Preparaciones y protocolos para todo celular parche abrazadera de neuronas Tectal de Xenopus laevis
15 de marzo de 2018
En este artículo discutimos tres preparaciones de cerebro utilizadas para la grabación de abrazadera de parche de células enteras a estudiar el circuito retinotectal de los renacuajos de Xenopus laevis . Cada preparación, con sus propias ventajas específicas, contribuye a la maleabilidad experimental de los renacuajos de Xenopus como modelo para el estudio de la función neuronal del circuito.
El objetivo general de este procedimiento es obtener registros electrofisiológicos de células completas de las neuronas del tectum óptico del renacuajo para aprender sobre su patrón de conectividad durante el desarrollo y, en última instancia, comprender cómo se forman y funcionan los circuitos neuronales. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo del desarrollo neuronal, como cómo cambian las neuronas a lo largo del desarrollo y cómo funcionan los circuitos para dar lugar al comportamiento. La principal ventaja de estas preparaciones es que permiten el registro electrofisiológico de las neuronas del tectum óptico para proporcionar información sobre la función de los circuitos neuronales en desarrollo.
Zhenyu Lui, un estudiante graduado de mi laboratorio, demostrará el procedimiento. Con una pipeta de transferencia de eliminación, mueva el renacuajo anestesiado a una placa de registro de disección que contenga una solución de registro externa. Asegure el renacuajo anestesiado a un bloque de silicona sumergido en el suelo de la placa de grabación de disección.
Para obtener una visión clara del cerebro, retire la piel que recubre el cerebro haciendo una incisión superficial a lo largo de la línea media con una aguja estéril de calibre 25. Filetea el cerebro a lo largo del mismo eje de la línea media insertando la aguja en el tubo neural y tirando suavemente hacia arriba de modo que la parte dorsal del tubo se corte limpiamente mientras se deja intacta la placa del suelo. Para aislar el cerebro, primero use una aguja de calibre 25 para cortar el cerebro posterior.
A continuación, pase suavemente la aguja por debajo del cerebro en dirección caudal a rostral para cortar todo el tejido conectivo lateral y ventral y las fibras nerviosas. A continuación, asegure el cerebro a un bloque de elastómero de silicona colocando un alfiler a través de uno de los bulbos olfativos y otro alfiler a través del cerebro posterior. Esta es la configuración óptima para la grabación de las neuronas tectales.
A continuación, mueva el plato que contiene la preparación de todo el cerebro clavada desde el visor de disección hasta el equipo de electrofisiología. Retire la membrana ventricular con una pipeta de vidrio roto. Para activar directamente los axones RGC, baje suavemente un electrodo estimulante bipolar sobre el quiasma óptico de modo que se forme una pequeña abolladura en el tejido.
El electrodo estimulante bipolar debe ser rostral y casi adyacente al ventrículo medio grande donde se encuentra el quiasma óptico. El electrodo bipolar es accionado por un estimulador de pulsos que permite controlar con precisión la fuerza de la estimulación. Para preparar el corte horizontal de cerebro, comience con la preparación de todo el cerebro.
A continuación, utilice una cuchilla de afeitar para extirpar el cuarto más lateral de un lado de un tectum óptico. Este corte se realiza paralelo al plano caudal rostral. Después, vuelva a fijar el cerebro al lado del elastómero de silicona con el lado cortado hacia arriba para que se pueda acceder directamente al somata y al neuropilo para el registro y la superficie ventricular del cerebro en dirección opuesta al bloque de elastómero de silicona para que se pueda colocar un electrodo bipolar en el quiasma óptico.
A continuación, realice la pinza de parche de toda la célula o el registro de potencial de campo local. Aquí está el esquema que muestra la configuración de una preparación horizontal de corte de cerebro. Tenga en cuenta que, aunque el electrodo estimulante permanece en el quiasma óptico, la pipeta de registro ahora está posicionada para acceder a las células a través de todas las capas tectales expuestas por la preparación horizontal del corte de cerebro.
