Name: La secuencia retrospectiva MicroRNA: ADN complementario biblioteca preparación protocolo utilizando a muestras de ARN de parafina-encajado formalina-fijo (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-05-05T13:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 24 s
Description: Aprende a preparar bibliotecas de ADN complementario para secuenciar microARNs de muestras de tejido fijadas en formalina y embebidas en parafina. Este protocolo permite analizar hasta 18 especímenes archivados durante 35 años.

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Agradecemos al Dr. Thomas Tuschl, jefe del laboratorio de biología molecular de RNA, así como los miembros de su laboratorio por su apoyo y por compartir la tecnología desarrollada en su laboratorio, proporcionando acceso a la tubería de RNAworld. También agradecemos a Dr. Markus Hafner para compartir su Protocolo y proporcionar descripciones detalladas sobre todos los pasos bioquímicos y enzimáticos utilizados en su procedimiento inicial.

<ol><li>Peiró-Chova, L., Peña-Chilet, M., López-, J. A., García-Gimenez, J. L., Alonso-Yuste, E., Burgues, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+stability+of+microRNAs+in+tissue+samples+of+compromised+quality%5BTitle%5D)+AND+%22Virchows.+Arch%22%5BJournal%5D)">High stability of microRNAs in tissue samples of compromised quality.</a> Virchows. Arch. 463, 765-774 (2013).</li>
<li>Klopfleisch, R., Weiss, A. T., Gruber, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Excavation+of+a+buried+treasure--DNA%2C+mRNA%2C+miRNA+and+protein+analysis+in+formalin+fixed%2C+paraffin+embedded+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Histol.+Histopathol%22%5BJournal%5D)">Excavation of a buried treasure--DNA, mRNA, miRNA and protein analysis in formalin fixed, paraffin embedded tissues.</a> Histol. Histopathol. 26, 797-810 (2011).</li>
<li>Kakimoto, Y., Kamiguchi, H., Ochiai, E., Satoh, F., Osawa, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNA+Stability+in+Postmortem+FFPE+Tissues%3A+Quantitative+Analysis+Using+Autoptic+Samples+from+Acute+Myocardial+Infarction+Patients%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">MicroRNA Stability in Postmortem FFPE Tissues: Quantitative Analysis Using Autoptic Samples from Acute Myocardial Infarction Patients.</a> PLoS One. 10 (6), e0129338(2015).</li>
<li>Giricz, O., Reynolds, P. A., Ramnauth, A., Liu, C., Wang, T., Stead, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hsa-miR-375+is+differentially+expressed+during+breast+lobular+neoplasia+and+promotes+loss+of+mammary+acinar+polarity%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Pathol%22%5BJournal%5D)">Hsa-miR-375 is differentially expressed during breast lobular neoplasia and promotes loss of mammary acinar polarity.</a> J. Pathol. 226, 108-119 (2012).</li>
<li>Hui, A. B., Shi, W., Boutros, P. C., Miller, N., Pintilie, M., Fyles, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Robust+global+micro-RNA+profiling+with+formalin-fixed+paraffin-embedded+breast+cancer+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Lab.+Invest%22%5BJournal%5D)">Robust global micro-RNA profiling with formalin-fixed paraffin-embedded breast cancer tissues.</a> Lab. Invest. 89, 597-606 (2009).</li>
<li>Zhang, X., Chen, J., Radcliffe, T., Lebrun, D. P., Tron, V. A., Feilotter, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+array-based+analysis+of+microRNA+expression+comparing+matched+frozen+and+formalin-fixed+paraffin-embedded+human+tissue+samples%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mol.+Diagn%22%5BJournal%5D)">An array-based analysis of microRNA expression comparing matched frozen and formalin-fixed paraffin-embedded human tissue samples.</a> J. Mol. Diagn. 10, 513-519 (2008).</li>
