Name: La secuencia retrospectiva MicroRNA: ADN complementario biblioteca preparación protocolo utilizando a muestras de ARN de parafina-encajado formalina-fijo (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-05-05T13:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 24 s
Description: Aprende a preparar bibliotecas de ADN complementario para secuenciar microARNs de muestras de tejido fijadas en formalina y embebidas en parafina. Este protocolo permite analizar hasta 18 especímenes archivados durante 35 años.

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Agradecemos al Dr. Thomas Tuschl, jefe del laboratorio de biología molecular de RNA, así como los miembros de su laboratorio por su apoyo y por compartir la tecnología desarrollada en su laboratorio, proporcionando acceso a la tubería de RNAworld. También agradecemos a Dr. Markus Hafner para compartir su Protocolo y proporcionar descripciones detalladas sobre todos los pasos bioquímicos y enzimáticos utilizados en su procedimiento inicial.

<ol><li>Peiró-Chova, L., Peña-Chilet, M., López-, J. A., García-Gimenez, J. L., Alonso-Yuste, E., Burgues, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+stability+of+microRNAs+in+tissue+samples+of+compromised+quality%5BTitle%5D)+AND+%22Virchows.+Arch%22%5BJournal%5D)">High stability of microRNAs in tissue samples of compromised quality.</a> Virchows. Arch. 463, 765-774 (2013).</li>
<li>Klopfleisch, R., Weiss, A. T., Gruber, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Excavation+of+a+buried+treasure--DNA%2C+mRNA%2C+miRNA+and+protein+analysis+in+formalin+fixed%2C+paraffin+embedded+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Histol.+Histopathol%22%5BJournal%5D)">Excavation of a buried treasure--DNA, mRNA, miRNA and protein analysis in formalin fixed, paraffin embedded tissues.</a> Histol. Histopathol. 26, 797-810 (2011).</li>
<li>Kakimoto, Y., Kamiguchi, H., Ochiai, E., Satoh, F., Osawa, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNA+Stability+in+Postmortem+FFPE+Tissues%3A+Quantitative+Analysis+Using+Autoptic+Samples+from+Acute+Myocardial+Infarction+Patients%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">MicroRNA Stability in Postmortem FFPE Tissues: Quantitative Analysis Using Autoptic Samples from Acute Myocardial Infarction Patients.</a> PLoS One. 10 (6), e0129338(2015).</li>
<li>Giricz, O., Reynolds, P. A., Ramnauth, A., Liu, C., Wang, T., Stead, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hsa-miR-375+is+differentially+expressed+during+breast+lobular+neoplasia+and+promotes+loss+of+mammary+acinar+polarity%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Pathol%22%5BJournal%5D)">Hsa-miR-375 is differentially expressed during breast lobular neoplasia and promotes loss of mammary acinar polarity.</a> J. Pathol. 226, 108-119 (2012).</li>
<li>Hui, A. B., Shi, W., Boutros, P. C., Miller, N., Pintilie, M., Fyles, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Robust+global+micro-RNA+profiling+with+formalin-fixed+paraffin-embedded+breast+cancer+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Lab.+Invest%22%5BJournal%5D)">Robust global micro-RNA profiling with formalin-fixed paraffin-embedded breast cancer tissues.</a> Lab. Invest. 89, 597-606 (2009).</li>
<li>Zhang, X., Chen, J., Radcliffe, T., Lebrun, D. P., Tron, V. A., Feilotter, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+array-based+analysis+of+microRNA+expression+comparing+matched+frozen+and+formalin-fixed+paraffin-embedded+human+tissue+samples%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mol.+Diagn%22%5BJournal%5D)">An array-based analysis of microRNA expression comparing matched frozen and formalin-fixed paraffin-embedded human tissue samples.</a> J. Mol. Diagn. 10, 513-519 (2008).</li>