Se trata de una respuesta evocada por RGC de una neurona que reside en la capa superficial del tectum. En esta figura, los potenciales de campo registrados a través del neuropilo y las densidades de la fuente de corriente convertida se muestran mediante un gráfico de imagen. Una vez dominada, esta técnica se puede realizar en 10 minutos y, por lo general, durante un máximo de tres o cuatro horas.
Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo realizar la preparación de cortes de cerebro completos y horizontales para grabaciones de células completas con el fin de cuantificar las propiedades eléctricas de las neuronas tectales y su conectividad.
Vea la transcripción completa y acceda a miles de videos científicos
Descripción general
Este estudio explora técnicas de registro con microelectrodo de parche en células completas para investigar el circuito retinotectal en renacuajos de Xenopus laevis. Mediante el uso de diferentes preparaciones cerebrales, la investigación tiene como objetivo comprender los patrones de conectividad de las neuronas en el tectum óptico de los renacuajos durante el desarrollo y la función general de los circuitos neuronales.
Componentes Clave del Estudio
Área de la ciencia
- Neurociencia
- Electrofisiología
- Circuitos neuronales
Antecedentes
- Investigación de cómo se forman y funcionan los circuitos neuronales en organismos en desarrollo.
- El circuito retinotectal es crucial para el procesamiento visual en los anfibios.
- Las larvas de Xenopus laevis sirven como un modelo valioso para estudiar la conectividad neuronal.
- Los registros de célula completa proporcionan información detallada sobre la actividad neuronal.
Objetivo del estudio
- Comprender los patrones de conectividad entre las neuronas en el tectum óptico.
- Analizar cómo cambian las neuronas durante el desarrollo.
- Explorar cómo los circuitos neuronales contribuyen al comportamiento.
Métodos Utilizados
- Se utilizaron métodos de registro por parche en células completas para las grabaciones electrofisiológicas.
- El modelo biológico implicó cerebros de renacuajo diseccionados para estudiar neuronas del tectum óptico.
- No se mencionaron flujos de trabajo de multiómica.
- Los pasos específicos incluyeron inmovilizar al renacuajo, aislar el cerebro y realizar grabaciones dirigidas.
- Los métodos permiten realizar grabaciones dentro de un período crítico de 10 minutos, que generalmente duran varias horas.
Resultados principales
- Los preparativos facilitaron con éxito el registro de la actividad neuronal en el tectum.
- Se observaron cambios electrofisiológicos indicativos de conectividad neuronal.
- Los resultados provocaron discusiones sobre las implicaciones funcionales del circuito retinotectal.
- Los hallazgos contribuyen a comprender la circuitería neuronal en desarrollo.
Conclusiones
- Esta investigación demuestra métodos eficaces para estudiar la conectividad neural en cerebros de renacuajos en desarrollo.
- El estudio mejora la comprensión de la función de los circuitos neuronales durante el desarrollo.
- Los resultados tienen implicaciones más amplias para examinar los procesos neurológicos y los comportamientos en anfibios.
Preguntas frecuentes
Relevancia Ejecutiva para la Industria
El registro mediante parche de célula completa en renacuajos de Xenopus laevis permite un análisis de alta resolución de la formación y función de los circuitos neuronales, proporcionando información mecanicista sobre la conectividad sináptica y la excitabilidad neuronal durante el desarrollo. Este enfoque facilita la validación de dianas en neurociencia al permitir la medición directa de las respuestas neuronales a estímulos definidos, como la actividad evocada por células ganglionares de la retina en el tectum óptico. La adaptabilidad del método en preparaciones in vivo, cerebro completo y cortes horizontales mejora la reproducibilidad y escalabilidad para la reducción de riesgos preclínicos de dianas en desarrollo neurológico.
Aplicaciones Estratégicas en I+D de Biotecnología Farmacéutica
Descubrimiento Temprano y Validación de Blancos
- Valor científico: Permite la evaluación de hipótesis terapéuticas mediante la cuantificación de las respuestas neuronales a estímulos sensoriales, aclarando la conectividad funcional en circuitos en desarrollo.
- Valor operativo: Apoya la reducción de riesgos biológicos mediante lecturas electrofisiológicas directas de la actividad neuronal, reduciendo la ambigüedad en la participación del blanco.
