs somáticas en vitro1,6,7,8 ,9,10,11,12

<table><tbody><tr><td>Jeringas estériles de 10 mL</td><td>Rays</td><td>10LC</td><td></td></tr><tr><td>100 mm&nbsp; filtro de células</td><td>Corning</td><td>352360</td><td></td></tr><tr><td>Tubos cónicos estériles de 15</td><td>mL Corning</td><td>430052</td><td></td></tr><tr><td>Placas de fijación ultra bajas de 24 pocillos</td><td>Costar</td><td>3473</td><td></td></tr><tr><td>Coladores de celdas de 40 mm</td><td>Corning</td><td>352340</td> Placas multipocillos <td></td></tr><tr><td>de 48 pocillos</td>Tubos cónicos <td>estériles Corning</td><td>353078</td><td></td></tr><tr><td>50 mL</td><td>Corning</td><td>430290</td> Placas multipocillos <td></td></tr> de <tr><td>6 pocillos</td><td>Corning</td><td></td> 353046 <td></td></tr><tr><td>Advanced DMEM/F12</td><td>Suplemento Gibco</td><td>12634028</td><td></td></tr><tr><td>B27 (50x)</td><td>Gibco</td><td>17504001</td><td></td></tr><tr><td>BPE</td><td>Gibco</td><td>13028014</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma</td><td>A9418</td><td></td></tr><tr><td>Colagenasa, tipo I</td><td>Sigma</td><td>17018029</td><td></td></tr><tr><td>dexametasona</td><td>Sigma</td><td>D4902&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Dispasa</td><td>Gibco</td><td>1705-041</td><td></td></tr><tr><td>Bisturíes desechables</td><td>Swann-Morton</td><td>0503</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F12</td><td>Gibco</td><td>11320033</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma</td><td>D2650</td><td></td></tr><tr><td>DnaseI</td><td>Roche</td><td>11284932001</td><td></td></tr><tr><td>hiclato de doxiciclina</td><td>Sigma</td><td>D9891&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma</td><td>E5134</td><td></td></tr><tr><td>Etanol 100%</td><td>Sigma</td><td>51976</td><td></td></tr><tr><td>Tubos FACS (con tapas de colador)</td><td>Falcon</td><td>352235</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Gibco</td><td>10270106</td><td></td></tr><tr><td>FITC anti-ratón CD326 (Ep-CAM)</td><td>BioLegend</td><td>118208</td><td></td></tr><tr><td>FUdeltaGW-rtTA&nbsp;</td><td>Addgene</td><td>&nbsp;#19780&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>FUW-tetO-EGFP</td><td>Addgene</td><td>&nbsp;#84041</td><td>utilizado como control negativo</td></tr><tr><td>FUW-tetO-MCS</td><td>Addgene</td><td>&nbsp;#84008</td><td>utilizado como control negativo</td></tr><tr><td>FUW-tetO-wtYAP</td><td>Addgene</td><td>&nbsp;#84009</td><td></td></tr><tr><td>FUW-tetO-YAPS94A</td><td>Addgene</td><td>&nbsp;#84010</td><td>utilizado como control negativo (mutante YAP transcripcionalmente muerto)</td></tr><tr><td>GlutaMax</td><td>Gibco</td><td>35050061</td><td></td></tr><tr><td>HBSS</td><td>Gibco</td><td>24020117</td><td></td></tr><tr><td>HCl</td><td>Sigma</td><td>30721</td><td></td></tr><tr><td>heparina sal sódica</td><td>Sigma</td><td>H3149&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Solución tampón HEPES (1M)</td><td>Gibco</td><td>15630-056</td><td></td></tr><tr><td>R-Spondin1 humano (His Tag)</td><td>Sino Biological</td><td>11083-H08H-5</td><td></td></tr><tr><td>Hialuronidasa de testículos bovinos</td><td>Sigma</td><td>H3506&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>ITS-X</td><td>Gibco</td><td>51500056</td><td></td></tr><tr><td>K-14 anticuerpo</td><td>Life Technologies</td><td>Ab7800&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Anticuerpo K-8</td><td>Life Technologies</td><td>Ab14053&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamina</td><td>Gibco</td><td>&nbsp; </td><td></td>25030081</tr><tr><td>Lin (cóctel de anticuerpos del linaje de ratón aloficocianina [APC])</td><td>BD Biosciences</td><td>51-9003632</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel&reg; Factor de crecimiento Matriz de membrana basal reducida, Corning sin rojo de fenol</td><td>356231</td><td></td><td></td></tr><tr><td>N-acetilcisteína</td><td>Sigma</td><td>A9165</td><td></td></tr><tr><td>NaOH</td><td>J.T.Baker</td><td>0402</td><td></td></tr><tr><td>NH4Cl</td><td>Sigma</td><td>A9434&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Nicotinamida</td><td>Sigma</td><td>72340</td><td></td></tr><tr><td>adhesivo no celular platos de 10 cm (placa de Petri de polistirol estéril y OSLASH; 94)</td><td>ROLL</td><td>18248</td><td></td></tr><tr><td>PBS 10x</td><td>Euroclon</td><td>ECM4004XL</td><td></td></tr><tr><td>PE Hámster Anti-Ratón CD61</td><td>BD Biosciences</td><td>553347</td><td></td></tr><tr><td>PE-Cy5 Rata Anti-Humana CD49f</td><td>BD Biosciences</td><td>551129</td><td></td></tr><tr><td>PE/Cy7 anti-ratón/rata CD29 Anticuerpo BioLegend</td><td></td><td>102222</td><td></td></tr><tr><td>Pen/Estreptococo (10.000 U/mL)</td><td>Gibco</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>Colágeno de cola de rata I (recubrimiento)</td><td>Sigma</td><td>122-20</td><td></td></tr><tr><td>Colágeno de cola de rata I para cultivo 3D</td><td>Cultrex</td><td>3447-020-01&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>humano recombinante FGF10</td><td>Peprotech</td><td>100-26</td><td></td></tr><tr><td>humano recombinante Noggin</td><td>Peprotech</td><td>120-10C</td><td></td></tr><tr><td>recombinante murino EGF</td><td>Peprotech</td><td>315-09</td><td></td></tr><tr><td>recombinante murino FGF básico (bFGF)</td><td>Peprotech</td><td>450-33</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640 medio</td><td>Gibco</td><td>31870025</td><td></td></tr><tr><td>SBTI (Inhibidor de tripsina de Glycine max)</td><td>Sigma</td><td>T6522&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Tris BASE&nbsp;</td><td>Roche</td><td>11814273001</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA 0,05%</td><td>Gibco</td><td>25300054</td><td></td></tr><tr><td>Waymouth mediano</td><td>Gibco</td><td>31220023</td><td></td></tr></tbody></table>

