Name: Los extractos de la determinación de la especificidad de la proteasa en el tejido de ratón por espectrometría de masas MALDI-TOF: manipulando PH para causar cambios de la especificidad (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-05-25T13:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 47 s
Description: Aprenda a determinar la especificidad de proteasas en extractos de tejido de ratón mediante espectrometría de masas MALDI-TOF. Este protocolo permite analizar múltiples muestras simultáneamente para estudiar actividad enzimática.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Este trabajo fue apoyado en parte por la beca de investigación Universidad Farmacéutica Nihon Nihon Pharmaceutical University (2016) y el MEXT KAKENHI concesión número JP17854179.

Protocolos experimentales animales fueron aprobados por el Comité de ética de la Universidad de Nihon en industria farmacéutica y a cabo conforme a las directrices para el cuidado y uso de animales de laboratorio de la Universidad de Nihon Pharmaceutical. El protocolo ha sido ajustado para los extractos de tejidos derivados de ratones ICR. Ratones ICR fueron comprados de Nippon SLC Ltd. (Shizuoka, Japón)
1. preparación del sustrato marcado con Iminobiotin
El sustrato pasa por síntesis en fase sólida usando grupo 9-fluorenylmethyloxycarbonyl (Fmoc)-protegidas aminoácidos como se describe a continuación11. Utilizar tabla 2 para determinar el Fmoc-compuesto utilizado, dependiendo de la etapa de síntesis y aminoácido deseado.
<ol><li>Swill 0,2 g de resina de Fmoc-NH-SAL con 10 mL de N, N-dimetilformamida (DMF) en una columna de síntesis.</li>
	<li>Añadir 5 mL de piperidina de 30% en DMF. Roca de la solución durante 10 minutos a unirse el grupo Fmoc.</li>
	<li>
Compruebe Fmoc escote con el ácido Trinitrobencenosulfónico (TNBS) prueba12: Añadir 10 μl de 1% tubo de TNBS en DMF y 10 μl de diisopropylethylamine (DIPEA) a un tubo de vidrio 10 x 75 mm2 , entonces la transferencia de una pequeña cantidad de resina del cristal. La resina de Fmoc-hendido debe desarrollar un color naranja.
	<ol>
<li>Repita los pasos 1.3 1.2 Si este resultado es negativo.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Lavar la resina tres veces con 5 mL de DMF.</li>
	<li>
Añada 5 mL de DMF conteniendo 0,3 mmol de Fmoc-compuestos enumerados en la tabla 2 (comenzando con el compuesto usado en la etapa 1), 0,3 mmol de hexafluorofosfato de O-(6-Chloro-1H-benzotriazol-1-yl)-N,N,N',N'-tetramethyluronium (HCTU), 0,3 mmol de 1- Hidroxi-1H-benzotriazol, monohidrato (TOHB) y 0,6 mmol de diisopropylethylamine (DIPEA). La solución por 30 min acoplar con la resina de la roca.
	<ol>
<li>Compruebe este paso con la prueba TNBS. Si el resultado es positivo, significa que la reacción no ha progresado lo suficiente y este paso debe repetirse.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Lavar la resina tres veces con 5 mL de DMF.</li>
	<li>Repita la reacción de elongación repitiendo los pasos 1.2-1.6, cambiando el Fmoc-compuesto utilizado en el paso 1.5 según tabla 2.</li>
	<li>Añadir 1 mL de agua de 2.5%, 1% Triisopropilsilano (TIS) y 2.5% Etanoditiol (EDT) de ácido trifluoroacético para unirse a péptidos de los grupos de resina y protección. Roca la solución de 60 minutos.</li>
	<li>Filtrar y recoger el filtrado en un tubo de 50 mL.</li>
	<li>Añadir 40 mL de etanol frío dietílico y tienda durante la noche a-20 ° C.</li>
	<li>Centrifugar a 4.000 x g a-20 ° C para 30 minutos recoger el diábolo.</li>
	<li>Utilice un desecador durante 3 horas para eliminar el éter dietílico.</li>
	<li>Añadir 1 mL de acetonitrilo 50% agua y disolver los péptidos crudos. Liofilizar la solución para eliminar el ácido trifluoroacético. Repita este paso varias veces.</li>
	<li>
Purificar los péptidos usando una columna de cartucho C18.
	<ol>
<li>Activar la resina en la columna de cartucho de C18 con 3 mL de acetonitrilo (ACN).</li>
		<li>Equilibrar con 5 mL de 5% ACN, 0.1% TFA en H2O.</li>
		<li>Cargar el crudo péptidos sintéticos en la columna de cartucho C18.</li>