<li>Kolbert, C. P., Feddersen, R. M., Rakhshan, F., Grill, D. E., Simon, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multi-platform+analysis+of+microRNA+expression+measurements+in+RNA+from+fresh+frozen+and+FFPE+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Multi-platform analysis of microRNA expression measurements in RNA from fresh frozen and FFPE tissues.</a> PLoS One. 8, e52517(2013).</li>
<li>Meng, W., McElroy, J. P., Volinia, S., Palatini, J., Warner, S., Ayers, L. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+microRNA+deep+sequencing+of+matched+formalin-fixed+paraffin-embedded+and+fresh+frozen+cancer+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Comparison of microRNA deep sequencing of matched formalin-fixed paraffin-embedded and fresh frozen cancer tissues.</a> PLoS One. 8 (5), e64393(2013).</li>
<li>Liu, A., Tetzlaff, M. T., Vanbelle, P., Elder, D., Feldman, M., Tobias, J. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNA+expression+profiling+outperforms+mRNA+expression+profiling+in+formalin-fixed+paraffin-embedded+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Clin.+Exp.+Pathol%22%5BJournal%5D)">MicroRNA expression profiling outperforms mRNA expression profiling in formalin-fixed paraffin-embedded tissues.</a> Int. J. Clin. Exp. Pathol. 2, 519-527 (2009).</li>
<li>Dijkstra, J. R., Mekenkamp, L. J., Teerenstra, S., De Krijger, I., Nagtegaal, I. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNA+expression+in+formalin-fixed+paraffin+embedded+tissue+using+real+time+quantitative+PCR%3A+the+strengths+and+pitfalls%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Mol+Med%22%5BJournal%5D)">MicroRNA expression in formalin-fixed paraffin embedded tissue using real time quantitative PCR: the strengths and pitfalls.</a> J Cell Mol Med. 16, 683-690 (2012).</li>
<li>Siebolts, U., Varnholt, H., Drebber, U., Dienes, H. P., Wickenhauser, C., Odenthal, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissues+from+routine+pathology+archives+are+suitable+for+microRNA+analyses+by+quantitative+PCR%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Pathol%22%5BJournal%5D)">Tissues from routine pathology archives are suitable for microRNA analyses by quantitative PCR.</a> J. Clin. Pathol. 62, 84-88 (2009).</li>
<li>Jang, J. S., Simon, V. A., Feddersen, R. M., Rakhshan, F., Schultz, D. A., Zschunke, M. A., Lingle, W. L., Kolbert, C. P., Jen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+miRNA+expression+analysis+using+fluidigm+microfluidics+dynamic+arrays%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Genomics%22%5BJournal%5D)">Quantitative miRNA expression analysis using fluidigm microfluidics dynamic arrays.</a> BMC Genomics. 12, 144(2011).</li>
<li>Andreasen, D., Fog, J. U., Biggs, W., Salomon, J., Dahslveen, I. K., Baker, A., Mouritzen, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+microRNA+quantification+in+total+RNA+from+clinical+samples%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Improved microRNA quantification in total RNA from clinical samples.</a> Methods. 50 (4), S6-S9 (2010).</li>
<li>Kelly, A. D., Hill, K. E., Correll, M., Wang, Y. E., Rubio, R., Duan, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Next-generation+sequencing+and+microarray-based+interrogation+of+microRNAs+from+formalin-fixed%2C+paraffin-embedded+tissue%3A+preliminary+assessment+of+cross-platform+concordance%5BTitle%5D)+AND+%22Genomics%22%5BJournal%5D)">Next-generation sequencing and microarray-based interrogation of microRNAs from formalin-fixed, paraffin-embedded tissue: preliminary assessment of cross-platform concordance.</a> Genomics. 102, 8-14 (2013).</li>