<li>Kolbert, C. P., Feddersen, R. M., Rakhshan, F., Grill, D. E., Simon, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multi-platform+analysis+of+microRNA+expression+measurements+in+RNA+from+fresh+frozen+and+FFPE+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Multi-platform analysis of microRNA expression measurements in RNA from fresh frozen and FFPE tissues.</a> PLoS One. 8, e52517(2013).</li>
<li>Meng, W., McElroy, J. P., Volinia, S., Palatini, J., Warner, S., Ayers, L. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+microRNA+deep+sequencing+of+matched+formalin-fixed+paraffin-embedded+and+fresh+frozen+cancer+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Comparison of microRNA deep sequencing of matched formalin-fixed paraffin-embedded and fresh frozen cancer tissues.</a> PLoS One. 8 (5), e64393(2013).</li>
<li>Liu, A., Tetzlaff, M. T., Vanbelle, P., Elder, D., Feldman, M., Tobias, J. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNA+expression+profiling+outperforms+mRNA+expression+profiling+in+formalin-fixed+paraffin-embedded+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Clin.+Exp.+Pathol%22%5BJournal%5D)">MicroRNA expression profiling outperforms mRNA expression profiling in formalin-fixed paraffin-embedded tissues.</a> Int. J. Clin. Exp. Pathol. 2, 519-527 (2009).</li>
<li>Dijkstra, J. R., Mekenkamp, L. J., Teerenstra, S., De Krijger, I., Nagtegaal, I. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNA+expression+in+formalin-fixed+paraffin+embedded+tissue+using+real+time+quantitative+PCR%3A+the+strengths+and+pitfalls%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Mol+Med%22%5BJournal%5D)">MicroRNA expression in formalin-fixed paraffin embedded tissue using real time quantitative PCR: the strengths and pitfalls.</a> J Cell Mol Med. 16, 683-690 (2012).</li>
<li>Siebolts, U., Varnholt, H., Drebber, U., Dienes, H. P., Wickenhauser, C., Odenthal, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissues+from+routine+pathology+archives+are+suitable+for+microRNA+analyses+by+quantitative+PCR%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Pathol%22%5BJournal%5D)">Tissues from routine pathology archives are suitable for microRNA analyses by quantitative PCR.</a> J. Clin. Pathol. 62, 84-88 (2009).</li>
<li>Jang, J. S., Simon, V. A., Feddersen, R. M., Rakhshan, F., Schultz, D. A., Zschunke, M. A., Lingle, W. L., Kolbert, C. P., Jen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+miRNA+expression+analysis+using+fluidigm+microfluidics+dynamic+arrays%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Genomics%22%5BJournal%5D)">Quantitative miRNA expression analysis using fluidigm microfluidics dynamic arrays.</a> BMC Genomics. 12, 144(2011).</li>
<li>Andreasen, D., Fog, J. U., Biggs, W., Salomon, J., Dahslveen, I. K., Baker, A., Mouritzen, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+microRNA+quantification+in+total+RNA+from+clinical+samples%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Improved microRNA quantification in total RNA from clinical samples.</a> Methods. 50 (4), S6-S9 (2010).</li>
<li>Kelly, A. D., Hill, K. E., Correll, M., Wang, Y. E., Rubio, R., Duan, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Next-generation+sequencing+and+microarray-based+interrogation+of+microRNAs+from+formalin-fixed%2C+paraffin-embedded+tissue%3A+preliminary+assessment+of+cross-platform+concordance%5BTitle%5D)+AND+%22Genomics%22%5BJournal%5D)">Next-generation sequencing and microarray-based interrogation of microRNAs from formalin-fixed, paraffin-embedded tissue: preliminary assessment of cross-platform concordance.</a> Genomics. 102, 8-14 (2013).</li>