de novo generación de células somáticas por yap/taz

De Novo Generation of Somatic Stem Cells by YAP/TAZ

Aquí presentamos los protocolos para aislar las células primarias diferenciadas y a su vez en células madre/progenitoras (SCs) del mismo linaje por expresión transitoria del factor de transcripción de YAP. Con este método, las células luminales diferenciadas (LD) de la glándula mamaria de ratón se convierten en células que exhiben propiedades moleculares y funcionales de mamaria SCs. YAP también vueltas completamente distinguidos exocrino las células pancreáticas en pancreático conducto-como progenitores. Del mismo modo, a SCs endógenos, naturales, inducida por YAP vástago-como las células ("ySCs") pueden ser eventualmente ampliadas como organoides cultivos a largo plazo in vitro sin necesidad de ectópico YAP/TAZ, como ySCs están dotados de un estado hereditario de SC-como renovado.
El procedimiento de reprogramación presentado aquí ofrece la posibilidad de generar y ampliar en vitro las células progenitoras de varias fuentes de tejido a partir de células diferenciadas. La extensión directa de las células somáticas ex vivo tiene implicaciones para la medicina regenerativa, para mecanismos de comprensión de la iniciación del tumor y, más en general, estudios de Biología del desarrollo y celular.

Generación de yMaSCs Un resumen de la estrategia experimental para reprogramar células mamarias primarias de LD por expresión transitoria de YAP se presenta en la figura 1A. Principales células epiteliales mamarias de LD son purificadas por célula fluorescente activado clasificación13. Figura 1B representa un típico procedimiento de clasificación para obtener tres subpoblaciones distintas: células basales (EpCAMbajaCD49faltaCD61–), las células luminales del Progenitor (LP) (EpCAMaltaCD49fbajaCD61+ ) y LD (EpCAMaltaCD49fbajaCD61–). Cuidadoso control de las tres subpoblaciones es esencial aislar una preparación pura de las células de LD, totalmente se distinguen y completamente crecimiento detenido cuando siembran en condiciones (véase la figura 1, panel a la izquierda) formadoras de glándula mamaria. Por el contrario, cuando inducidos a expresar YAP exógeno, LD células comienzan proliferan para formar colonias epiteliales densas fácilmente reconocibles en cultivos de suspensión de matriz de la membrana del sótano 5% (figura 1). La eficiencia de reprogramación, atestigua alrededor del 3% para un típico experimento, puede ser anotado por contando el número de colonias sobre el número de células sembradas originalmente en cultivos de suspensión de matriz de la membrana basal (figura 1). Las células luminales reprogramadas (yMaSCs) pueden ser paso en 100% membrana basal matriz organoide condiciones de cultivo (ver esquema en la figura 1A), uno mismo-organización en estructuras organoides como complejas que se desarrollan alrededor de lúmenes múltiples y Mostrar la capacidad de auto renovación notable incluso en ausencia de doxiciclina (es decir, en ausencia de la expresión transgénica de YAP) (Figura 1E). Histológico, organoides derivados de yMaSC muestra una capa basal (K14 positivos), frente a la matriz de la membrana basal reconstituida ECM y una capa luminal (K8 positivo), frente a las cavidades de luz-como en los organoides (Figura 1F). Esta arquitectura es indistinguible de la de organoides formados por nativos MaSCs (Figura 1F).
Generación de yDucts Un resumen de la estrategia experimental para reprogramar primarios acinos pancreáticos por expresión transitoria de YAP se presenta en la figura 2A. Todos grupos acinares están aisladas de la mayor parte del tejido pancreático por una combinación de disociación leve y la exclusión de tamaño a través de filtración. Una preparación típica se presenta en la figura 2B. Después de aislamiento, los racimos de células acinares deben aparecer como una suspensión de unidades acinares exocrinas de tamaño homogéneo, sin contaminación por endocrino islotes de Langerhans o fragmentos del árbol ductal pancreático y disociación mínima a las células. Contaminación por islotes endocrinos o fragmentos ductales es una indicación de deficiente filtración selectiva (paso 2.1.10), posiblemente debido al manejo áspero; no deseados la disociación de grupos acinares a las células podría ser debido al tratamiento de colagenasa excesiva o actividad sin búfer de proteolytic Enzimas liberadas por el tejido, que puede ser frenado por tratamiento adicional SBTI.