<li>Visone, R., Croce, C. M. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC2671346/">MiRNAs and cancer.</a> Am. J. Pathol. 174, 1131-1138 (2009).</li>
<li>Lu, J., Getz, G., Miska, E. A., Alvarez-Saavedra, E., Lamb, J., Peck, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNA+expression+profiles+classify+human+cancers%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">MicroRNA expression profiles classify human cancers.</a> Nature. 435, 834-838 (2005).</li>
<li>Cho, W. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNAs%3A+potential+biomarkers+for+cancer+diagnosis%2C+prognosis+and+targets+for+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Biochem.+Cell.+Biol%22%5BJournal%5D)">MicroRNAs: potential biomarkers for cancer diagnosis, prognosis and targets for therapy.</a> Int. J. Biochem. Cell. Biol. 42, 1273-1281 (2010).</li>
<li>Hui, A., How, C., Ito, E., Liu, F. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Micro-RNAs+as+diagnostic+or+prognostic+markers+in+human+epithelial+malignancies%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Cancer%22%5BJournal%5D)">Micro-RNAs as diagnostic or prognostic markers in human epithelial malignancies.</a> BMC Cancer. 11, 500(2011).</li>
<li>Tam, S., de Borja, R., Tsao, M. S., McPherson, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Robust+global+microRNA+expression+profiling+using+next-generation+sequencing+technologies%5BTitle%5D)+AND+%22Lab.+Invest%22%5BJournal%5D)">Robust global microRNA expression profiling using next-generation sequencing technologies.</a> Lab. Invest. 94, 350-358 (2014).</li>
<li>Loudig, O., Wan, T., Ye, K., Lin, J., Wang, Y., Ramnauth, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+and+Adaptation+of+a+Laboratory+Based+cDNA+Library+Preparation+Protocol+for+Retrospective+Sequencing+of+Archived+MicroRNAs+from+up+to+35-Year-Old+Clinical+FFPE+Specimens%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Mol+Sci%22%5BJournal%5D)">Evaluation and Adaptation of a Laboratory Based cDNA Library Preparation Protocol for Retrospective Sequencing of Archived MicroRNAs from up to 35-Year-Old Clinical FFPE Specimens.</a> Int J Mol Sci. 18, e627(2017).</li>
<li>Kotorashvili, A., Ramnauth, A., Liu, C., Lin, J., Ye, K., Kim, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effective+DNA%2FRNA+co-extraction+for+analysis+of+microRNAs%2C+mRNAs%2C+and+genomic+DNA+from+formalin-fixed+paraffin-embedded+specimens%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Effective DNA/RNA co-extraction for analysis of microRNAs, mRNAs, and genomic DNA from formalin-fixed paraffin-embedded specimens.</a> PLoS One. 7 (4), e34683(2012).</li>
<li>Hafner, M., Renwick, N., Farazi, T. A., Mihailović, A., Pena, J. T., Tuschl, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Barcoded+cDNA+library+preparation+for+small+RNA+profiling+by+next-generation+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Barcoded cDNA library preparation for small RNA profiling by next-generation sequencing.</a> Methods. 58 (2), 164-170 (2012).</li>
<li>Loudig, O., Brandwein-Gensler, M., Kim, R. S., Lin, J., Isayeva, T., Liu, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Illumina+whole-genome+complementary+DNA-mediated+annealing%2C+selection%2C+extension+and+ligation+platform%3A+assessing+its+performance+in+formalin-fixed%2C+paraffin-embedded+samples+and+identifying+invasion+pattern-related+genes+in+oral+squamous+cell+carcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22Hum.+Pathol%22%5BJournal%5D)">Illumina whole-genome complementary DNA-mediated annealing, selection, extension and ligation platform: assessing its performance in formalin-fixed, paraffin-embedded samples and identifying invasion pattern-related genes in oral squamous cell carcinoma.</a> Hum. Pathol. 42 (12), 1911-1922 (2011).</li>
</ol>