<li>Visone, R., Croce, C. M. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC2671346/">MiRNAs and cancer.</a> Am. J. Pathol. 174, 1131-1138 (2009).</li>
<li>Lu, J., Getz, G., Miska, E. A., Alvarez-Saavedra, E., Lamb, J., Peck, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNA+expression+profiles+classify+human+cancers%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">MicroRNA expression profiles classify human cancers.</a> Nature. 435, 834-838 (2005).</li>
<li>Cho, W. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNAs%3A+potential+biomarkers+for+cancer+diagnosis%2C+prognosis+and+targets+for+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Biochem.+Cell.+Biol%22%5BJournal%5D)">MicroRNAs: potential biomarkers for cancer diagnosis, prognosis and targets for therapy.</a> Int. J. Biochem. Cell. Biol. 42, 1273-1281 (2010).</li>
<li>Hui, A., How, C., Ito, E., Liu, F. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Micro-RNAs+as+diagnostic+or+prognostic+markers+in+human+epithelial+malignancies%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Cancer%22%5BJournal%5D)">Micro-RNAs as diagnostic or prognostic markers in human epithelial malignancies.</a> BMC Cancer. 11, 500(2011).</li>
<li>Tam, S., de Borja, R., Tsao, M. S., McPherson, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Robust+global+microRNA+expression+profiling+using+next-generation+sequencing+technologies%5BTitle%5D)+AND+%22Lab.+Invest%22%5BJournal%5D)">Robust global microRNA expression profiling using next-generation sequencing technologies.</a> Lab. Invest. 94, 350-358 (2014).</li>
<li>Loudig, O., Wan, T., Ye, K., Lin, J., Wang, Y., Ramnauth, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+and+Adaptation+of+a+Laboratory+Based+cDNA+Library+Preparation+Protocol+for+Retrospective+Sequencing+of+Archived+MicroRNAs+from+up+to+35-Year-Old+Clinical+FFPE+Specimens%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Mol+Sci%22%5BJournal%5D)">Evaluation and Adaptation of a Laboratory Based cDNA Library Preparation Protocol for Retrospective Sequencing of Archived MicroRNAs from up to 35-Year-Old Clinical FFPE Specimens.</a> Int J Mol Sci. 18, e627(2017).</li>
<li>Kotorashvili, A., Ramnauth, A., Liu, C., Lin, J., Ye, K., Kim, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effective+DNA%2FRNA+co-extraction+for+analysis+of+microRNAs%2C+mRNAs%2C+and+genomic+DNA+from+formalin-fixed+paraffin-embedded+specimens%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Effective DNA/RNA co-extraction for analysis of microRNAs, mRNAs, and genomic DNA from formalin-fixed paraffin-embedded specimens.</a> PLoS One. 7 (4), e34683(2012).</li>
<li>Hafner, M., Renwick, N., Farazi, T. A., Mihailović, A., Pena, J. T., Tuschl, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Barcoded+cDNA+library+preparation+for+small+RNA+profiling+by+next-generation+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Barcoded cDNA library preparation for small RNA profiling by next-generation sequencing.</a> Methods. 58 (2), 164-170 (2012).</li>
<li>Loudig, O., Brandwein-Gensler, M., Kim, R. S., Lin, J., Isayeva, T., Liu, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Illumina+whole-genome+complementary+DNA-mediated+annealing%2C+selection%2C+extension+and+ligation+platform%3A+assessing+its+performance+in+formalin-fixed%2C+paraffin-embedded+samples+and+identifying+invasion+pattern-related+genes+in+oral+squamous+cell+carcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22Hum.+Pathol%22%5BJournal%5D)">Illumina whole-genome complementary DNA-mediated annealing, selection, extension and ligation platform: assessing its performance in formalin-fixed, paraffin-embedded samples and identifying invasion pattern-related genes in oral squamous cell carcinoma.</a> Hum. Pathol. 42 (12), 1911-1922 (2011).</li>
</ol>