Un típico experimento de reprogramación acinar se presenta en la figura 2; dentro de los 5-7 días de la cultura en 3D colágeno-basado del hidrogel en presencia de doxiciclina, acinos pancreáticos derivados de ratones R26-rtTAM2/tetO-YAPS127A fácilmente convierten en conducto-como racimos (que hemos llamado yDucts), compuesto por una delgada monocapa de células epiteliales que proliferan alrededor de una cavidad central expansión. La eficiencia de reprogramación, que es alrededor del 70% para un experimento típico, puede medirse fácilmente por anotar el número de conducto-como racimos sobre el número total de semillas acinos (Figura 2D). El control negativo de las células, es decir R26-rtTAM2 / + células o R26-rtTAM2/tetO-YAPS127A izquierda sin doxiciclina, siendo invariablemente como poste-mitotic grupos acinares en estas condiciones de cultivo, según lo divulgadas previamente1 ,14,15. YDucts reprogramado entonces puede ser pasados a nivel unicelular en base de Matrigel organoide cultura condiciones16 (ver esquema en la figura 2A), mostrando la capacidad de auto renovación notable incluso en ausencia de doxiciclina (es decir, en ausencia de la expresión transgénica de YAP) (Figura 2E).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57462/57462fig1.jpg"> Figura 1: Células madre células aislamiento del primario mamario LD y la inducción de mamaria. (A) representación esquemática del procedimiento experimental adoptado para reprogramar células mamarias primarias de LD. (B) representante de FACS-parcelas que ilustra un típico procedimiento de clasificación para purificar células de LD. i) células disociadas son cerradas según dispersión hacia delante y lateral de células vivas (P1; azul); II) población P1 entonces es aún más cerrada según su perfil de Lin: la subpoblación de células de linaje negativas (P2; gris) es seleccionada, excepto las células hematopoyéticas de linaje-positivo; III) población P2 se separa en un EpCAMalta (P3; amarillo + verde) y un EpCAM subpoblacionesbaja (P6; rojo); IV) P3 y P6 son entonces más cerrada según su perfil de CD61/CD49f en tres subpoblaciones: EpCAMbajaCD49faltaCD61 células basales de– (P7; rojo), EpCAMaltaCD49fbajaCD61+ LP células (P8; amarillo) y EpCAMaltaCD49fbajaCD61 células de LD– (P9; verde). (C) las imágenes son ilustrativas de la capacidad de las células de la LD, infectados con las construcciones indicadas, para formar colonias mamarias 15 días después de la siembra en medio Colonia mamaria. Sólo expresando YAP vuelta de células en la formación de Colonia las células, mientras que el control negativo de las células (EGFP-infectado) permanecen como células crecimiento detenido. Barra de escala = 50 μm. (D) cuantificación de la capacidad de las células indicadas, como en (C) formadoras. Los datos se presentan como media + d.e. y son representativos de cinco experimentos independientes, cada uno con seis repeticiones técnicas. (E) imagen representativa reprogramado YAP mamaria célula de vástago-como las células (yMaSCs) después de 12 días en condiciones de cultivo de organoide en fresco tridimensional 100% membrana basal matriz hidrogel en ausencia de doxiciclina. Barra de escala = 100 μm. (F) imágenes representativas de la inmunofluorescencia para el marcador basal K14 (verde) y el marcador luminal K8 (rojo) de organoides derivan de las células indicadas, después de 12 días en condiciones de cultivo del organoide. Barra de escala = 10 μm. Esta figura se reproduce de Panciera et al., 20161. <a href="/files/ftp_upload/57462/57462fig1large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57462/57462fig2.jpg"> Figura 2 : Aislamiento de las células acinares pancreáticas primarias y la inducción de progenitores pancreáticos. (A) representación esquemática del procedimiento experimental adoptado para reprogramar células acinar exocrinas pancreáticas principal. (B) imagen representativa de acinos pancreáticos principal justo después del procedimiento de aislamiento (paso 2.1.14). La preparación acinar debe aparecer como una suspensión homogénea