Los autores desean revelar que una publicación que contiene algunos de los datos presentados en este manuscrito fue publicada en la revista internacional de Ciencias moleculares por Loudig et al. 21.

Un protocolo de preparación de biblioteca de cDNA altamente reproducible y robusto para NGS de small RNAs en muestras de ARN FFPE se presenta en el presente Protocolo, que es una versión modificada y optimizada del procedimiento descrito por Hafner et al. 22
Todos los pasos de este protocolo han sido optimizados para el uso con mayores archivado y comprometido ARN total recuperado de muestras FFPE. El paso fundamental de este protocolo, para el procesamiento de...

miRNAs son notablemente bien conservadas en formalina-fijo parafina-encajado (FFPE) muestras1,2,3. Trabajo previo ha demostrado que la expresión de estos cortos no codificantes solo trenzado RNA moléculas reguladoras puede ser evaluado con éxito utilizando ARN total de las muestras FFPE y proporcionar datos de expresión de genes relevantes en comparación con el fresco original los tejidos4,5,6,7,8. En comparación con el tamaño grande mensajero RNAs, que han demostrado ser afectados críticamente por FFPE procesamiento de tejido (formaldehído, calor, desecación, etc.), RNasas endógenas y la edad de las muestras, el tamaño pequeño de miRNAs (~ 18-24 nucleótidos) parece hacerlos resistentes al almacenamiento a largo plazo, también se demostró mediante estudios de expresión de miRNA que superan los estudios de mRNA de alto rendimiento en especímenes archivados9y resistente a la degradación. estudios de expresión de miRNA utilizando muestras clínicas archivadas, que en su mayoría se han realizado análisis en pequeña escala, han demostrado que solo o multiplexado ensayos PCR cuantitativos, diferentes tipos de tecnologías microarrays y más recientemente NGS puede utilizarse para evaluar la expresión de miRNAs conservada después de la optimización de estos ensayos10,11,12,13,14.
Dado que la desregulación de la expresión del miRNA se ha asociado con el desarrollo de una variedad de malignidades humanas y que es potencialmente una fuente enorme de clínico anotado muestras archivadas, se ha puesto de manifiesto que estos ARN pequeño las moléculas representan una fuente prometedora de potenciales biomarcadores de cáncer15,16,de17,18. El uso de una tecnología de expresión de gen de alto rendimiento como NGS tiene la ventaja de proporcionar una evaluación global de todas las transcripciones de miRNA en comparación con tecnologías específicas tales como PCR y microarrays de19. Por esta razón, se ha optimizado un protocolo optimizado, asequible y fácilmente aplicable para la preparación de la biblioteca del cDNA de ARNs pequeños de más viejos especímenes archivados para NGS para estudios a gran escala20.
Anteriormente establecimos un protocolo de extracción de ARN/ADN simultánea para recuperación separada de ARN y ADN de ejemplares archivados más viejos, que hemos encontrado para superar a kits comerciales contemporáneo21. Utilizando este protocolo de extracción, para obtener el ARN total de tejidos FFPE archivados durante un período prolongado de tiempo, hemos optimizado la preparación de las bibliotecas de cDNA para NGS de miRNAs conservado en las muestras clínicas de hasta 35 años. Además, en un estudio recientemente publicado donde preparamos las bibliotecas de cDNA de clasificados clínicamente carcinoma ductal en situ muestras (CDIS), identificamos diferencialmente expresado miRNAs que fueron validados por PCR cuantitativa, que indica que cambios de expresión de miRNA específico pueden ser detectables en las lesiones de CDIS de los pacientes que desarrollan cáncer de mama en comparación con las lesiones de CDIS de los pacientes que desarrollan cáncer de mama.
Teniendo en cuenta el costo de los kits comerciales para la preparación de pequeñas bibliotecas de cDNA RNA, el potencial de su interrupción, así como el uso de reactivos protegidas por derechos de autor/patentes que no se pueden optimizar, decidimos adaptar previamente publicados en laboratorio y sin kit de 3' barras cDNA biblioteca preparación protocolo para NGS de small RNAs en especímenes FFPE, lo que permite el análisis simultáneo de 18 muestras de22. Este protocolo proporciona un procedimiento paso a paso ideal y robusto con puestos de control de evaluación visual y técnico, que eran críticos para la adaptación a las muestras de RNA FFPE, y tiene un gran potencial para su aplicación a otras fuentes de peligro o dificultad utilizar material de RNA. Aplicabilidad del protocolo original fue mejorada mediante la sustitución de marcadores de tamaño radiactivo marcado con fluorescente (p. ej., oro de SYBR) detectable RNA tamaño los marcadores usados durante la selección de bibliotecas ligadas en geles de poliacrilamida grandes. Este protocolo optimizado se basa en la ligación de código de barras adaptadores de 3' a 18 muestras individuales de FFPE ARN, que son luego agruparon para someterse a la ligadura de 5' adaptador, reverso-transcripción y un piloto análisis PCR para amplificación del cDNA final adaptado biblioteca antes de la amplificación, purificación y NGS a gran escala de PCR en un secuenciador de alto rendimiento.