Los autores desean revelar que una publicación que contiene algunos de los datos presentados en este manuscrito fue publicada en la revista internacional de Ciencias moleculares por Loudig et al. 21.

Un protocolo de preparación de biblioteca de cDNA altamente reproducible y robusto para NGS de small RNAs en muestras de ARN FFPE se presenta en el presente Protocolo, que es una versión modificada y optimizada del procedimiento descrito por Hafner et al. 22
Todos los pasos de este protocolo han sido optimizados para el uso con mayores archivado y comprometido ARN total recuperado de muestras FFPE. El paso fundamental de este protocolo, para el procesamiento de...

miRNAs son notablemente bien conservadas en formalina-fijo parafina-encajado (FFPE) muestras1,2,3. Trabajo previo ha demostrado que la expresión de estos cortos no codificantes solo trenzado RNA moléculas reguladoras puede ser evaluado con éxito utilizando ARN total de las muestras FFPE y proporcionar datos de expresión de genes relevantes en comparación con el fresco original los tejidos4,5,6,7,8. En comparación con el tamaño grande mensajero RNAs, que han demostrado ser afectados críticamente por FFPE procesamiento de tejido (formaldehído, calor, desecación, etc.), RNasas endógenas y la edad de las muestras, el tamaño pequeño de miRNAs (~ 18-24 nucleótidos) parece hacerlos resistentes al almacenamiento a largo plazo, también se demostró mediante estudios de expresión de miRNA que superan los estudios de mRNA de alto rendimiento en especímenes archivados9y resistente a la degradación. estudios de expresión de miRNA utilizando muestras clínicas archivadas, que en su mayoría se han realizado análisis en pequeña escala, han demostrado que solo o multiplexado ensayos PCR cuantitativos, diferentes tipos de tecnologías microarrays y más recientemente NGS puede utilizarse para evaluar la expresión de miRNAs conservada después de la optimización de estos ensayos10,11,12,13,14.
Dado que la desregulación de la expresión del miRNA se ha asociado con el desarrollo de una variedad de malignidades humanas y que es potencialmente una fuente enorme de clínico anotado muestras archivadas, se ha puesto de manifiesto que estos ARN pequeño las moléculas representan una fuente prometedora de potenciales biomarcadores de cáncer15,16,de17,18. El uso de una tecnología de expresión de gen de alto rendimiento como NGS tiene la ventaja de proporcionar una evaluación global de todas las transcripciones de miRNA en comparación con tecnologías específicas tales como PCR y microarrays de19. Por esta razón, se ha optimizado un protocolo optimizado, asequible y fácilmente aplicable para la preparación de la biblioteca del cDNA de ARNs pequeños de más viejos especímenes archivados para NGS para estudios a gran escala20.
Anteriormente establecimos un protocolo de extracción de ARN/ADN simultánea para recuperación separada de ARN y ADN de ejemplares archivados más viejos, que hemos encontrado para superar a kits comerciales contemporáneo21. Utilizando este protocolo de extracción, para obtener el ARN total de tejidos FFPE archivados durante un período prolongado de tiempo, hemos optimizado la preparación de las bibliotecas de cDNA para NGS de miRNAs conservado en las muestras clínicas de hasta 35 años. Además, en un estudio recientemente publicado donde preparamos las bibliotecas de cDNA de clasificados clínicamente carcinoma ductal en situ muestras (CDIS), identificamos diferencialmente expresado miRNAs que fueron validados por PCR cuantitativa, que indica que cambios de expresión de miRNA específico pueden ser detectables en las lesiones de CDIS de los pacientes que desarrollan cáncer de mama en comparación con las lesiones de CDIS de los pacientes que desarrollan cáncer de mama.
Teniendo en cuenta el costo de los kits comerciales para la preparación de pequeñas bibliotecas de cDNA RNA, el potencial de su interrupción, así como el uso de reactivos protegidas por derechos de autor/patentes que no se pueden optimizar, decidimos adaptar previamente publicados en laboratorio y sin kit de 3' barras cDNA biblioteca preparación protocolo para NGS de small RNAs en especímenes FFPE, lo que permite el análisis simultáneo de 18 muestras de22. Este protocolo proporciona un procedimiento paso a paso ideal y robusto con puestos de control de evaluación visual y técnico, que eran críticos para la adaptación a las muestras de RNA FFPE, y tiene un gran potencial para su aplicación a otras fuentes de peligro o dificultad utilizar material de RNA. Aplicabilidad del protocolo original fue mejorada mediante la sustitución de marcadores de tamaño radiactivo marcado con fluorescente (p. ej., oro de SYBR) detectable RNA tamaño los marcadores usados durante la selección de bibliotecas ligadas en geles de poliacrilamida grandes. Este protocolo optimizado se basa en la ligación de código de barras adaptadores de 3' a 18 muestras individuales de FFPE ARN, que son luego agruparon para someterse a la ligadura de 5' adaptador, reverso-transcripción y un piloto análisis PCR para amplificación del cDNA final adaptado biblioteca antes de la amplificación, purificación y NGS a gran escala de PCR en un secuenciador de alto rendimiento.