		<li>Lavar con 10 mL de 5% ACN, 0.1% TFA en H2O.</li>
		<li>Eluir las muestras con 3 mL de 60% ACN, 0.1% TFA en H2O.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Compruebe los péptidos mediante la medición de su peso molecular mediante espectrometría de masas MALDI-TOF.
	<ol>
<li>Pipeta 1 μl del eluyente en un plato blanco. Inmediatamente añadir saturado solución de (CHCA) ácido α-ciano-4-hidroxicinámico en 50% acetonitrilo en 0,1% de ácido trifluoroacético</li>
		<li>Cristalizar la mezcla por secado al aire.</li>
		<li>Adquisición de espectros de masas de las muestras según protocolo del fabricante del instrumento.<ol>
<li>Configurar manualmente el espectrómetro de masas MALDI-TOF para un positivo reflejan el modo.</li>
			<li>Calibrar el espectrómetro de masas con CHCA, bradicinina fragmento 1-7 (peso molecular de monoisotopic = Da 756.3997) y angiotensina II (peso molecular de monoisotopic = Da 1,045.5423).</li>
			<li>Adquisición de los espectros de masas de péptidos sintéticos y entonces evaluar comparando con el peso molecular teórico.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. preparación de extractos de tejido
<ol><li>Anestesiar ratones ICR machos en una cámara de inhalación isoflurane y verificar la profundidad de la anestesia mediante pellizco del dedo del pie. Eutanasia a los ratones por dislocación cervical.</li>
	<li>Con unas tijeras, hacer una incisión abdominal de línea media a través de la piel que se extiende hasta el proceso del xiphoid.</li>
	<li>Corte a través del diafragma y recoger todo el tejido pulmonar. Cortar el tejido en trozos pequeños.</li>
	<li>Lavar el tejido tres veces con solución salina tamponada con Tris de helado 50 mM (pH 7,4).</li>
	<li>Peso de los tejidos y el traslado de aproximadamente 100 mg de los tejidos a un tubo de vidrio 12 x 75 mm2 .</li>
	<li>Agregar 0,3 mL de la solución de extracción (50 mM Tris-buffer, pH 7.4, que contiene éter de Octylpheny de poli (oxyethylene) 0.1%).</li>
	<li>
Homogeneizar las muestras de tejido pulmonar utilizando un homogeneizador de la mezcla.
	<ol>
<li>Enfriar las muestras en hielo.</li>
		<li>Homogeneizar las muestras a 20.000 rpm durante 30 s en licuadora. Repita este paso hasta que las muestras son totalmente homogéneas. Nota: No homogeneizar durante más de 1 minuto de forma continua, para evitar un aumento de temperatura.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Transferencia 1.000 μl del homogeneizado en un tubo de 1.5 mL y centrifugar durante 5 min a 10.000 x g a 4 ° C.</li>
	<li>Transferir 500 μl del sobrenadante a un tubo nuevo de plástico de 1,5 mL.</li>
	<li>Utilice 10 μl de la muestra para determinar la concentración de proteína, utilizando métodos como el bicinchoninic ácido (BCA) o el método de Coomassie brillante azul (CBB).</li>
	<li>Para evitar la congelación, añadir glicerol al 80% de las muestras para una concentración final de glicerol al 50%.</li>
	<li>Almacenar las muestras a-80 ° C hasta su uso posterior.</li>
</ol>3. digestión de los sustratos en modelo proteasa y extractos de tejido
<ol><li>
Añadir 10 μl de 0,1 μg/μl de cetona de clorometil N-tosyl-L-fenilalanina (TPCK)-tripsina, 0,1 μg/μl de proteasa de Staphylococcus aureus V8 o 10 μg/μl de extractos de tejido en 890 μl de un buffer de digestión.
	<ol>
<li>Para aclarar la diferencia en la especificidad de la proteasa dependiendo del pH, use tampones ajustados a pH 3, 5, 7 y 9. La composición del buffer de digestión se muestra en la tabla 3.</li>
		<li>Llevar a cabo un control negativo con proteasa inactiva en los extractos de tejido, preparados por la incubación en agua hirviendo (o calentamiento a 100 ° C) durante 10 minutos.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Añadir 10 μl de sustratos marcados iminobiotin (disuelto en dimetil sulfóxido (DMSO), concentración final = 100 pmol/10 μl).</li>
	<li>Incubar durante 3 horas a 37 ° C para digerir sustratos marcados iminobiotin.</li>
	<li>Después de la incubación, detener la digestión de los sustratos con agua hirviendo (o por calentamiento a 100 ° C) durante 10 minutos.</li>