<table><tbody><tr><td>1% Triton x-100</td><td>Invitrogen</td><td>HFH10</td><td></td></tr><tr><td>10mM</td><td>ATP Ambion</td><td>AM8110G</td><td></td></tr><tr><td>10X dNTPs</td><td>Ambion</td><td>AM8110G</td><td></td></tr><tr><td>10x TBE</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>15581044</td><td></td></tr><tr><td>14M Mercaptoethanol</td><td>Sigma</td><td>O3445I-100</td><td></td></tr><tr><td>escalera de 20 nt</td><td>Jena Bioscience</td><td>M-232S</td><td></td></tr><tr><td>20mg/ml Albúmina sérica bovina</td><td>Sigma</td><td>B8894-5ML</td><td></td></tr><tr><td>50X Taq de titanio</td><td>Laboratorios Clontech</td><td></td> Persulfato de amonio 639208 <td></td></tr><tr><td>Fisher</td><td>Scientific</td><td>7727-54-0</td><td></td></tr><tr><td>BRL Sistema de electroforesis de gel vertical con placas y peines de vidrio</td><td>GIBCO</td><td>V16</td><td></td></tr><tr><td>Dimethyl sulfoxide (DMSO)</td><td>Sigma</td><td>D9170-5VL</td><td></td></tr><tr><td>Microcentrífuga Eppendorf 5424R</td><td>EE. UU. científica</td><td>4054-4537Q</td><td></td></tr><tr><td>Eppndorf Thermomixer</td><td>EE. UU. científica</td><td>4053-8223Q</td><td></td></tr><tr><td>Fisherbrand&trade; Tubos de microcentrífuga siliconados de baja retención 1,5 ml</td><td>Fisher Scientific</td><td>02-681-320</td><td></td></tr><tr><td>Tubo rompedor de gel 0,5 ml</td><td>IST Engineering Inc,3388-100</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>Aparato de electroforesis en gel 7cm x10cm- Mini-sub Cell GT con bandejas de gel y peines</td><td>Biorad</td><td></td> 1704446 <td></td></tr><tr><td>Glycoblue</td><td>Ambion</td><td>AM9516</td><td></td></tr><tr><td>Jersey-Cote</td><td>LabScientific, Inc</td><td>1188</td><td></td></tr><tr><td>KcL 2M</td><td>Ambion</td><td>AM9640G</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2 1M</td><td>Ambion</td><td>AM9530G</td><td></td></tr><tr><td>Minifuge centrífuga personal de doble rotor</td><td>USA scientific</td><td>2641-0016</td><td></td></tr><tr><td>Modelo V16 Aparato de electroforesis en gel de poliacrilamida, gafas, peines y espaciadores</td><td>Ciore Life Science</td><td>21070010</td><td></td></tr><tr><td>Oligonucleótidos</td><td></td><td>IDT Definido durante el pedido</td><td></td></tr><tr><td>Owl EasyCast B2 mini sistema de electroforesis- con bandejas de gel y peines Thermofisher</td><td>Scientific</td><td>B2</td><td></td></tr><tr><td>Qiaquick Kit de extracción de gel</td><td>Qiagen</td><td>28704</td><td></td></tr><tr><td>Enzima de restricción PmeI</td><td>NEB</td><td>R0560S</td><td></td></tr><tr><td>Agua libre de ARNasa</td><td>Ambion</td><td>AM9932</td><td></td></tr><tr><td>Safe Imager 2.0</td><td>Life Technologies</td><td>G6600</td><td></td></tr><tr><td>Safe Imager 2.0 transiluminador de luz azul</td><td>Thermofisher</td><td>G6600</td><td></td></tr><tr><td>SeaKem LE agarosa</td><td>Lonza</td><td>50002</td><td></td></tr><tr><td>Superscript III kit de transcripción inversa</td><td>Invitrogen</td><td>18080-044</td><td></td></tr><tr><td>SybrGold</td><td>Life Technologies</td><td>S11494</td><td></td></tr><tr><td>T4 ARN ligasa 1</td><td>NEB</td><td>M0204S</td><td></td></tr><tr><td>T4 ARN ligasa 2 Truncado K227Q</td><td>NEB</td><td>0351L</td><td></td></tr><tr><td>TEMED</td><td>Fisher Scientific</td><td>O3446I-100</td><td></td></tr><tr><td>Themocycler con tapa calefactada</td><td>Biosystem aplicado</td><td>4359659</td><td></td></tr><tr><td>Tris 1M pH 7.5</td><td>Invitrogen</td><td>15567027</td><td></td></tr><tr><td>Tris 1M pH8.0</td><td>Ambion</td><td>AM9855G</td><td></td></tr><tr><td>UltraPure Sistema Sequagel concentrado, diluyente y tampón</td><td>Nacional Diagnóstico</td><td>EC-833</td><td></td></tr></tbody></table>