<table><tbody><tr><td>1% Triton x-100</td><td>Invitrogen</td><td>HFH10</td><td></td></tr><tr><td>10mM</td><td>ATP Ambion</td><td>AM8110G</td><td></td></tr><tr><td>10X dNTPs</td><td>Ambion</td><td>AM8110G</td><td></td></tr><tr><td>10x TBE</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>15581044</td><td></td></tr><tr><td>14M Mercaptoethanol</td><td>Sigma</td><td>O3445I-100</td><td></td></tr><tr><td>escalera de 20 nt</td><td>Jena Bioscience</td><td>M-232S</td><td></td></tr><tr><td>20mg/ml Albúmina sérica bovina</td><td>Sigma</td><td>B8894-5ML</td><td></td></tr><tr><td>50X Taq de titanio</td><td>Laboratorios Clontech</td><td></td> Persulfato de amonio 639208 <td></td></tr><tr><td>Fisher</td><td>Scientific</td><td>7727-54-0</td><td></td></tr><tr><td>BRL Sistema de electroforesis de gel vertical con placas y peines de vidrio</td><td>GIBCO</td><td>V16</td><td></td></tr><tr><td>Dimethyl sulfoxide (DMSO)</td><td>Sigma</td><td>D9170-5VL</td><td></td></tr><tr><td>Microcentrífuga Eppendorf 5424R</td><td>EE. UU. científica</td><td>4054-4537Q</td><td></td></tr><tr><td>Eppndorf Thermomixer</td><td>EE. UU. científica</td><td>4053-8223Q</td><td></td></tr><tr><td>Fisherbrand&trade; Tubos de microcentrífuga siliconados de baja retención 1,5 ml</td><td>Fisher Scientific</td><td>02-681-320</td><td></td></tr><tr><td>Tubo rompedor de gel 0,5 ml</td><td>IST Engineering Inc,3388-100</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>Aparato de electroforesis en gel 7cm x10cm- Mini-sub Cell GT con bandejas de gel y peines</td><td>Biorad</td><td></td> 1704446 <td></td></tr><tr><td>Glycoblue</td><td>Ambion</td><td>AM9516</td><td></td></tr><tr><td>Jersey-Cote</td><td>LabScientific, Inc</td><td>1188</td><td></td></tr><tr><td>KcL 2M</td><td>Ambion</td><td>AM9640G</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2 1M</td><td>Ambion</td><td>AM9530G</td><td></td></tr><tr><td>Minifuge centrífuga personal de doble rotor</td><td>USA scientific</td><td>2641-0016</td><td></td></tr><tr><td>Modelo V16 Aparato de electroforesis en gel de poliacrilamida, gafas, peines y espaciadores</td><td>Ciore Life Science</td><td>21070010</td><td></td></tr><tr><td>Oligonucleótidos</td><td></td><td>IDT Definido durante el pedido</td><td></td></tr><tr><td>Owl EasyCast B2 mini sistema de electroforesis- con bandejas de gel y peines Thermofisher</td><td>Scientific</td><td>B2</td><td></td></tr><tr><td>Qiaquick Kit de extracción de gel</td><td>Qiagen</td><td>28704</td><td></td></tr><tr><td>Enzima de restricción PmeI</td><td>NEB</td><td>R0560S</td><td></td></tr><tr><td>Agua libre de ARNasa</td><td>Ambion</td><td>AM9932</td><td></td></tr><tr><td>Safe Imager 2.0</td><td>Life Technologies</td><td>G6600</td><td></td></tr><tr><td>Safe Imager 2.0 transiluminador de luz azul</td><td>Thermofisher</td><td>G6600</td><td></td></tr><tr><td>SeaKem LE agarosa</td><td>Lonza</td><td>50002</td><td></td></tr><tr><td>Superscript III kit de transcripción inversa</td><td>Invitrogen</td><td>18080-044</td><td></td></tr><tr><td>SybrGold</td><td>Life Technologies</td><td>S11494</td><td></td></tr><tr><td>T4 ARN ligasa 1</td><td>NEB</td><td>M0204S</td><td></td></tr><tr><td>T4 ARN ligasa 2 Truncado K227Q</td><td>NEB</td><td>0351L</td><td></td></tr><tr><td>TEMED</td><td>Fisher Scientific</td><td>O3446I-100</td><td></td></tr><tr><td>Themocycler con tapa calefactada</td><td>Biosystem aplicado</td><td>4359659</td><td></td></tr><tr><td>Tris 1M pH 7.5</td><td>Invitrogen</td><td>15567027</td><td></td></tr><tr><td>Tris 1M pH8.0</td><td>Ambion</td><td>AM9855G</td><td></td></tr><tr><td>UltraPure Sistema Sequagel concentrado, diluyente y tampón</td><td>Nacional Diagnóstico</td><td>EC-833</td><td></td></tr></tbody></table>

la secuencia retrospectiva microrna: adn complementario biblioteca preparación protocolo utilizando a muestras de arn de parafina-encajado formalina-fijo

Retrospective MicroRNA Sequencing: Complementary DNA Library Preparation Protocol Using Formalin-fixed Paraffin-embedded RNA Specimens

