La secuencia retrospectiva MicroRNA: ADN complementario biblioteca preparación protocolo utilizando a muestras de ARN de parafina-encajado formalina-fijo

El objetivo general de esta preparación de la biblioteca CDNA es permitir la secuenciación exitosa de ARN pequeños que se han almacenado en tejidos formales y fijos incluidos en parafina. Este método es muy útil para el análisis de muestras formales y fijas incrustadas en parafina. Se extrae ARN de hasta 18 muestras, se analiza el contenido de todas ellas y se obtiene un perfil de todas las microARNasas para todas las muestras.

Para comenzar el protocolo, agregue 8,5 microlitros de mezcla maestra de ligadura previamente preparada a cada una de las 18 muestras de FFPERNA alícuotas individualmente. Agite suavemente los tubos y centrifugue durante dos segundos. Después de centrifugar, guarde los tubos en hielo.

Utilice una pipeta de tres microlitros para transferir un microlitro de cada adaptador, a las muestras FFPERNA correspondientes que contengan ARN y mezcla maestra de ligadura. No pipetee hacia arriba y hacia abajo, y cambie las puntas entre las muestras de FFPERNA. Cierre cada tubo, gírelos para mezclarlos y centrifuérrelos durante dos segundos.

Coloca los tubos en hielo. Desnaturalice las reacciones colocando los tubos en un bloque de calor a 90 grados centígrados durante un minuto y luego colóquelos inmediatamente en hielo. A continuación, utilice una pipeta de tres microlitros para transferir un microlitro de la enzima de ligadura diluida a cada una de las 18 muestras de ARN.

Coloque las ligaduras en hielo y colóquelas en una cámara fría de cuatro grados centígrados para una incubación nocturna de 18 horas. Coloque las trompas en un bloque de calor durante un minuto a 90 grados centígrados para desactivar la reacción de ligadura y luego devuélvalas a hielo durante al menos dos minutos para que se enfríen. Transfiera 1,2 microlitros de la mezcla maestra de precipitación a cada tubo.

Agregue 63 microlitros de etanol 100%. Cierre cada tubo, agite los tubos para mezclarlos y centrifuérrelos durante dos segundos. Coloque los tubos sobre hielo.

Combine el contenido de los 18 tubos en un solo tubo siliconado de 1,5 mililitros e invierta tres veces para mezclar. Centrifuga los tubos durante dos segundos y colócalos en hielo durante 60 minutos para que precipiten. Después de la precipitación, centrifugar el tubo de 1,5 mililitros con las ligaduras agrupadas.

A continuación, retire el sobrenadante con la punta de la pipeta de un mililitro pero deje un poco de líquido en el fondo. Incline el tubo y utilice una pipeta de 20 microlitros para eliminar el sobrenadante restante. Aspire al vacío el sobrenadante con una pipeta Pasteur con una punta de 10 microlitros, luego vuelva a suspender el pellet de ARN en 20 microlitros de agua libre de ARNasa moviendo el tubo.

Agregue 20 microlitros de solución de carga de gel de PAA para resuspender el ARN. Agite el tubo, centrifugue el tubo durante dos segundos a temperatura ambiente y coloque el tubo en hielo. Reemplace el 0.5 XTBE previamente preparado del aparato de gel por 0.5 XTBE nuevo, y cargue este último, los marcadores de tamaño y la RNasa ligada en el centro del gel, dejando dos pocillos vacíos a ambos lados.

A continuación, pasa el gel. Después de ejecutar el gel, desmonte la página del 15% quitando una de las placas de vidrio. Rocíe ligeramente el gel que se encuentra sobre la placa de vidrio con 10 microlitros de solución de tinte fluorescente y 25 mililitros de 0.5 XTBE, y déjelo reposar durante cinco minutos en la oscuridad.

Coloque el vidrio con el gel en un transiluminador de luz azul y alinee los marcadores de tamaño de 19 nucleótidos y 24 nucleótidos con una regla para dirigir la escisión de los ARN pequeños ligados. A continuación, extirpa el gel. Coloque el gel extirpado en un tubo de 0,5 mililitros diseñado para fragmentar rodajas de gel, colocado de forma segura en un tubo de microcentrífuga siliconado de 1,5 mililitros.

Centrifugar el gel a 16 mil veces G durante tres minutos a temperatura ambiente. Vuelva a suspender el gel fragmentado con 300 microlitros de solución de cloruro de sodio de 400 milimolares. Cierre el tubo y séllelo con una película de parafina.

Agite el contenido en un termomezclador a 11 000 RPM en una cámara fría de cuatro grados centígrados para una incubación nocturna. Al día siguiente, retire el tubo del termomezclador y utilice una pipeta de un mililitro para transferir la solución a un tubo de filtro de cinco micrómetros, insertado en un tubo de recogida sin RNasa siliconado de 1,5 mililitros. Centrifugar el tubo durante tres minutos a 23 centurias veces G a temperatura ambiente.

Deseche el tubo del filtro, agregue 950 microlitros de etanol al 100% al tubo de recolección que contiene la solución filtrada e invierta el tubo para mezclar. Centrifuga el tubo durante dos segundos y colócalo en hielo durante 60 minutos. A continuación, precipite la bolita de ARN.