de grupos acinares, con escasa presencia de las células. Barra de escala = 400 μm. (C) imágenes representativas de acinos pancreáticos primarios derivan de R26-rtTAM2 (paneles superiores)o rtTAM2 R26; tetO-YAPS127A (paneles inferiores) ratones y cultivadas en 3-d colágeno I-base de hidrogel para 5 días con o sin Doxiciclina (doxy), como se indica. Sólo expresando YAP primarios acinos conversión a las células crecer como organoides quiste-como después de la adición de doxiciclina. Barras de escala = 70 μm. (D) cuantificación de la capacidad de acinos pancreáticos formando organoides ductal sobre transgénica sobreexpresión de YAP como en (C). Los datos se presentan como media + d.e. y son representativos de cinco experimentos independientes, realizados con cuatro repeticiones técnicas. (E) imagen representativa de células ductales como reprogramarlo YAP (yDucts) después de tres pasajes en fresco tridimensional 100% membrana basal matriz hidrogel en ausencia de doxiciclina. Barra de escala = 130 μm. <a href="/files/ftp_upload/57462/57462fig2large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td colspan="2">Aislamiento de células mamarias primarias</td>
		</tr>
<tr>
<td>CA2 + solución de quelantes</td>
			<td>Conservar a 4 ° C</td>
		</tr>
<tr>
<td>EDTA</td>
			<td>0.02% w/V</td>
		</tr>
<tr>
<td>PBS</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">Colágeno I capa solución</td>
		</tr>
<tr>
<td>Ácido acético 0.02N, pH 3,23</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>Colágeno cola de rata (capa)</td>
			<td>1:50</td>
		</tr>
<tr>
<td>Solución dispase</td>
			<td>Conservar a 4 ° C</td>
		</tr>
<tr>
<td>Dispase</td>
			<td>5 mg/ml</td>
		</tr>
<tr>
<td>PBS</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>Medio de la disociación</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>DMEM:F12</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>Solución madre de hialuronidasa</td>
			<td>400 U/mL</td>
		</tr>
<tr>
<td>Pluma/Strep</td>
			<td>1 x</td>
		</tr>
<tr>
<td>Colagenasa de solución</td>
			<td>600 U/mL</td>
		</tr>
<tr>
<td>Solución hemolítica</td>
			<td>Conservar a 4 ° C</td>
		</tr>
<tr>
<td>Solución de NH4Cl</td>
			<td>1 piezas</td>
		</tr>
<tr>
<td>TrisBase 20,6 g/L</td>
			<td>9 piezas</td>
		</tr>
<tr>
<td>ajustar pH a 7.2</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>HBSS/PS</td>
			<td>Conservar a 4 ° C</td>
		</tr>
<tr>
<td>HBSS</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>Pluma/Strep</td>
			<td>2 x</td>
		</tr>
<tr>
<td>Solución madre de hialuronidasa</td>
			<td>Filtro de 0.2 μm, almacenar a 4 ° C</td>
		</tr>
<tr>
<td>Hialuronidasa de testículos bovinos (polvo)</td>
			<td>2.000 U/mL</td>
		</tr>
<tr>
<td>Tampón de fosfato de sodio 1 M pH7.3</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>Solución de NH4Cl</td>
			<td>Almacene a T. amb.</td>
		</tr>
<tr>
<td>H2O</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>NH4Cl</td>
			<td>7,1 g/L</td>
		</tr>
<tr>
<td>ajustar pH a 7.65</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>Clasificación de la solución</td>
			<td>Filtro de 0.2 μm, almacenar a 4 ° C</td>
		</tr>
<tr>
<td>BSA</td>
			<td>0.1%</td>
		</tr>
<tr>
<td>EDTA</td>
			<td>1 mM</td>
		</tr>
<tr>
<td>PH HEPES 7</td>
			<td>25 mM</td>
		</tr>
<tr>
<td>PBS</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>Lavar medio #1</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>DMEM/F12</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>Pluma/Strep</td>
			<td>1 x</td>
		</tr>
<tr>
<td>Lavado mediano #2</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>DMEM/F12</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>FBS</td>
			<td>5%</td>
		</tr>
<tr>
<td>Pluma/Strep</td>
			<td>1 x</td>
		</tr>
<tr>
<td>Mamaria 2D medio de cultivo</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>DMEM/F12</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>FBS</td>
			<td>2%</td>
		</tr>
<tr>
<td>heparina</td>
			<td>4 mg/mL</td>
		</tr>
<tr>
<td>L-glutamina</td>
			<td>1 x</td>
		</tr>
<tr>
<td>bFGF murino</td>
			<td>10 ng/mL</td>
		</tr>
<tr>
<td>EGF murino</td>
			<td>10 ng/mL</td>
		</tr>
<tr>
<td>Pluma/Strep</td>