– Archivar, clasificar clínicamente formalina-fijo tejidos parafina-encajados de (FFPE) pueden prever ácidos nucleicos estudios moleculares del desarrollo del cáncer. Mediante el uso de no-invasiva lesiones malignas o premalignas en pacientes que posteriormente desarrollan enfermedad invasiva, análisis de expresión génica podrán ayudar a identificar alteraciones moleculares tempranas que predisponen al riesgo de cáncer. Se ha descrito también que los ácidos nucleicos de los tejidos FFPE han sufrido graves daños y modificaciones químicas, que dificultan su análisis y generalmente requiere ensayos adaptados. MicroRNAs (miRNAs), sin embargo, que representan una pequeña clase de moléculas de ARN que abarca sólo a ~ 18-24 nucleótidos, se han demostrado para soportar el almacenamiento a largo plazo y se han analizado con éxito en muestras FFPE. Aquí presentamos un 3' con código de barras ADN (cDNA) Biblioteca preparación Protocolo complementario específicamente optimizado para el análisis de small RNAs extraído de tejidos archivados, que recientemente fue demostrado para ser robusto y altamente reproducible cuando uso de archivada especímenes clínicos almacenados hasta por 35 años. Esta preparación de biblioteca se adapta bien al análisis multiplex de material comprometido/degradados donde las muestras de RNA (hasta 18) ligadas con los adaptadores de código de barras individual de 3' y entonces agruparon para posteriores preparaciones enzimáticas y bioquímicas antes del análisis. Se realizan purificaciones todos por electroforesis en gel de poliacrilamida (PAGE), que permite selecciones específicas de tamaño y riquezas de especies pequeñas de RNA con código de barras. Esta preparación de la biblioteca de cDNA se adapta bien a minuto entradas de RNA, como una reacción en cadena de piloto de la polimerasa (PCR) permite la determinación de un ciclo de amplificación específica para producir cantidades óptimas de material para la secuenciación de próxima generación (NGS). Este enfoque se ha optimizado para el uso de degradados de FFPE de ARN de muestras archivadas de hasta 35 años y proporciona datos NGS altamente reproducibles.

Como se describe en el método, un total de 18 muestras individuales de ARN FFPE (100 ng cada) se colocan en tubos separados a 3' adenylated con código de barras del oligonucleótido T4 la ligadura durante la noche. Al día siguiente, las reacciones enzimáticas son desactivados por calor combinadas y precipitadas en un solo tubo. Se resuspendió el pellet de RNA y las moléculas de ARN ligadas están separadas en un gel de poliacrilamida (PAGE), donde se utilizan marcadores de RNA del oligonucl...

Muestras de parafina-encajado formalina-fijos representan una valiosa fuente de biomarcadores moleculares de las enfermedades humanas. Aquí presentamos un protocolo de preparación Biblioteca de cDNA en laboratorio, inicialmente diseñado con ARN congelado fresco y optimizado para el análisis de los microRNAs de tejidos almacenan hasta 35 años.

La secuencia retrospectiva MicroRNA: ADN complementario biblioteca preparación protocolo utilizando a muestras de ARN de parafina-encajado formalina-fijo

&#8211;Archived, clinically classified formalin-fixed paraffin-embedded (FFPE) tissues can provide nucleic acids for retrospective molecular studies of ...