la secuencia retrospectiva microrna: adn complementario biblioteca preparación protocolo utilizando a muestras de arn de parafina-encajado formalina-fijo

Retrospective MicroRNA Sequencing: Complementary DNA Library Preparation Protocol Using Formalin-fixed Paraffin-embedded RNA Specimens

– Archivar, clasificar clínicamente formalina-fijo tejidos parafina-encajados de (FFPE) pueden prever ácidos nucleicos estudios moleculares del desarrollo del cáncer. Mediante el uso de no-invasiva lesiones malignas o premalignas en pacientes que posteriormente desarrollan enfermedad invasiva, análisis de expresión génica podrán ayudar a identificar alteraciones moleculares tempranas que predisponen al riesgo de cáncer. Se ha descrito también que los ácidos nucleicos de los tejidos FFPE han sufrido graves daños y modificaciones químicas, que dificultan su análisis y generalmente requiere ensayos adaptados. MicroRNAs (miRNAs), sin embargo, que representan una pequeña clase de moléculas de ARN que abarca sólo a ~ 18-24 nucleótidos, se han demostrado para soportar el almacenamiento a largo plazo y se han analizado con éxito en muestras FFPE. Aquí presentamos un 3' con código de barras ADN (cDNA) Biblioteca preparación Protocolo complementario específicamente optimizado para el análisis de small RNAs extraído de tejidos archivados, que recientemente fue demostrado para ser robusto y altamente reproducible cuando uso de archivada especímenes clínicos almacenados hasta por 35 años. Esta preparación de biblioteca se adapta bien al análisis multiplex de material comprometido/degradados donde las muestras de RNA (hasta 18) ligadas con los adaptadores de código de barras individual de 3' y entonces agruparon para posteriores preparaciones enzimáticas y bioquímicas antes del análisis. Se realizan purificaciones todos por electroforesis en gel de poliacrilamida (PAGE), que permite selecciones específicas de tamaño y riquezas de especies pequeñas de RNA con código de barras. Esta preparación de la biblioteca de cDNA se adapta bien a minuto entradas de RNA, como una reacción en cadena de piloto de la polimerasa (PCR) permite la determinación de un ciclo de amplificación específica para producir cantidades óptimas de material para la secuenciación de próxima generación (NGS). Este enfoque se ha optimizado para el uso de degradados de FFPE de ARN de muestras archivadas de hasta 35 años y proporciona datos NGS altamente reproducibles.