			<td>1 x</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">Inducción y Passaging de yMaSCs</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">Medio de Colonia mamaria</td>
		</tr>
<tr>
<td>DMEM:F12</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>FBS</td>
			<td>5%</td>
		</tr>
<tr>
<td>heparina</td>
			<td>4 μg/mL</td>
		</tr>
<tr>
<td>L-glutamina</td>
			<td>1 x</td>
		</tr>
<tr>
<td>Matrigel (agregue inmediatamente antes de sembrar)</td>
			<td>5%</td>
		</tr>
<tr>
<td>bFGF murino</td>
			<td>20 ng/mL</td>
		</tr>
<tr>
<td>EGF murino</td>
			<td>10 ng/mL</td>
		</tr>
<tr>
<td>Pluma/Strep</td>
			<td>1 x</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">Medio de organoide mamaria</td>
		</tr>
<tr>
<td>DMEM:F12 avanzada</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>B27</td>
			<td>1 x</td>
		</tr>
<tr>
<td>GlutaMax</td>
			<td>1 x</td>
		</tr>
<tr>
<td>heparina</td>
			<td>4 μg/mL</td>
		</tr>
<tr>
<td>HEPES</td>
			<td>1 x</td>
		</tr>
<tr>
<td>Noggin humano</td>
			<td>100 ng/mL</td>
		</tr>
<tr>
<td>bEGF murino</td>
			<td>20 ng/mL</td>
		</tr>
<tr>
<td>EGF murino</td>
			<td>50 ng/mL</td>
		</tr>
<tr>
<td>R-Spondin 1</td>
			<td>1 μg/mL</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabla 1: generación de yMaSCs. Composición de los diferentes medios de cultivo y soluciones necesarias para aislamiento de células mamarias primarias de LD y la inducción de yMaSCs (sección 1).
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td colspan="2">Aislamiento de acinos pancreáticos primarios</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">Medio de cultivo acinar</td>
		</tr>
<tr>
<td>BPE</td>
			<td>50 μg/mL</td>
		</tr>
<tr>
<td>BSA</td>
			<td>0.1%</td>
		</tr>
<tr>
<td>Dexametasona</td>
			<td>1 μg/mL</td>
		</tr>
<tr>
<td>FBS</td>
			<td>0.1%</td>
		</tr>
<tr>
<td>SU-X</td>
			<td>1 x</td>
		</tr>
<tr>
<td>Pluma/Strep</td>
			<td>1 x</td>
		</tr>
<tr>
<td>SBTI</td>
			<td>0,2 mg/mL</td>
		</tr>
<tr>
<td>Medio de Waymouth</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">Medio de lavado acinar</td>
		</tr>
<tr>
<td>BSA</td>
			<td>0.1%</td>
		</tr>
<tr>
<td>Pluma/Strep</td>
			<td>1 x</td>
		</tr>
<tr>
<td>Medio RPMI</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>SBTI</td>
			<td>0,2 mg/mL</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">Medio de recuperación acinar</td>
		</tr>
<tr>
<td>Medio de cultivo acinar</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>FBS</td>
			<td>30%</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">Colagenasa solución A</td>
		</tr>
<tr>
<td>Medio de lavado acinar</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>Colagenasa de solución</td>
			<td>U/mL 360</td>
		</tr>
<tr>
<td>PBS/PS</td>
			<td>Conservar a 4 ° C</td>
		</tr>
<tr>
<td>PBS (tampón fosfato salino)</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>Pluma/Strep</td>
			<td>1 x</td>
		</tr>
<tr>
<td>Colagenasa de solución</td>
			<td>Conservar a-20 ° C</td>
		</tr>
<tr>
<td>Colagenasa, tipo I (en polvo)</td>
			<td>6.000 U/mL</td>
		</tr>
<tr>
<td>PBS</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">Pases de organoides pancreático</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">Colagenasa solución B</td>
		</tr>
<tr>
<td>PBS 1 x</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>Colagenasa de solución</td>
			<td>240 U/mL</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">Medio de organoide pancreático</td>
		</tr>
<tr>
<td>Avanzada de DMEM/F12</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>B27</td>
			<td>1 x</td>
		</tr>
<tr>
<td>gastrina</td>
			<td>10 nM</td>
		</tr>
<tr>
<td>FGF10 humana</td>
			<td>100 ng/mL</td>
		</tr>
<tr>
<td>Noggin humano</td>
			<td>100 ng/mL</td>
		</tr>
<tr>
<td>EGF murino</td>
			<td>50 ng/ml</td>
		</tr>
<tr>
<td>N-acetilcisteína</td>
			<td>1,25 mM</td>
		</tr>
<tr>
<td>Nicotinamida</td>
			<td>10 mM</td>
		</tr>
<tr>
<td>Pluma/Strep</td>
			<td>1 x</td>
		</tr>
<tr>
<td>R-Spondin 1</td>
			<td>1 mg/mL</td>
		</tr>
<tr>
<td>SBTI</td>
			<td>0,2 mg/mL</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabla 2: generación de yDucts. Composición de los diferentes medios de cultivo y soluciones necesarias para el aislamiento de las células acinares primarias e inducción y pases de yDucts (sección 2).