	<li>Centrifugue los sustratos digeridos por 5 min a 10.000 x g a 4 ° C.</li>
	<li>Transferir el sobrenadante a un tubo nuevo de 1,5 mL.</li>
</ol>4. purificación del substrato marcado con Iminobiotin
<ol><li>
Añadir 50 μl de estreptavidina 50% sepharose granos que contiene 0.1% poly(oxyethylene) Octylpheny éter de 1 M Tris-buffer (pH 9).
	<ol>
<li>Utilice papel de prueba pH para asegurar que la solución es alrededor de pH 9. Si el pH de la solución es bajo, ajustar a pH aproximadamente 9 añadiendo que contiene 0.1% poly(oxyethylene) Octylpheny éter de 1 M Tris-buffer (pH 9). Este paso es importante, ya que implica la Unión del sustrato a estreptavidina marcada con iminobiotin.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Incubar durante una noche a 4 ° C con mezcla suave continuo en una rueda de rotor para enlazar los sustratos marcados con iminobiotin a la estreptavidina. Los granos deben permanecer suspendidos a lo largo de la incubación.</li>
	<li>Centrifugar por 1 min a 10.000 x g a 4 ° C. Eliminar el sobrenadante.</li>
	<li>
Lavar los granos cinco veces como sigue:
	<ol>
<li>Añadir 1.000 μl de un buffer de lavado (50 mM Tris-buffer, pH 9) a los granos.</li>
		<li>Lavado durante 10 min a 4 ° C con mezcla suave continuo en una rueda de rotor. Los granos deben permanecer suspendidos a lo largo de la incubación.</li>
		<li>Centrifugar por 1 min a 10.000 x g a 4 ° C y eliminar el sobrenadante.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Añada 100 μl del 0.2% de ácido trifluoroacético para los granos.
	<ol>
<li>Utilice papel de prueba pH para asegurar que la solución está por debajo de pH 2. Si el pH de la solución es alto, ajustar el pH a continuación 2 agregando 1% de ácido trifluoroacético.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Incubar durante 30 min a temperatura ambiente con mezcla suave continuo en una rueda de rotor.</li>
	<li>Centrifugar por 1 min a 10.000 x g a 4 ° C, y luego transferir el sobrenadante a un tubo nuevo de 1,5 mL.</li>
</ol>5. muestra preparación y desorción láser asistida por matriz/ionización tiempo de vuelo espectrometría de masas (MALDI-TOF espectrometría de masa)
Nota: Todas las soluciones en los siguientes pasos deben ser preparadas con cromatografía líquida de alta resolución (HPLC)-grado o aminoácido secuencia-grade del agua.
<ol><li>Pipetear 500 μl de acetonitrilo en una resina C18 para activarlo. Retire el acetonitrilo utilizado. Repita este paso tres veces.</li>
	<li>Equilibre la resina C18 con 100 μl de 0,1% de ácido trifluoroacético. Retire el eluyente. Repita este paso tres veces.</li>
	<li>Para cargar las muestras, las muestras se unen a la resina con ayuda de una pipeta.</li>
	<li>Lavar la resina con 20 μl de 0,1% de ácido trifluoroacético. Repita este paso cinco veces.</li>
	<li>Eluir las muestras con 3 μl de 60% de acetonitrilo en 0,1% de ácido trifluoroacético. Pipeta el eluyente en un plato blanco para espectrometría de masas MALDI-TOF. Añada inmediatamente saturado solución de (CHCA) ácido α-ciano-4-hidroxicinámico en 50% acetonitrilo en 0,1% de ácido trifluoroacético.</li>
	<li>Cristalizar la mezcla por secado al aire.</li>
	<li>
Adquisición de espectros de masas de las muestras según protocolo del fabricante del instrumento.
	<ol>
<li>Configurar manualmente el espectrómetro de masas MALDI-TOF para un positivo reflejan el modo.</li>
		<li>Calibrar el espectrómetro de masas con CHCA, bradicinina fragmento 1-7 (peso molecular de monoisotopic = Da 756.3997) y angiotensina II (peso molecular de monoisotopic = Da 1,045.5423).</li>
		<li>Adquisición de los espectros de masas de las muestras, prestando mucha atención a los espectros de masas de 700 a 900 Da para la forma hendida de los substratos marcados con biotina.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Identificar los picos detectados utilizando la tabla 1. Detección del peso molecular apropiado indica escote en el C-terminal del aminoácido correspondiente.</li>
</ol>