Como se describe en el método, un total de 18 muestras individuales de ARN FFPE (100 ng cada) se colocan en tubos separados a 3' adenylated con código de barras del oligonucleótido T4 la ligadura durante la noche. Al día siguiente, las reacciones enzimáticas son desactivados por calor combinadas y precipitadas en un solo tubo. Se resuspendió el pellet de RNA y las moléculas de ARN ligadas están separadas en un gel de poliacrilamida (PAGE), donde se utilizan marcadores de RNA del oligonucl...

Muestras de parafina-encajado formalina-fijos representan una valiosa fuente de biomarcadores moleculares de las enfermedades humanas. Aquí presentamos un protocolo de preparación Biblioteca de cDNA en laboratorio, inicialmente diseñado con ARN congelado fresco y optimizado para el análisis de los microRNAs de tejidos almacenan hasta 35 años.

La secuencia retrospectiva MicroRNA: ADN complementario biblioteca preparación protocolo utilizando a muestras de ARN de parafina-encajado formalina-fijo

&#8211;Archived, clinically classified formalin-fixed paraffin-embedded (FFPE) tissues can provide nucleic acids for retrospective molecular studies of ...

El objetivo general de esta preparación de la biblioteca CDNA es permitir la secuenciación exitosa de ARN pequeños que se han almacenado en tejidos formales y fijos incluidos en parafina. Este método es muy útil para el análisis de muestras formales y fijas incrustadas en parafina. Se extrae ARN de hasta 18 muestras, se analiza el contenido de todas ellas y se obtiene un perfil de todas las microARNasas para todas las muestras.Para comenzar el protocolo, agregue 8,5 microlitros de mezcla maestra de ligadura previamente preparada a cada una de las 18 muestras de FFPERNA alícuotas individualmente. Agite suavemente los tubos y centrifugue durante dos segundos. Después de centrifugar, guarde los tubos en hielo.Utilice una pipeta de tres microlitros para transferir un microlitro de cada adaptador, a las muestras FFPERNA correspondientes que contengan ARN y mezcla maestra de ligadura. No pipetee hacia arriba y hacia abajo, y cambie las puntas entre las muestras de FFPERNA. Cierre cada tubo, gírelos para mezclarlos y centrifuérrelos durante dos segundos.Coloca los tubos en hielo. Desnaturalice las reacciones colocando los tubos en un bloque de calor a 90 grados centígrados durante un minu

retrospective-microrna-sequencing-complementary-dna-library

Research

Investigación

JoVE Journal

Genetics

Genética

Describimos un método basado en la secuenciación de ARN dirigido que incluye la preparación de bibliotecas de ADNc indexadas, hibridación y captura con sondas personalizadas y análisis de datos para interrogar transcripciones seleccionadas para la expresión génica, mutaciones y fusiones de genes. Targeted RNAseq permite una evaluación rápida y rentable de transcripciones seleccionadas en un secuenciador de escritorio.

La secuenciación de ARN dirigidos Ensayo para caracterizar la expresión génica y la genómica alteraciones

Este protocolo modificado de extracción mejora de ARN y ADN rendimientos de las regiones seleccionadas, más precisamente de interés en los bloques de tejido histopatológicos.

