Los extractos de la determinación de la especificidad de la proteasa en el tejido de ratón por espectrometría de masas MALDI-TOF: manipulando PH para causar cambios de la especificidad

El objetivo general de este experimento es determinar la especificidad de la proteasa en múltiples extractos crudos. Este método puede ayudar a responder preguntas clave para determinar la especificidad de la proteasa. La principal ventaja de esta técnica es que puede identificar la especificidad de la proteasa de múltiples muestras en parlay.

Muestras de tejido pulmonar frío obtenidas de ratones machos ICR en hielo. Homogeneizar las muestras a 20.000 RMP durante 30 segundos en una batidora. Repita este paso hasta que las muestras estén completamente homogéneas.

No homogeneizar durante más de un minuto de forma continuada para evitar un aumento de la temperatura. Transfiera 1.000 microlitros del homogeneizado a un tubo de 1,5 mililitros y centrifugue durante cinco minutos a 10.000 veces G a cuatro grados centígrados. Transfiera 500 microlitros del sobrenadante a un nuevo tubo de plástico de 1,5 mililitros.

Utilice 10 microlitros de la muestra para determinar la concentración de proteína. Utilizando métodos, como el ensayo de ácido bicinconínico o el ensayo de Bradford. Para evitar la congelación, agregue 80% de glicerol a las muestras para obtener una concentración final de 50% de glicerol.

Para aclarar la diferencia en la especificidad de la proteasa en función del pH, utilice tampones de digestión ajustados a pH tres, cinco, siete y nueve. En 890 microlitros de un tampón de digestión, agregue 10 microlitros de 0,1 microgramos por microlitro o tripsina TPCK, 0,1 microgramos por microlitro de proteasa V8 de Staphylococcus aureus o 10 microgramos por microlitro de extractos de tejidos. Preparar controles negativos inactivando la proteasa en extractos de tejidos por incubación y agua hirviendo durante 10 minutos.

A continuación, agregue 10 microlitros de sustratos de etiqueta de biotina MNO a las muestras e incube durante tres horas a 37 grados centígrados para digerir. Después de la incubación, detenga la digestión de los sustratos con agua hirviendo durante 10 minutos. Centrifugar los sustratos digeridos durante cinco minutos a 10.000 veces G a cuatro grados centígrados.

Transfiera el sobrenadante a un nuevo tubo de 1,5 mililitros. Añadir 50 mililitros de perlas de estreptavidina sefarosa al 50% en un tampón tris molar, que contiene 0,1% de éter de polioxietileno octilfenil. Use papel de prueba de pH para asegurarse de que la solución tenga alrededor de pH nueve.

Es importante ajustar el pH adecuado a nueve o más. La aminobiotina no puede morder un cordón a menos que tenga un pH de nueve o superior. Si el pH de la solución es bajo, ajústelo a aproximadamente nueve pH agregando más tampón.

Además, se puede agregar un tampón molar de tris para aumentar el pH si es necesario. Incubar la suspensión durante la noche a cuatro grados centígrados con una mezcla suave continua en una rueda giratoria para unir los sustratos marcados con biotina MNO a la estreptavidina. Las perlas deben permanecer suspendidas durante toda la incubación.

Al día siguiente, centrifugar las muestras durante un minuto a 10.000 veces G a cuatro grados centígrados. Después de eliminar el sobrenadante, lave las perlas agregando 1,000 microlitros de un tampón de lavado. A continuación, incubar durante 10 minutos a cuatro grados centígrados con una mezcla suave continua en un rotador.

Centrifugar las perlas durante un minuto a 10.000 veces G a cuatro grados centígrados. Retire el sobrenadante y repita este lavado cuatro veces. A continuación, agregue 100 microlitros de ácido trifluoroacético al 0,2% a las perlas.

Use papel de prueba de pH para asegurarse de que la solución esté por debajo de pH dos. Si el pH de la solución es alto, ajuste el pH por debajo de dos añadiendo ácido trifluoroacético al 1%. Incubar la suspensión durante 30 minutos a temperatura ambiente con una mezcla suave continua en una rueda giratoria.

Después de centrifugar las perlas como antes, transfiera el sobrenadante a un nuevo tubo de 1,5 mililitros. Pipetea 20 microlitros de acetonitrilo sobre una resina C18 para activarlo. Retire el acetonitrilo usado y repita este paso de activación tres veces.

A continuación, equilibra la resina C18 con 20 microlitros de ácido trifluoroacético al 0,1%. Retire el eluyente y repita este paso de equilibrio tres veces. Para cargar las muestras, únelas a la resina con una pipeta.

Lavar la resina con 20 microlitros de ácido trifluoroacético al 0,1%. Repita este paso cinco veces. Eluir las muestras con tres microlitros de acetonitrilo al 60% en ácido trifluoroacético al 0,1%.

Pipetear el eluyente en una placa objetivo para la espectrometría de masas MALDI-TOF. Agregue inmediatamente la solución de CHCA, saturada en acetonitrilo al 50% en ácido trifluoroacético al 0,1%. Cristalizar la mezcla mediante secado al aire.

Adquiera espectros de masas de muestras, de acuerdo con el protocolo del fabricante del instrumento, prestando mucha atención a los espectros de masas de 700 a 900 daltons para la forma escindida de los sustratos de etiquetas de biotina. Aquí se muestran los espectros de masas de los sustratos sintéticos. Los picos correspondientes al peso molecular del precursor se detectaron entre 850 y 1.050.

Los fragmentos escindidos se detectan en el rango de 700 a 850. A continuación se muestran los espectros de los sustratos marcados con biotina MNO tratados con tripsina TPCK. Los picos 839.81 dalton y 796.76 dalton corresponden a los fragmentos escindidos del extremo C de lisina y arginina respectivamente.

Aquí se muestran los espectros de masas de sustratos sintéticos digeridos con proteasa V8. Los picos 769,78 dalton y 755,62 dalton corresponden a los fragmentos escindidos del extremo C del ácido glutámico y del ácido aspártico, respectivamente. Aquí se muestran los espectros de los sustratos tratados con un extracto de tejido pulmonar en diversas condiciones de pH.

En la condición ácida, a pH cinco, el peso molecular de un fragmento escindido fue de 770,13 daltons y 826,66 daltons, lo que indica una escisión en el extremo C del ácido glutámico y el triptófano. En la condición neutra y básica, a pH siete y nueve, el peso molecular de un fragmento escindido se incrementó en el pico de 767 daltons y 840 daltons, lo que indica que se escindió en el extremo C de la arginina y la lisina. Por el contrario, los picos de ácido glutámico y triptófano disminuyeron.

Además, este método no puede detectar fragmentos escindidos con extractos inactivados. Una vez dominada, esta técnica se puede realizar en dos días si se realiza correctamente, a excepción de la síntesis de sustrato. Además, una vez sintetizado el sustrato, se puede medir en varias muestras. ¿Por qué?

Al intentar este procedimiento, es importante recordar que debe operar con el pH del tampón, alrededor de nueve. Generalmente, la reacción del complejo de amino biotina avidina. Siguiendo este procedimiento, es posible cuantificar la actividad enzimática mediante la realización de un CMS.

Este método permitirá a los investigadores en el campo de los proteones allanar el camino para explorar la expresión de proteasas en varias condiciones.