Disponibilidad de SCs somáticas es crucial para la medicina regenerativa, modelado de la enfermedad y para profundizar en las propiedades de la SC. Aquí presentamos estrategias experimentales para reprogramar, in vitro, adultos células diferenciadas en sus correspondientes celdas extensibles progenitoras específicas de tejido por la expresión transitoria de la sola coactivador transcripcional YAP.

De Novo Generación de células somáticas por YAP/TAZ

Here we present protocols to isolate primary differentiated cells and turn them into stem/progenitor cells (SCs) of the same lineage by transient ...

El objetivo general de este procedimiento es convertir las células primarias diferenciadas en células progenitoras del mismo linaje mediante la expresión transitoria del factor de transcripción YAP. Este procedimiento de reprogramación ofrece la posibilidad de generar in vitro células progenitoras o similares a células madre de varios tejidos a partir de sus contrapartes diferenciadas, incluso cuando las células madre endógenas son raras o difíciles de identificar. La posibilidad aquí fuera de expandir células somáticas ex vivo tiene implicaciones para la medicina regenerativa, para la comprensión de los mecanismos de plasticidad celular que también es relevante en el cáncer y para el tejido celular, y para el desarrollo de estudios de biología.Este procedimiento llena una caja negra en el campo actual de la reprogramación, ya que no pretendemos crear células especializadas a través de la diferenciación de células madre embrionarias, sino células madre específicas de tejidos a partir de células diferenciadas. Después de sacrificar 10 ratones hembra de acuerdo con el protocolo de texto, diseccione las glándulas mamarias haciendo una incisión en forma de Y a lo largo de la piel abdominal. A continuación, utilice unas pinzas de Dumont para separar cuidadosamente las glándulas del peritoneo tirando suavemente.Coloque las glándulas disecadas en un plato adhesivo no celular con 10 mililitros de HBSS+PS helado. Bajo una campana de cultivo de tejidos, use 10 mililitros de HBSS+PS fresco para lavar cada glándula una vez y colóquelas en un plato adhesivo vacío que no sea celular. A continuación, utilice dos bisturíes estériles para picar finamente las glándulas en fragmentos de un milímetro cúbico.La picado adecuado de las glándulas es esencial para un aislamiento celular eficiente. Junte 20 glándulas e intente realizar este paso dentro de tres a cinco minutos para una viabilidad celular óptima. Utilizando una pipeta serológica de 25 mililitros y 10 mililitros de medio de disociación, recupere el tejido picado de cada placa y transfiera la suspensión en un tubo cónico de 50 mililitros pipeteando al menos cinco veces para desagregar los grumos de tejido.Incubar el tejido a 37 grados centígrados durante una hora con agitación vigorosa y continua. A continuación, centrifugar el tejido digerido a 400 veces g a temperatura ambiente durante cinco minutos. Después de desechar el sobrenadante, use tres mililitros de solución hemolítica para resuspender el tejido e incubar en hielo durante tres minutos.A continuación, con 10 mililitros de medio de lavado número uno, lavar las células. Después de centrifugar el tejido digerido y desechar el sobrenadante, vuelva a suspender el pellet de tejido en 10 mililitros de medio de lavado número dos y coloque las células en placas de cultivo de tejidos de 10 centímetros. Luego incubar los platos a 37 grados centígrados durante una hora.Recupere la suspensión celular en un tubo cónico de 50 mililitros y haga girar el tubo a 400 veces g durante cinco minutos. A continuación, utilice 10 mililitros de la solución quelante de calcio para resuspender el pellet. Después de la centrifugación y después de repetir el lavado, vuelva a suspender el pellet en cinco mililitros de tripsina al 0,25%-EDTA.Después de incubar la muestra, agregue cinco mililitros de solución de dispasa suplementada con un microgramo por mililitro de DNasa uno encima de la solución de tripsina. Para desagregar los grumos, use una punta de pipeta de un mililitro para pipetear hacia arriba y hacia abajo al menos cinco veces e incube la muestra a 37 grados centígrados durante 10 minutos, agitando cada tres minutos. Agregue 10 mililitros de medio de lavado número dos y filtre la solución a través de un colador de celdas de 40 micrómetros en un nuevo tubo cónico de 50 mililitros.A continuación, gira hacia abajo la suspensión de la célula. Para llevar a cabo la purificación celular por FACS, utilice 200 microlitros de medio de lavado número uno para resuspender cada pellet. A continuación, añada 44,5 microlitros de mezcla de anticuerpos, pipetee bien e incube la muestra en la oscuridad sobre hielo durante 30 minutos.Difuminar la suspensión celular en 10 mililitros de medio de lavado número uno y centrifugar la muestra. Vuelva a suspender el pellet de la célula en dos mililitros de solución clasificadora y filtre a través de un tubo FACS del filtro de tapas antes de proceder a la separación FACS de las poblaciones celulares. Use la solución de lavado número uno para lavar las células recuperadas de FACS.Después de eliminar el sobrenadante, use un medio de cultivo mamario 2D para resuspender el pellet de células y la placa de 500 microlitros por pocillo en una placa tratada con colágeno. Siete días después de la inducción de doxiciclina de células LD primarias infectadas con lentivirus, agregue 150 microlitros por pocillo de 05% de tripsina-EDTA a las células e incube a 37 grados centígrados durante 10 minutos. Una vez lavadas y contadas las células, utilizar medio de colonia de memoria, suplementado con dos microgramos por mililitro de doxiciclina para resuspenderlas.A continuación, siembre 1.000 células por pocillo en placas de fijación ultra bajas de 24 pocillos para cultivar YAP que expresan mascarillas como colonias. Para subcultivar y enmascarar, recoja cada muestra y agregue un volumen de 10 a un volumen de HBSS helado, luego incube las muestras en hielo durante una hora para solubilizar la matriz de la membrana basal. Después de centrifugar las colonias, use HBSS helado para lavar las celdas tres veces.A continuación, añadir 05%tripsina-EDTA a las colonias e incubarlas a 37 grados centígrados durante 10 minutos. Pase las colonias a través de una punta de pipeta P1000 10 veces para obtener una suspensión de una sola célula. A continuación, cuente y vuelva a sembrar las células en medio de colonia mamaria sin doxiciclina