El objetivo general de esta preparación de la biblioteca CDNA es permitir la secuenciación exitosa de ARN pequeños que se han almacenado en tejidos formales y fijos incluidos en parafina. Este método es muy útil para el análisis de muestras formales y fijas incrustadas en parafina. Se extrae ARN de hasta 18 muestras, se analiza el contenido de todas ellas y se obtiene un perfil de todas las microARNasas para todas las muestras.Para comenzar el protocolo, agregue 8,5 microlitros de mezcla maestra de ligadura previamente preparada a cada una de las 18 muestras de FFPERNA alícuotas individualmente. Agite suavemente los tubos y centrifugue durante dos segundos. Después de centrifugar, guarde los tubos en hielo.Utilice una pipeta de tres microlitros para transferir un microlitro de cada adaptador, a las muestras FFPERNA correspondientes que contengan ARN y mezcla maestra de ligadura. No pipetee hacia arriba y hacia abajo, y cambie las puntas entre las muestras de FFPERNA. Cierre cada tubo, gírelos para mezclarlos y centrifuérrelos durante dos segundos.Coloca los tubos en hielo. Desnaturalice las reacciones colocando los tubos en un bloque de calor a 90 grados centígrados durante un minuto y luego colóquelos inmediatamente en hielo. A continuación, utilice una pipeta de tres microlitros para transferir un microlitro de la enzima de ligadura diluida a cada una de las 18 muestras de ARN.Coloque las ligaduras en hielo y colóquelas en una cámara fría de cuatro grados centígrados para una incubación nocturna de 18 horas. Coloque las trompas en un bloque de calor durante un minuto a 90 grados centígrados para desactivar la reacción de ligadura y luego devuélvalas a hielo durante al menos dos minutos para que se enfríen. Transfiera 1,2 microlitros de la mezcla maestra de precipitación a cada tubo.Agregue 63 microlitros de etanol 100%. Cierre cada tubo, agite los tubos para mezclarlos y centrifuérrelos durante dos segundos. Coloque los tubos sobre hielo.Combine el contenido de los 18 tubos en un solo tubo siliconado de 1,5 mililitros e invierta tres veces para mezclar. Centrifuga los tubos durante dos segundos y colócalos en hielo durante 60 minutos para que precipiten. Después de la precipitación, centrifugar el tubo de 1,5 mililitros con las ligaduras agrupadas.A continuación, retire el sobrenadante con la punta de la pipeta de un mililitro pero deje un poco de líquido en el fondo. Incline el tubo y utilice una pipeta de 20 microlitros para eliminar el sobrenadante restante. Aspire al vacío el sobrenadante con una pipeta Pasteur con una punta de 10 microlitros, luego vuelva a suspender el pellet de ARN en 20 microlitros de agua libre de ARNasa moviendo el tubo.Agregue 20 microlitros de solución de carga de gel de PAA para resuspender el ARN. Agite el tubo, centrifugue el tubo durante dos segundos a temperatura ambiente y coloque el tubo en hielo. Reemplace el 0.5 XTBE previamente preparado del aparato de gel por 0.5 XTBE nuevo, y cargue este último, los marcadores de tamaño y la RNasa ligada en el centro del gel, dejando dos pocillos vacíos a ambos lados.A continuación, pasa el gel. Después de ejecutar el gel, desmonte la página del 15% quitando una de las placas de vidrio. Rocíe ligeramente el gel que se encuentra sobre la placa de vidrio con 10 microlitros de solución de tinte fluorescente y 25 mililitros de 0.5 XTBE, y déjelo reposar durante cinco minutos en la oscuridad.Coloque el vidrio con el gel en un transiluminador de luz azul y alinee los marcadores de tamaño de 19 nucleótidos y 24 nucleótidos con una regla para dirigir la escisión de los ARN pequeños ligados. A continuación, extirpa el gel. Coloque el gel extirpado en un tubo de 0,5 mililitros diseñado para fragmentar rodajas de gel, colocado de forma segura en un tubo de microcentrífuga siliconado de 1,5 mililitros.Centrifugar el gel a 16 mil veces G durante tres minutos a temperatura ambiente. Vuelva a suspender el gel fragmentado con 300 microlitros de solución de cloruro de sodio de 400 milimolares. Cierre el tubo y séllelo con una película de parafina.Agite el contenido en un termomezclador a 11 000 RPM en una cámara fría de cuatro grados centígrados para una incubación nocturna. Al día siguiente, retire el tubo del termomezclador y utilice una pipeta de un mililitro para transferir la solución a un tubo de filtro de cinco micrómetros, insertado en un tubo de recogida sin RNasa siliconado de 1,5 mililitros. Centrifugar el tubo durante tres minutos a 23 centurias veces G a temperatura ambiente.Deseche el tubo del filtro, agregue 950 microlitros de etanol al 100% al tubo de recolección que contiene la solución filtrada e invierta el tubo para mezclar. Centrifuga el tubo durante dos segundos y colócalo en hielo durante 60 minutos. A continuación, precipite la bolita de ARN.A continuación, seca el pellet de ARN abriendo el tapón y retirando con cuidado el sobrenadante con una pipeta de un mililitro, dejando un poco de líquido en el fondo. Utilice una pipeta de 20 microlitros para eliminar todo el sobrenadante restante sin tocar el pellet. Incline el tubo para que la solución restante se mueva al lado opuesto del