<ol><li>Neurath, H., Walsh, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+proteolytic+enzymes+in+biological+regulation+%28a+review%29%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Role of proteolytic enzymes in biological regulation (a review).</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 73 (11), 3825-3832 (1976).</li>
<li>Surinov, B. P., Manoilov, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determination+of+the+activity+of+proteolytic+enzymes+by+means+of+azocasein%5BTitle%5D)+AND+%22Vopr+Med+Khim%22%5BJournal%5D)">Determination of the activity of proteolytic enzymes by means of azocasein.</a> Vopr Med Khim. 11 (5), 55-58 (1965).</li>
<li>Fernandez-Resa, P., Mira, E., Quesada, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+detection+of+casein+zymography+of+matrix+metalloproteinases%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Biochem%22%5BJournal%5D)">Enhanced detection of casein zymography of matrix metalloproteinases.</a> Anal Biochem. 224 (1), 434-435 (1995).</li>
<li>Erlanger, B. F., Kokowsky, N., Cohen, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+preparation+and+properties+of+two+new+chromogenic+substrates+of+trypsin%5BTitle%5D)+AND+%22Arch+Biochem+Biophys%22%5BJournal%5D)">The preparation and properties of two new chromogenic substrates of trypsin.</a> Arch Biochem Biophys. 95, 271-278 (1961).</li>
<li>Smith, R. E., Bissell, E. R., Mitchell, A. R., Pearson, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+photometric+or+fluorometric+assay+of+proteinases+using+substrates+containing+7-amino-4-trifluoromethylcoumarin%5BTitle%5D)+AND+%22Thromb+Res%22%5BJournal%5D)">Direct photometric or fluorometric assay of proteinases using substrates containing 7-amino-4-trifluoromethylcoumarin.</a> Thromb Res. 17 (3-4), 393-402 (1980).</li>
<li>Latt, S. A., Auld, D. S., Vallee, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescende+determination+of+carboxypeptidase+A+activity+based+on+electronic+energy+transfer%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Biochem%22%5BJournal%5D)">Fluorescende determination of carboxypeptidase A activity based on electronic energy transfer.</a> Anal Biochem. 50 (1), 56-62 (1972).</li>
<li>Timmer, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Profiling+constitutive+proteolytic+events+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+J%22%5BJournal%5D)">Profiling constitutive proteolytic events in vivo.</a> Biochem J. 407 (1), 41-48 (2007).</li>
<li>Biniossek, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+protease+specificity+by+combining+proteome-derived+peptide+libraries+and+quantitative+proteomics%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Identification of protease specificity by combining proteome-derived peptide libraries and quantitative proteomics.</a> Mol Cell Proteomics. 15 (7), 2515-2524 (2016).</li>
<li>Yamamoto, H., Saito, S., Sawaguchi, Y., Kimura, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+protease+specificity+using+biotin-labeled+substrates%5BTitle%5D)+AND+%22Open+Biochem+J%22%5BJournal%5D)">Identification of protease specificity using biotin-labeled substrates.</a> Open Biochem J. 11, 27-35 (2017).</li>
<li>Hofmann, K., Wood, S. W., Brinton, C. C., Montibeller, J. A., Finn, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Iminobiotin+affinity+columns+and+their+application+to+retrieval+of+streptavidin%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Iminobiotin affinity columns and their application to retrieval of streptavidin.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 77 (8), 4666-4668 (1980).</li>
<li>Merrifield, R. B. <a target="_blank" href="https://pubs.acs.org/doi/abs/10.1021/ja00897a025">Solid Phase Peptide Synthesis. I. The synthesis of a tetrapeptide.</a> J. Am. Chem. Soc. 85, 2149-2154 (1963).</li>
<li>Hancock, W. S., Battersby, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+micro-test+for+the+detection+of+incomplete+coupling+reactions+in+solid-phase+peptide+synthesis+using+2%2C4%2C6-trinitrobenzenesulphonic+acid%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Biochem%22%5BJournal%5D)">A new micro-test for the detection of incomplete coupling reactions in solid-phase peptide synthesis using 2,4,6-trinitrobenzenesulphonic acid.</a> Anal. Biochem. 71, 260-264 (1976).</li>
<li>Marttila, A. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recombinant+NeutraLite+avidin%3A+A+non-glycosylated%2C+acidic+mutant+of+chicken+avidin+that+exhibits+high+affinity+for+biotin+and+low+non-specific+binding+properties%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Lett%22%5BJournal%5D)">Recombinant NeutraLite avidin: A non-glycosylated, acidic mutant of chicken avidin that exhibits high affinity for biotin and low non-specific binding properties.</a> FEBS Lett. 467 (1), 31-36 (2000).</li>
<li>Gravel, R. A., Lam, K. F., Mahuran, D., Kronis, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+of+human+liver+propionyl-CoA+carboxylase+by+carbon+tetrachloride+extraction+and+monomeric+avidin+affinity+chromatography%5BTitle%5D)+AND+%22Arch+Biochem+Biophys%22%5BJournal%5D)">Purification of human liver propionyl-CoA carboxylase by carbon tetrachloride extraction and monomeric avidin affinity chromatography.</a> Arch Biochem Biophys. 201 (2), 669-673 (1980).</li>
</ol>

