Detección de Inflammasome activación y muerte celular Pyroptotic en macrófagos derivados de médula ósea murinas

Los objetivos generales de este protocolo son examinar la activación del inflamasoma a nivel de célula única mediante microscopía de fluorescencia y medir la lisis durante la piroptosis mediante un ensayo de liberación de lactato deshidrogenasa o LDH. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo del inflamasoma, como por ejemplo cómo se regula la activación de la caspasa-1. La principal ventaja de estas técnicas es que permiten al usuario examinar múltiples pasos de las vías de activación del inflamasoma y piroptosis.

El encargado de demostrar el procedimiento será Andreas den Hartigh, un científico investigador de mi laboratorio. Comience reemplazando el medio de macrófagos derivados de la médula ósea cebados con LPS sembrados en cubreobjetos de vidrio con 290 microlitros de medio DMEM 5, suplementado con cinco micromolares de nigericina y cinco milimolares de glicina, por pocillo. Regrese la placa de 24 pocillos a la incubadora de cultivos celulares durante 60 minutos a 37 grados centígrados y 5% de dióxido de carbono, agregando 10 microlitros de 30X FAM-YVAD-FMK después de los primeros 15 minutos.

Al final de la incubación, lavar las células con un mililitro de PBS frío por pocillo, tres veces durante cinco minutos por lavado y fijar las células con 250 microlitros de paraformaldehído al 2% por pocillo durante 30 minutos en hielo protegido de la luz, marcando las células con un colorante nuclear de fluorescencia adecuado durante los últimos cinco minutos. Al final de la incubación, lave las células tres veces con PBS frío como se acaba de demostrar y cargue cada portaobjetos con siete microlitros de medio de montaje antidecoloración. Coloque un cubreobjetos en cada portaobjetos y deje que el medio de montaje se endurezca durante la noche antes de sellar los cubreobjetos con esmalte de uñas.

Para obtener imágenes de las células mediante microscopía confocal de fluorescencia, coloque el portaobjetos de control sin tratar en la platina del microscopio y enfoque manualmente las células. Usando la configuración de la tabla de búsqueda del microscopio, ajuste el desplazamiento hasta que no se observe una tinción positiva de la sonda en las células no tratadas. A continuación, utilizando una muestra tratada con nigericina, localice un campo que contenga células que sean positivas y negativas para la tinción de la sonda y ajuste el plano de imagen del canal de la sonda al plano que tenga la mayor intensidad de tinción positiva.

A continuación, ajuste la ganancia hasta que los focos sean visibles en las células con núcleos condensados y obtenga imágenes de cinco campos seleccionados al azar por diapositiva con un aumento total de 100X. Para el análisis inmunofluoroquímico de las células tratadas con nigericina, lavar las células marcadas con prop como se acaba de demostrar e incubar las células en 250 microlitros de solución de fijación y permeabilización por pocillo durante 30 minutos en hielo, protegidas de la luz. Lave los macrófagos tres veces más con tampón de lavado fresco y etiquete las células con 250 microlitros de anticuerpo primario contra una proteína similar a una mota asociada a la ptosis que contiene un dominio de reclutamiento de caspasas C-terminal, o ASC, por pocillo, durante una hora en hielo.

Lave las células al final de la incubación y etiquete las muestras con 250 microlitros del anticuerpo secundario conjugado con colorante de fluorescencia apropiado durante otra hora en hielo, agregando cuatro microlitros de un tinte nuclear de fluorescencia apropiado durante los últimos cinco minutos. Después de lavar las células tres veces en tampón de lavado en frío, monte los cubreobjetos en los portaobjetos con siete microlitros de medio de montaje anti-decoloración, como se ha demostrado, y obtenga imágenes de los macrófagos mediante microscopía confocal de fluorescencia. Para realizar un ensayo de liberación de LDH, agregue 50 microlitros de medio DMEM 5 suplementado con 10 micromolares de nigericina a cada pocillo experimental y 50 microlitros de DMEM 5 a los pocillos de control espontáneos y de lisis al 100% durante 60 minutos a 37 grados Celsius y 5% de dióxido de carbono.

Después de 30 minutos, agregue 10 microlitros de tampón de lisis 10X a los pocillos de control de lisis al 100% y agregue 10 microlitros de medio a los otros pocillos. Al final de la incubación, centrifugar la placa y transferir 50 microlitros de sobrenadante de cada pocillo a una placa transparente de fondo plano. A continuación, agregue 50 microlitros de sustrato recién descongelado y preparado a cada pocillo para una incubación de 30 minutos en la oscuridad, revisando la placa después de 15 minutos para confirmar que la señal no excederá el límite de detección del lector de placas.

Al final de la incubación, agregue 50 microlitros de solución de parada a cada pocillo y mida el OD490 en un lector de placas adecuado para permitir el cálculo del porcentaje de lisis celular por pocillo. Mientras que los macrófagos tipo expuestos a la nigericina demuestran la formación de un foco ASC en la región perinuclear que también contiene Caspasa-1 activa, lo que indica que estas células están sufriendo piroptosis. Mientras que los macrófagos de ratones deficientes en Caspasa-111 también generan un foco ASC, estas células no tienen ninguna Caspasa-1 activa asociada con este foco, como lo indica la ausencia de tinción FAM-YVAD-FMK.

Tampoco están condensados los núcleos de estas células, lo que indica una ausencia de muerte celular piroptótica. Además, un gran porcentaje de macrófagos de tipo salvaje sufren muerte celular después de la exposición a la nigericina, según lo medido por el análisis de liberación de LDH de sus sobrenadantes de cultivo, mientras que los macrófagos deficientes en caspasa-1 no liberan LDH en el sobrenadante, lo que indica que las células aún están intactas. Después de ver este video, debe tener una buena comprensión de cómo visualizar la formación de inflamasomas mediante microscopía de fluorescencia y determinar el nivel de lisis celular midiendo la liberación de LDH.

Este procedimiento puede ser modificado para el uso de otros estímulos inflamatorios o intervenciones que alteren la activación del inflamasoma o la piroptosis.