en placas de fijación ultra bajas de 24 pocillos a una densidad colonogénica de 1.000 células por pocillo.Antes del tercer paso, transfiera y enmascare las colonias en condiciones de cultivo de organoides recuperando las colonias del medio de la colonia mamaria y utilice una matriz de membrana basal reducida al 100% del factor de crecimiento para resuspenderlas. Después de la incubación, cuando la matriz de la membrana basal se ha solidificado, superponga los geles con 500 microlitros del medio organoide mamario. Pase los cultivos recogiendo cada muestra de organoide e incubándolas en un volumen excesivo de HBSS en hielo durante una hora.Luego use HBSS helado para lavar los organoides tres veces. Tripsinice los organoides como se demostró anteriormente en este video y vuelva a sembrar suspensiones unicelulares en una gota de matriz de membrana basal reducida al 100% del factor de crecimiento, luego use 500 microlitros de medio organoide mamario para superponer los geles. Después de lavar el tejido pancreático de ratón digerido de acuerdo con el protocolo de texto, use seis mililitros de medio de recuperación acinar para resuspender cuidadosamente el tejido digerido y dividirlo entre dos pocillos de una placa de cultivo de tejido de seis pocillos.Bajo un microscopio estereoscópico, evalúe cuidadosamente la calidad del aislamiento acinar y elimine cualquier grupo de tejido grande que eventualmente esté presente. Para sembrar acinos pancreáticos primarios, después de incubar los racimos durante dos horas para la recuperación celular, recoja la suspensión de células acinares en un tubo cónico y centrifugue las muestras a 100 veces g y 18 grados centígrados durante cinco minutos. Después de resuspender los acinos en un medio de cultivo acinar, diluya la suspensión con un volumen igual de colágeno de cola de rata neutralizado en una solución, manteniendo los tubos en hielo.Mezcle con cuidado y rápidamente y siembre la suspensión celular en 16 pocillos encima de la almohadilla de colágeno. Para una siembra óptima de acinos pancreáticos, es crucial mantener todos los tubos en hielo antes de enchapar y proceder con rapidez, pero al mismo tiempo, es esencial un pipeteo cuidadoso para evitar la formación de burbujas de aire para crear una matriz de colágeno homogénea. Incubar las células a 37 grados centígrados durante una hora para permitir que se forme un hidrogel.Luego, para inducir organoides pancreáticos, superponga los hidrogeles de colágeno con 500 microlitros de medio de cultivo acinar suplementado con doxiciclina. Para subcultivar los organoides, deseche el medio de cultivo, extraiga cuidadosamente los hidrogeles y transfiéralos a tubos cónicos que contengan cuatro mililitros de solución B de colagenasa I, luego incube los tubos a 37 grados centígrados con agitación vigorosa durante 30 minutos antes de girar las células y eliminar el sobrenadante. Después de intentar tripsinizar las células y eliminar el sobrenadante PBS, use una matriz de membrana basal helada para resuspender la célula y sembrar la suspensión en placas de fijación ultra bajas.Deje que el hidrogel de la matriz de la membrana basal se solidifique incubando las placas a 37 grados centígrados durante 40 minutos y luego cúbralas con medio organoide pancreático. Los conductos crecerán como organoides similares a quistes en siete a 10 días. La activación cuidadosa de las células epiteliales LD mamarias primarias en las tres subpoblaciones que se muestran aquí es esencial para aislar una preparación pura de células LD que están completamente diferenciadas y cuyo crecimiento se detiene completamente cuando se siembran en condiciones de formación de colonias de glándulas mamarias.Por el contrario, cuando se les induce a expresar YAP exógeno, las células LD comienzan a proliferar para formar colonias epiteliales densas fácilmente reconocibles en cultivos en suspensión de matriz de membrana basal al 5%. En condiciones de cultivo de organoides de matriz de membrana basal, las células luminales reprogramadas se autoorganizan en estructuras complejas similares a organoides que se desarrollan alrededor de múltiples lúmenes y se renuevan incluso en ausencia de doxiciclina. Dentro de los cinco a siete días de cultivo en hidrogel 3D a base de colágeno I en presencia de doxiciclina, los acinos pancreáticos diferenciados se convierten fácilmente en grupos similares a conductos o conductos compuestos por una delgada monocapa de células epiteliales que proliferan alrededor de una cavidad central en expansión.La eficiencia de la reprogramación se puede medir fácilmente puntuando el número de racimos en forma de conducto sobre el número total de acinos sembrados. Los yDuctos reprogramados pueden ser conducidos a nivel de una sola célula a condiciones de cultivo de organoides basadas en matrigel mostrando una notable capacidad de autorrenovación incluso en ausencia de expresión endógena de YAP. Hemos detallado dos procedimientos.Uno permitió la reprogramación de células purificadas con FACS a través de vectores lentivirales y un segundo que evita la infección viral y aprovecha la expresión transgénica de YAP. Al intentar la reprogramación de las células mamarias, es importante evitar el uso de un título viral excesivo, ya que esto puede ser perjudicial para la eficiencia de la reprogramación. La estrategia totalmente transgénica es apropiada para los acinos pancreáticos primarios, ya que estos son escasamente susceptibles a la infección lentiviral.También ofrece la misma ventaja que los vectores lentivirales dependientes de doxiciclina para el control de tipo de la expresión génica. Además de los ejemplos demostrados aquí, este protocolo de reprogramación YAP ha demostrado ser exitoso para convertir neuronas diferenciadas en neuronas proliferantes. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo realizar una reprogramación dependiente de YAP para convertir tipos de células diferenciadas de diferentes tejidos adultos en sus correspondientes células madre específicas de tejido.Este procedimiento amplía las estrategias de reprogramación actuales al proporcionar un medio para generar células madre somáticas que pueden tener relevancia para la medicina regenerativa, para el estudio de la madre somática y para la expansión de células madre somáticas in vitro. Tenga en cuenta que la manipulación de la preparación lentiviral puede ser extremadamente peligrosa y, según el nivel de seguridad, siempre se deben adoptar medidas al realizar este procedimiento.