Los autores no declaran conflicto de intereses.

Este protocolo utiliza la espectrometría de masas MALDI-TOF para identificar la especificidad de la proteasa en muestras de crudo derivados de extractos de tejido y puede fácilmente ampliarse para el procesamiento de las muestras múltiples. En particular, manipulamos pH para causar un cambio en la especificidad de sustrato.
Se utilizó el método de (ABC) complejo avidina-biotina, que ha sido ampliamente utilizado en Bioquímica debido a su especificidad de Unión, en nuestro protocolo. Debido a l...

Proteasas regulan procesos fisiológicos por unirse a las proteínas, y el inicio de la actividad de la proteasa en momentos concretos y lugares es regulada1. Por lo tanto es importante identificar la expresión y actividad de los tejidos que están reguladas localmente y para desarrollar un nuevo método para detectar las proteasas. El método propuesto en este estudio tiene como objetivo identificar la especificidad de la proteasa en paralelo a la detección de las proteasas.
Existen algunos métodos para detectar la especificidad de la proteasa. El método de azocasein es bien sabido para su uso en la detección de las proteasas2 pero está limitado en su capacidad para obtener más información. Zymography es otro método de detección integral de proteasa que puede utilizarse para determinar el peso molecular de proteasas3, pero no puede utilizarse para examinar la especificidad de sustrato. Especificidad de la proteasa puede determinarse por análisis espectrométricos, utilizando sustratos como la p-nitroanilida4y los análisis fluorométrico, usando cumarina sustratos5 o de ensayos de transferencia de energía de resonancia de la fluorescencia (FRET)6. Estos métodos permiten detección única especificidad de sustratos contenidos en un solo pozo. En el presente estudio, la especificidad de la proteasa de extractos de tejido se examina bajo diversas condiciones, ya que estos extractos contienen proteasas múltiples. Actividad de las proteasas es regulada por varios factores, incluyendo fuerza del ion, pH, coenzimas y grupos prostéticos. Recientemente, se han utilizado métodos basados en proteómica para identificar la especificidad de la proteasa; por ejemplo, el método reportado por Biniossek et al. 7 el proteoma se utiliza para determinar la especificidad de sustrato incluso en extractos crudos y permite la determinación exacta de la actividad de la hendidura de las proteasas que reconocen múltiples secuencias de aminoácidos8. Sin embargo, este método no es adecuado para el análisis de numerosas muestras. En cambio, nuestro método permite el procesamiento simultáneo de múltiples muestras y el uso de mediante desorción/ionización del Laser (MALDI-TOF) de tiempo de vuelo espectrometría de masas para el análisis de la muestra facilita la detección rápida y fácil de la hendida sustratos.
Este documento describe un método para evaluar la especificidad de la proteasa utilizando espectrometría de masas MALDI-TOF para medir el peso molecular de sustratos únicos. Las formas moleculares de sustratos troceados, junto con su peso molecular teórico, se muestran en la figura 1 y tabla 1. Estudios previos han utilizado substratos que contienen separadores de polyglycine y biotina9; sin embargo, estos sustratos son defectuosas porque la secuencia de polyglycine puede ser troceada por enzimas que reconocen la secuencia de la glicina. Además, la alta afinidad entre la avidina y la biotina puede conducir a una tasa de recuperación bajo. Para mejorar estos inconvenientes, en este estudio que sintetizaron un sustrato único, que fue compuesto de polietilenglicol (PEG), iminobiotin y un aminoácido que puede identificar el sitio de la hendidura (figura 1). Para discriminar entre aminoácidos de peso molecular similar, D-serina fue agregado entre el espaciador PEG y el aminoácido en el sitio exfoliado.
El N-terminal del sustrato fue etiquetado con iminobiotin, que permite la purificación de la afinidad de muestras de crudo. El uso de iminobiotin en lugar de biotina es crítico; la biotina tiene una fuerte afinidad con la avidina, que se traduce en las tasas de baja recuperación de sustratos marcados con biotina de la resina de la avidina, mientras que la afinidad de iminobiotin de avidina puede ser alterado por pH. Sustratos marcados Iminobiotin se unirán a avidina en condiciones por encima de pH 9, mientras que la avidina libera sustratos marcados con iminobiotin en condiciones por debajo de pH 4. Por lo tanto, iminobiotin fue utilizado para la purificación de afinidad10. En Resumen, se describe un protocolo detallado para detectar la especificidad de proteasa utilizando sustratos únicos.