Preparación de núcleos de tejido incluidas en parafina fijadas con formalina para ambos RNA y DNA Extraction

Este protocolo proporciona un resumen de los procedimientos para el aislamiento de ARN para los perfiles transcriptómicos de nodo de linfa tejidos de animales grandes, incluyendo pasos en la identificación y extirpación de los ganglios linfáticos de ganado y la fauna, métodos de muestreo para proporcionar consistencia en varios animales y consideraciones más resultados representativos para la conservación de la colección y procesamiento de análisis de ARN.

Recogida y tratamiento de los ganglios linfáticos de animales grandes para el análisis de ARN: preparación para estudios de nodo de linfa transcriptómicos de grandes especies animales

Este protocolo ofrece a los investigadores una nueva herramienta para controlar la fidelidad de la transcripción en organismos modelo múltiples.

Vigilancia de todo el genoma de errores de transcripción en organismos eucariotas

Los ARN circulares (arnar) son ARN no codificantes que pueden tener funciones en la regulación transcripcional y en las interacciones mediantantes entre proteínas. Tras la evaluación de los diferentes parámetros para la construcción de bibliotecas de secuenciación de circRNA, se compiló un protocolo utilizando la preparación total de la biblioteca de ARN varada con el pretratamiento RNase R y se presenta aquí.

Identificación de ARN circulares mediante secuenciación de ARN

Presentamos un protocolo detallado de reparación de la biblioteca de ARN pequeño con menos sesgo que los métodos estándar y una mayor sensibilidad para los ARN de 2'-O-metil. Este protocolo se puede seguir utilizando reactivos caseros para ahorrar costos o usar kits para mayor comodidad.

Mejora de ARN pequeño-seq: Menos sesgo y mejor detección de 2'-O-Metil RNAs

La resistencia a la terapia a menudo se desarrolla en pacientes con cáncer de próstata avanzado, y en algunos casos, el cáncer progresa a un subtipo letal llamado cáncer de próstata neuroendocrino. Evaluar los pequeños cambios moleculares no codificantes mediados por ARN que facilitan esta transición permitiría una mejor estratificación de enfermedades e identificación de mecanismos causales que conducen al desarrollo de cáncer de próstata neuroendocrino.

Secuenciación de ARN pequeño no codificante de tejidos fijos de formalina y exosomas derivados del suero de pacientes con cáncer de próstata resistente a la castración

Describimos una técnica para perfilar microARN en embriones de ratón tempranos. Este protocolo supera el desafío de la entrada de células bajas y el enriquecimiento de ARN pequeño. Este ensayo se puede utilizar para analizar los cambios en la expresión de miRNA a lo largo del tiempo en diferentes linajes celulares del embrión de ratón temprano.

Preparación de pequeñas bibliotecas de ARN para la secuenciación de embriones de ratón tempranos

Este protocolo describe un método para aislar ARN de regiones histológicas definidas de tejido hepático de ratón incrustado en compuesto de paraformaldehído y compuesto de Temperatura Óptima de Corte mediante microdissección por captura láser, permitiendo un análisis dirigido de expresión génica posterior.

Microdisección por captura láser de tejido hepático de ratón fijado con paraformaldehído para análisis de ARN

Aquí se presenta un protocolo para investigar la metilación del ADN del genoma de ancho en estudios de cribado de pacientes clínicos a gran escala utilizando la secuenciación Metil-unión de captura de ADN (SEC-MBDCap o MBD-ss) la tecnología y el análisis de tuberías bioinformática posteriores.

Secuenciación de captura de ADN de unión a metil-para tejidos del paciente

Aprende a preparar bibliotecas de ADN complementario para secuenciar microARNs de muestras de tejido fijadas en formalina y embebidas en parafina. Este protocolo permite analizar hasta 18 especímenes archivados durante 35 años.

La secuencia retrospectiva MicroRNA: ADN complementario biblioteca preparación protocolo utilizando a muestras de ARN de parafina-encajado formalina-fijo (Video) | JoVE Journal

La secuencia retrospectiva MicroRNA: ADN complementario biblioteca preparación protocolo utilizando a muestras de ARN de parafina-encajado formalina-fijo

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