de-novo-generation-of-somatic-stem-cells-by-yaptaz

Research

Investigación

JoVE Journal

Biology

Biología

Este video muestra el procedimiento para generar células madre pluripotentes inducidas mediante lentivirus inducible que expresan Oct4, Sox2, c-Myc y Klf4.

La generación de células iPS a partir de MEFs través de la expresión forzada de Sox-2, Oct-4, c-Myc y Klf4

Un método para generar células madre pluripotentes inducidas (iPSCs) a través de retrovirus mediada por la expresión ectópica de Oct4, Sox2, Klf4 y MYC se describe. Una forma práctica para identificar las colonias de humanos IPSC basadas en la expresión de GFP también se discute.

La reprogramación de células somáticas humanas en células madre pluripotentes inducidas (iPSCs) utilizando el vector retroviral con las buenas prácticas agrarias

Aquí se muestra un protocolo simple y eficaz para la generación de iPSCs humanos de 3-4 ml de sangre periférica utilizando un único vector lentiviral reprogramación. La reprogramación de células de la sangre fácilmente disponibles promete acelerar la utilización de la tecnología de IPSC para hacerla accesible a una comunidad de investigación más amplia.

Generación de las células madre pluripotentes inducidas a partir de sangre periférica mediante el STEMCCA vector lentiviral

Este estudio demuestra la reprogramación de las células somáticas hacia la pluripotencia in vivo sin la generación de teratomas. Utilizamos la inyección hidrodinámica de ADN plásmido en la vena de cola que codifica los factores Yamanka para inducir la reprogramación in vivo de hepatocitos adultos en células de mayor pluripotencia.

En Reprogramación vivo de células somáticas de adultos a Pluripotencia por la sobreexpresión de factores de Yamanaka

Las células madre pluripotentes inducidas (iPSCs) representan una fuente de tejidos específicos del paciente para aplicaciones clínicas y de investigación básica. A continuación, presentamos un protocolo detallado para reprogramar células humanas mononucleares de sangre periférica (PBMNCs) obtenidos a partir de buffy abrigos congelados en CMPI-virales gratis utilizando no integración de plásmidos episomales.

Generación de células madre pluripotentes inducidas a partir de Frozen Buffy Coats utilizando para no integrar episomal plásmidos

Este protocolo describe un método detallado para la generación eficiente de iPSCs libres de integración a partir de células de sangre periférica adultas humanas. Con el uso de cuatro vectores episomales basados en oriP/EBNA para expresar los factores de reprogramación, KLF4, MYC, BCL-XL o OCT4 y SOX2, se pueden obtener miles de colonias de iPSC a partir de 1 mL de sangre periférica.

Generación de Integración libres de células madre pluripotentes inducidas a partir de células mononucleares de sangre periférica humana Utilizando vectores episomales

Células de germen primordiales (PGCs) son precursores comunes de espermatozoides y óvulos. Se especifican PGCs embrionarias humanas de células del epiblasto pluripotentes a través de interacciones de citoquinas. Aquí, describimos un protocolo de 13 días de inducir transcriptomally células humanas que se asemejan a PGCs en la superficie de embryoid cuerpos de células madre pluripotentes de cebada-pluripotencia inducida.

Generación humana Primordial células germinales-como las células en la superficie de cuerpos de Embryoid de pluripotencia cebada inducida por células madre pluripotentes

Este protocolo se generó como un medio para producir organoides cerebrales de una manera simplificada y de bajo costo sin factores de crecimiento exógenos o matriz de membrana de sótano sin dejar de mantener la diversidad de tipos de células cerebrales y muchas características de la organización celular.

Un método autodirigido estático para generar organoides cerebrales a partir de células madre embrionarias humanas

Aquí presentamos un método que combina el uso del borrado epigenético químico con señales relacionadas con la mecanodetección para generar eficientemente células pluripotentes de mamíferos, sin necesidad de transfección génica o vectores retrovirales. Esta estrategia es, por lo tanto, prometedora para la medicina traslacional y representa un avance notable en la tecnología de organoides de células madre.

Una estrategia de dos pasos que combina la modificación epigenética y las señales biomecánicas para generar células pluripotentes de mamíferos

Este artículo describe un procedimiento para producir iTenocitos mediante la generación de células estromales mesenquimales derivadas de iPSC con sobreexpresión combinada de Scleraxis utilizando un vector lentiviral y estiramiento uniaxial a través de un biorreactor 2D.

Generación de iTenocitos derivados de células madre pluripotentes inducidas a través de la sobreexpresión combinada de escleraxis y la tensión uniaxial 2D

Aprende a reprogramar células diferenciadas en progenitoras mediante la expresión transitoria del factor de transcripción YAP. Este método genera células madre específicas de tejido para aplicaciones en medicina regenerativa y estudios de plasticidad celular.

De Novo Generación de células somáticas por YAP/TAZ

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