<table><tbody><tr><td>Resina Fmoc-NH-SAL (-[2,4-dimetoxifenil-N-(9-fluorenilmetoxicarbonilo) aminometil]fenoxiresina)</td><td>Watanabe Chemical Co., Ltd.</td><td>A00102</td><td></td></tr><tr><td>N,N-dimetilformamida (DMF)</td><td>Watanabe Chemical Co., Ltd.</td><td>A00185</td><td></td></tr><tr><td>piperidina</td><td>Watanabe Chemical Co., Ltd.</td><td>A00176</td><td></td></tr><tr><td>ácido trinitrobencenosulfónico (TNBS)</td><td>WAKO Chemical</td><td>209-1483</td><td></td></tr><tr><td>O-(6-Chloro-1H-benzotriazol-1-il)-N,N,N',N'-hexafluorofosfato de tetrametiluronio (HCTU)</td><td>Watanabe Chemical Co., Ltd.</td><td>A00067</td><td></td></tr><tr><td>1-hidroxi-1H-benzotriazol, monohidrato (HOBt)</td><td>Watanabe Chemical Co., Ltd.</td><td>A00014</td><td></td></tr><tr><td>diisopropiletilamina (DIPEA)</td><td>Watanabe Chemical Co., Ltd.</td><td>A00030</td><td></td></tr><tr><td>triisopropilsilano (TIS)</td><td>Watanabe Chemical Co., Ltd.</td><td>A00170</td><td></td></tr><tr><td>ethanedithiol (EDT)</td><td>Watanabe Chemical Co., Ltd.</td><td>A00057</td><td></td></tr><tr><td>ácido trifluoroacético (TFA)</td><td>Millipore</td><td>S6612278 403</td><td></td></tr><tr><td>acetonitrilo</td><td>Kokusan Chemical</td><td>2153025</td><td></td></tr><tr><td>C18 columna de cartucho Waters</td><td></td><td>WAT051910</td><td></td></tr><tr><td>éter de poli(oxietileno) octilfenilo</td><td>WAKO Chemical</td><td>168-11805</td><td>Triton X-100</td></tr><tr><td>homogeneizador de mezcla</td><td>Kinematica</td><td>PT3100</td><td>homogeneizador de polytron</td></tr><tr><td>Coomassie Azul Brillante (CBB) -G250</td><td>Nakarai Chemical</td><td>094-09</td><td></td></tr><tr><td>glicerol</td><td>Nakarai Chemical</td><td>170-18</td><td></td></tr><tr><td>N-tosil-L-fenilalanina clorometilcetona (TPCK)-tripsina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T1426</td><td></td></tr><tr><td>dimetilsulfóxido (DMSO)</td><td>WAKO Chemical</td><td>043-07216</td><td></td></tr><tr><td>estreptavidina sefarosa</td><td>GE Healthcare</td><td>17-511-01</td><td></td></tr><tr><td>ZipTipC18</td><td>Millipore</td><td>ZTC18S096</td><td></td></tr><tr><td>&alpha;-ácido ciano-4-hidroxicinámico (CHCA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C2020</td><td></td></tr><tr><td>Espectrometría de masas MALDI-TOF</td><td>Bruker Daltonics, Alemania</td><td>autoflex</td><td></td></tr><tr><td>2-iminobiotina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I4632</td><td></td></tr><tr><td>Fmoc-aminoácidos</td><td>Watanabe Chemical Co., Ltd.</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

los extractos de la determinación de la especificidad de la proteasa en el tejido de ratón por espectrometría de masas maldi-tof: manipulando ph para causar cambios de la especificidad