pellet.Utilice una pipeta Pasteur para aspirar el sobrenadante y seque el pellet al vacío. Vuelva a suspender el pellet de ARN en 5,6 microlitros de agua libre de ARNasa. Descongele los reactivos de transcripción inversa en hielo durante 15 minutos.Configure una reacción de transcripción inversa agregando tres microlitros de tampón 5X, 4,2 microlitros de trifosfato de dioxinucleótido 10X, o DNTP, y 1,5 microlitros de ditiotreitol o DTT. Agite suavemente el tubo para mezclar la reacción y centrifugue durante dos segundos para recoger la solución. Después de que la reacción esté en un bloque de calor a 90 grados centígrados durante exactamente 30 segundos, transfiérala directamente a un mezclador térmico a 50 grados centígrados durante dos minutos para igualar la temperatura.Añadir 0,75 microlitros de la enzima de transcripción inversa directamente en la solución. Agite suavemente para mezclar y vuelva a colocar el tubo en la termobatidora a 50 grados centígrados durante 30 minutos inmediatamente. Después de 30 minutos, transfiera el tubo a un bloque de calor a 95 grados centígrados durante un minuto para detener la transcripción inversa.Añadir 95 microlitros de agua libre de RNasa directamente a la transcripción inversa. Agite el tubo para mezclar y colóquelo directamente sobre hielo durante dos minutos. Ensamble la reacción piloto de PCR y configure dos ciclos de PCR en el termociclador.Configure la reacción piloto de PCR en el termociclador e inicie el archivo uno. Al final del primer archivo, use una pipeta de 20 microlitros para transferir 12 microlitros de la reacción piloto de PCR al tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitros que contiene tres microlitros de tinte de carga de gel 5X. Mezclar pipeteando hacia arriba y hacia abajo.Y etiquétalo 10 ciclos. Cierre el tubo piloto de PCR e inicie la lima dos en el termociclador. Al final del segundo archivo, use una pipeta de 20 microlitros para transferir 12 microlitros de solución a un tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitros con tres microlitros de tinte de carga de gel 5X y etiquételo durante 12 ciclos.Repita los pasos anteriores para recolectar 12 microlitros de productos de PCR de la reacción piloto de PCR en los ciclos de PCR 14, 16, 18 y 20. A continuación, añada tres microlitros de colorante de carga de gel 5X a cada una de las alícuotas de PCR de 12 microlitros, y a la escalera de 20 nucleótidos que contiene tres microlitros de escalera y nueve microlitros de agua libre de RNasa. Después de pasar las muestras en un gel de agarosa con 0,5 XTBE, evalúe el gel en una caja UV para identificar el ciclo de PCR óptimo.A continuación, configure las reacciones de PCR a gran escala para la purificación de la biblioteca de gel de agarosa. Después de la amplificación por PCR, transfiera nueve microlitros de cada tubo de PCR a seis tubos de microcentrífuga de 1,5 mililitros, que contienen tres microlitros de tinte de carga de gel 5X. Prepara una escalera de 20 nucleótidos.Cargue la escalera, el control de PCR negativo y seis productos de PCR en el gel de agarosa y haga funcionar el gel durante 30 minutos a 120 voltios. Verifique la uniformidad de las implementaciones de PCR entre carriles en una caja UV y tome una imagen. Combine tres reacciones de PCR en dos tubos de microcentrífuga siliconados de 1,5 mililitros, agregue 27 microlitros de cloruro de sodio de cinco molares y 950 microlitros de etanol al 100%.Invierta los tubos para mezclar y colóquelos a 20 grados centígrados durante la noche para precipitar los productos de PCR. Utilizando el protocolo, se determinó la correlación de la expresión de micro ARN entre los dos ARN tumorales frescos congelados y sus contrapartes específicas de muestras de FFPERNA. Los gráficos entre micro ARN fresco congelado y FFPE emparejados indican que la preparación de la biblioteca CDNA proporciona una buena reproducibilidad, ya que existe una alta correlación entre los microARN detectados en muestras procesadas de manera diferente.Para determinar si el protocolo optimizado de preparación de la Biblioteca CNDA era aplicable y reproducible con especímenes de FFPE cada vez más antiguos, se obtuvieron perfiles de expresión de micro ARN de tejidos FFPE archivados durante 18, 20, 22, 27, 30 y 35 años. El coeficiente de correlación se mantuvo por encima de 0,96 independientemente de la edad del ejemplar o de la semana de preparación de la biblioteca. Por lo tanto, el protocolo optimizado de preparación de la biblioteca CDNA proporciona una herramienta robusta para el análisis reproducible de muestras FFPE, independientemente de su tiempo de archivo.Por lo tanto, después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo preparar sus pequeñas bibliotecas de ARN y obtener un perfil de microexpresión completo de todos sus valiosos especímenes formales y fijos incrustados en parafina.

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La secuencia retrospectiva MicroRNA: ADN complementario biblioteca preparación protocolo utilizando a muestras de ARN de parafina-encajado formalina-fijo (Video) | JoVE Journal

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