A continuación, seca el pellet de ARN abriendo el tapón y retirando con cuidado el sobrenadante con una pipeta de un mililitro, dejando un poco de líquido en el fondo. Utilice una pipeta de 20 microlitros para eliminar todo el sobrenadante restante sin tocar el pellet. Incline el tubo para que la solución restante se mueva al lado opuesto del pellet.

Utilice una pipeta Pasteur para aspirar el sobrenadante y seque el pellet al vacío. Vuelva a suspender el pellet de ARN en 5,6 microlitros de agua libre de ARNasa. Descongele los reactivos de transcripción inversa en hielo durante 15 minutos.

Configure una reacción de transcripción inversa agregando tres microlitros de tampón 5X, 4,2 microlitros de trifosfato de dioxinucleótido 10X, o DNTP, y 1,5 microlitros de ditiotreitol o DTT. Agite suavemente el tubo para mezclar la reacción y centrifugue durante dos segundos para recoger la solución. Después de que la reacción esté en un bloque de calor a 90 grados centígrados durante exactamente 30 segundos, transfiérala directamente a un mezclador térmico a 50 grados centígrados durante dos minutos para igualar la temperatura.

Añadir 0,75 microlitros de la enzima de transcripción inversa directamente en la solución. Agite suavemente para mezclar y vuelva a colocar el tubo en la termobatidora a 50 grados centígrados durante 30 minutos inmediatamente. Después de 30 minutos, transfiera el tubo a un bloque de calor a 95 grados centígrados durante un minuto para detener la transcripción inversa.

Añadir 95 microlitros de agua libre de RNasa directamente a la transcripción inversa. Agite el tubo para mezclar y colóquelo directamente sobre hielo durante dos minutos. Ensamble la reacción piloto de PCR y configure dos ciclos de PCR en el termociclador.

Configure la reacción piloto de PCR en el termociclador e inicie el archivo uno. Al final del primer archivo, use una pipeta de 20 microlitros para transferir 12 microlitros de la reacción piloto de PCR al tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitros que contiene tres microlitros de tinte de carga de gel 5X. Mezclar pipeteando hacia arriba y hacia abajo.

Y etiquétalo 10 ciclos. Cierre el tubo piloto de PCR e inicie la lima dos en el termociclador. Al final del segundo archivo, use una pipeta de 20 microlitros para transferir 12 microlitros de solución a un tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitros con tres microlitros de tinte de carga de gel 5X y etiquételo durante 12 ciclos.

Repita los pasos anteriores para recolectar 12 microlitros de productos de PCR de la reacción piloto de PCR en los ciclos de PCR 14, 16, 18 y 20. A continuación, añada tres microlitros de colorante de carga de gel 5X a cada una de las alícuotas de PCR de 12 microlitros, y a la escalera de 20 nucleótidos que contiene tres microlitros de escalera y nueve microlitros de agua libre de RNasa. Después de pasar las muestras en un gel de agarosa con 0,5 XTBE, evalúe el gel en una caja UV para identificar el ciclo de PCR óptimo.

A continuación, configure las reacciones de PCR a gran escala para la purificación de la biblioteca de gel de agarosa. Después de la amplificación por PCR, transfiera nueve microlitros de cada tubo de PCR a seis tubos de microcentrífuga de 1,5 mililitros, que contienen tres microlitros de tinte de carga de gel 5X. Prepara una escalera de 20 nucleótidos.

Cargue la escalera, el control de PCR negativo y seis productos de PCR en el gel de agarosa y haga funcionar el gel durante 30 minutos a 120 voltios. Verifique la uniformidad de las implementaciones de PCR entre carriles en una caja UV y tome una imagen. Combine tres reacciones de PCR en dos tubos de microcentrífuga siliconados de 1,5 mililitros, agregue 27 microlitros de cloruro de sodio de cinco molares y 950 microlitros de etanol al 100%.

Invierta los tubos para mezclar y colóquelos a 20 grados centígrados durante la noche para precipitar los productos de PCR. Utilizando el protocolo, se determinó la correlación de la expresión de micro ARN entre los dos ARN tumorales frescos congelados y sus contrapartes específicas de muestras de FFPERNA. Los gráficos entre micro ARN fresco congelado y FFPE emparejados indican que la preparación de la biblioteca CDNA proporciona una buena reproducibilidad, ya que existe una alta correlación entre los microARN detectados en muestras procesadas de manera diferente.

Para determinar si el protocolo optimizado de preparación de la Biblioteca CNDA era aplicable y reproducible con especímenes de FFPE cada vez más antiguos, se obtuvieron perfiles de expresión de micro ARN de tejidos FFPE archivados durante 18, 20, 22, 27, 30 y 35 años. El coeficiente de correlación se mantuvo por encima de 0,96 independientemente de la edad del ejemplar o de la semana de preparación de la biblioteca. Por lo tanto, el protocolo optimizado de preparación de la biblioteca CDNA proporciona una herramienta robusta para el análisis reproducible de muestras FFPE, independientemente de su tiempo de archivo.

Por lo tanto, después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo preparar sus pequeñas bibliotecas de ARN y obtener un perfil de microexpresión completo de todos sus valiosos especímenes formales y fijos incrustados en parafina.