The Determination of Protease Specificity in Mouse Tissue Extracts by MALDI-TOF Mass Spectrometry: Manipulating PH to Cause Specificity Changes

Las proteasas tienen varias funciones biológicas, incluyendo digestión de comida y la activación/inactivación de proteínas. Identificar la especificidad de la proteasa es importante para revelar la función de la proteasa. El método propuesto en este estudio determina la especificidad de la proteasa midiendo el peso molecular de sustratos únicos mediante desorción/ionización del Laser asistida por matriz de espectrometría de masas de tiempo de vuelo (MALDI-TOF). Los sustratos contienen iminobiotin, mientras que el sitio hendido consiste en aminoácidos, y consiste en el separador de glicol de polietileno. El sustrato exfoliado generará un único peso molecular utilizando un aminoácido exfoliado. Uno de los méritos de este método es que se puede llevar a cabo en una maceta utilizando muestras de crudo, y también es adecuado para evaluar las muestras múltiples. En este artículo, describimos un método experimental sencillo optimizado con muestras extraídas de tejido de pulmón de ratón, incluyendo extracción de tejido, colocación de sustratos digestivos en muestras, depuración de digestivos sustratos bajo condiciones de pH diferentes y la medición del peso molecular de los sustratos mediante espectrometría de masas MALDI-TOF. En Resumen, esta técnica permite la identificación de la especificidad de la proteasa en muestras de crudo derivados de extractos de tejidos mediante espectrometría de masas MALDI-TOF, que puede fácilmente ampliarse para el procesamiento de las muestras múltiples.

Evaluación del método para la identificación de la especificidad de la proteasa por proteasa de modelo
Se evaluó la eficacia de este sistema utilizando TPCK-tripsina y proteasa V8, cuyas especificidades de sustrato se obtuvieron. Se estimaron TPCK-tripsina y proteasa V8 hender la secuencia de aminoácidos en el c-terminal de los residuos de lisina y arginina y en el lado carboxilo del ácido aspártico y residuos de ácido glutámico, r...

Aquí, presentamos un protocolo para determinar la especificidad de la proteasa en el tejido de ratón crudo usando MALDI-TOF espectrometría de extractos.

Los extractos de la determinación de la especificidad de la proteasa en el tejido de ratón por espectrometría de masas MALDI-TOF: manipulando PH para causar cambios de la especificidad

Proteases have several biological functions, including protein activation/inactivation and food digestion. Identifying protease specificity is important ...

El objetivo general de este experimento es determinar la especificidad de la proteasa en múltiples extractos crudos. Este método puede ayudar a responder preguntas clave para determinar la especificidad de la proteasa. La principal ventaja de esta técnica es que puede identificar la especificidad de la proteasa de múltiples muestras en parlay.Muestras de tejido pulmonar frío obtenidas de ratones machos ICR en hielo. Homogeneizar las muestras a 20.000 RMP durante 30 segundos en una batidora. Repita este paso hasta que las muestras estén completamente homogéneas.No homogeneizar durante más de un minuto de forma continuada para evitar un aumento de la temperatura. Transfiera 1.000 microlitros del homogeneizado a un tubo de 1,5 mililitros y centrifugue durante cinco minutos a 10.000 veces G a cuatro grados centígrados. Transfiera 500 microlitros del sobrenadante a un nuevo tubo de plástico de 1,5 mililitros.Utilice 10 microlitros de la muestra para determinar la concentración de proteína. Utilizando métodos, como el ensayo de ácido bicinconínico o el ensayo de Bradford. Para evitar la congelación, agregue 80% de glicerol a las muestras para obtener una concentración final de 50% de gli

the-determination-protease-specificity-mouse-tissue-extracts-maldi

Research

Investigación

JoVE Journal

Biochemistry

Bioquímica

Los compuestos de captura se trifuncional pequeñas moléculas para reducir la complejidad del proteoma de funcionamiento reversible de moléculas pequeñas, la interacción de proteínas seguido por foto-reticulación y la purificación. Aquí se utiliza un compuesto de captura...

Perfiles de metiltransferasas y Otros S-Adenosil- L-Homocisteína proteínas que se unen mediante espectrometría de masas de captura compuesto (MCP)

Normas de isótopos estables y de captura de anticuerpos anti-péptido (SISCAPA) enriquecimiento de las parejas de afinidad de los péptidos con una dilución de isótopos estables de espectrometría de masas (MRM-MS) para proporcionar una medición cuantitativa de los péptidos como sustitutos de sus respectivas proteínas. A continuación se describe el protocolo de uso de partículas magnéticas en un formato parcialmente automatizado.