- Valor predictivo: Facilita la selección de carteras al vincular perturbaciones genéticas o farmacológicas con cambios medibles en la excitabilidad neuronal tectal y en la integración sináptica.
Desarrollo de ensayos y cribado
- Listo para el ensayo: Prepara sistemas biológicos validados para la selección de compuestos posteriores mediante el establecimiento de preparaciones neuronales estables y registrables con propiedades definidas de estímulo-respuesta.
- Resultados cuantitativos: Genera mediciones electrofisiológicas como corrientes postsinápticas y potenciales de campo, permitiendo el análisis de dosis-respuesta y la cuantificación del efecto de los compuestos.
- Reutilización de la plataforma: La preparación de cortes horizontales del cerebro permite el registro en todas las capas tectales, aumentando la capacidad de procesamiento y la consistencia en sesiones experimentales repetidas.
Investigación Translacional y Preclínica
- Relevancia para enfermedades: Modela procesos neurodesarrolladores relevantes para trastornos que implican malformación de circuitos, favoreciendo la exploración traslacional de biomarcadores.
- Continuidad preclínica: Conecta el descubrimiento y la validación al permitir el registro consistente de la función neuronal a lo largo de puntos temporales del desarrollo.
- Decisiones ajustadas al riesgo: Apoya criterios de avance/no avance basados en fenotipos electrofisiológicos, reduciendo el riesgo de fracaso en fases avanzadas de programas neurodesarrolladores.
Integración de la tubería y flujo de trabajo
El método se integra en los flujos de trabajo de descubrimiento temprano al proporcionar una validación funcional de los objetivos neuronales antes de la optimización del fármaco líder, cuyos resultados informan tanto la selección del objetivo como la comprensión mecanicista.
- Biología del Descubrimiento: Apoya la comprobación de hipótesis y la aclaración de vías al registrar respuestas evocadas de neuronas tectales tras la estimulación de axones de células ganglionares de la retina.
- Selección: Permite la estandarización de ensayos mediante preparaciones reproducibles de cerebro completo y cortes, que producen lecturas electrofisiológicas cuantificables para la selección de compuestos.
- Análisis: Proporciona mediciones cuantitativas de variables dependientes, como amplitudes de corriente y latencias, facilitando la comparación entre condiciones experimentales.
- Investigación Traducional: Se conecta con la validez preclínica al mantener propiedades del circuito relevantes para la enfermedad a través de distintas preparaciones, apoyando la alineación de biomarcadores.
- Reutilización Empresarial: Establece una plataforma electrofisiológica reutilizable adaptable a múltiples contextos experimentales, reduciendo el desarrollo metodológico redundante.
Impacto Operativo y Empresarial
- Valor científico: Aumenta la confianza predictiva en la validación de objetivos al reducir la ambigüedad mecanicista mediante la grabación neuronal directa.
- Valor operativo: Mejora la reproducibilidad y la estandarización entre laboratorios mediante protocolos definidos de preparación para métodos in vivo, cerebro completo y cortes.
- Valor estratégico: Mejora la eficiencia del capital al permitir la detección temprana de compuestos ineficaces, reduciendo la inversión en objetivos no viables.
- Impacto en la cartera: Informa decisiones de avance ajustadas al riesgo mediante la vinculación de resultados electrofisiológicos con la función a nivel de circuito.
Consideraciones de Implementación
- Requiere experiencia en electrofisiología y técnicas de disección microquirúrgica para una preparación cerebral consistente.
- Depende de soluciones de registro extracelular estables y equipo de estimulación funcional para obtener respuestas evocadas confiables.
- Necesita una estandarización entre equipos de los parámetros del estímulo y de la configuración de registro para garantizar la comparabilidad de los datos.
- La adaptación entre sistemas modelo puede requerir ajustes en los métodos de disección y siembra según el tamaño y la accesibilidad del cerebro.
- Las limitaciones prácticas incluyen tasas de éxito dependientes del operador y la estabilidad de la preparación durante sesiones de registro prolongadas.