La cuantificación de proteínas mediante el enriquecimiento de inmunoafinidad péptido acoplado a espectrometría de masas

Análisis del proteoma del epitelio sensorial coclear puede ser un reto debido a su pequeño tamaño y porque las proteínas de membrana son difíciles de aislar e identificar. Tanto la membrana y proteínas solubles se pueden identificar mediante la combinación de múltiples métodos de preparación y técnicas de separación junto con espectrometría de masas de alta resolución.

De abajo hacia arriba y de escopeta Proteómica para identificar una exhaustiva Coclear proteoma

El ubicuo segundo mensajero c-di-GMP controla el crecimiento y el comportamiento de muchas bacterias. Hemos desarrollado una novedosa tecnología basada en espectrometría de masas de compuestos de captura para identificar y caracterizar bioquímicamente las proteínas de unión a c-di-GMP en prácticamente cualquier especie bacteriana.

Captura compuesto Espectrometría de Masas - Una herramienta de gran alcance para identificar nuevos c-di-GMP efectoras Proteínas

Las matrices de péptidos sintetizadas por el método SPOT se pueden utilizar para analizar la especificidad del sustrato de las proteínas lisina metiltransferasas (PKMTs) y para definir el espectro de sustrato de las PKMT para comprender su papel biológico. Este protocolo describe cómo sintetizar matrices de péptidos, metilarlas con PKMT y analizar los resultados.

Análisis de la especificidad de la proteína lisina metiltransferasas Usando SPOT Péptido Arrays

Aquí presentamos un protocolo para realizar polysome perfilado en el corazón de ratón perfundido aislado. Se describen métodos para la perfusión del corazón, polysome perfiles y análisis de las fracciones polysome mRNAs, miRNAs y el proteoma polysome.

Proteómicos y miRNA análisis de polisomas de corazón de ratón aislados después de Langendorff la perfusión

Presentamos un método para la purificación, detección e identificación de péptidos digliquenados que se originan a partir de proteínas ubiquitinadas a partir de muestras biológicas complejas. El método presentado es reproducible, robusto y supera a los métodos publicados con respecto al nivel de profundidad del análisis ubiquitinome.

Detección de sitios de ubiquitinación de proteínas por enriquecimiento de péptidos y espectrometría de masas

Este flujo de trabajo describe el rendimiento del enriquecimiento eficiente en tiempo y costo de múltiples modificaciones post-traduccionales de proteínas (PTF) simultáneamente para el análisis proteómico global cuantitativo. El protocolo utiliza el enriquecimiento de PTM a nivel de péptido con múltiples anticuerpos conjugados, seguido de un análisis de espectrometría de masas de adquisición independiente de datos para obtener información biológica sobre la conversación cruzada PTM.

Enriquecimiento de afinidad simultánea de dos modificaciones post-traduccionales para la cuantificación y la localización del sitio

Aquí, presentamos un protocolo para el enriquecimiento de fosfoproteínas fosfatasas endógenas y sus proteínas que interactúan a partir de células y tejidos y su identificación y cuantificación mediante proteómica basada en espectrometría de masas.

Un enfoque basado en la espectrometría de masas para identificar fosfoproteínas fosfatasas y sus interactores

Presentamos un protocolo para identificar y cuantificar los componentes en mezclas de especies que poseen proteínas similares. La espectrometría de masas detecta péptidos para su identificación y proporciona una cuantificación relativa por proporciones de áreas de picos. Como alimento de herramienta para la detección de fraudes, el método puede detectar un 1% de caballo en la carne de vacuno.

La determinación de las especies y cuantificación de mezclas Uso de MRM espectrometría de masas de los péptidos Aplicada a la autenticación de carne

Aprenda a determinar la especificidad de proteasas en extractos de tejido de ratón mediante espectrometría de masas MALDI-TOF. Este protocolo permite analizar múltiples muestras simultáneamente para estudiar actividad enzimática.

Los extractos de la determinación de la especificidad de la proteasa en el tejido de ratón por espectrometría de masas MALDI-TOF: manipulando PH para causar cambios de la especificidad (Video) | JoVE Journal

Los extractos de la determinación de la especificidad de la proteasa en el tejido de ratón por espectrometría de masas MALDI-TOF: manipulando PH para causar cambios de la especificidad

Explorar más videos