Name: Protocolo para la transferencia de microARN en médula ósea hematopoyéticas células madre adultas para permitir ingeniería celular combinado con orientación magnética (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-06-18T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 37 s
Description: Aprende a transferir microARN en células madre hematopoyéticas CD133+ mediante transfección no viral con nanopartículas magnéticas. Este método seguro permite la ingeniería celular transitoria con monitoreo por resonancia magnética.

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Este trabajo fue financiado por el Ministerio Federal de educación, investigación de Alemania (FKZ 0312138A y 316159 FKZ), la estado Mecklenburg-Western Pomerania con fondos estructurales (FSE/IVWM-B34-0030/10 y FSE/IVBM-B35-0010/12) y DFG (DA1296/2-1), el Fundación de corazón alemán (01/12/F), el BMBF (VIP + 00240) y la Fundación húmeda. Además, F.H. y P.M. son apoyados por el Cajamarca programa de Rostock University Centro médico (889001).

Los autores no declaran conflicto de intereses.

En los últimos años, CD133+ SCs han surgido como una población prometedora de células para terapias basadas en la SC según lo evidenciado por varias fase I, II y III ensayos clínicos43,44,45,46, 47 , 48 , 49 , 50 , 51...

CD133+ SCs representan una población heterogénea de células de vástago y del progenitor con prometedor potencial para la medicina regenerativa. Su diferenciación Hematopoyética, endoteliales y miógeno potencial1,2,3 permite la CD133+ de las células, por ejemplo, para contribuir a los procesos de neovascularización a través de la diferenciación en la formación de nuevos vasos y la activación de pro-angiogénica señalización paracrina mecanismos4,5,6,7.
A pesar de su alto potencial demostrado en más de 30 ensayos clínicos aprobados (ClinicalTrails.gov), su resultado terapéutico todavía está bajo discusión controversial4. De hecho, una aplicación clínica de SCs se ve obstaculizada por la baja retención en el órgano de interés y de la célula inicial masiva muerte5,8,9. Adicional de CD133+ SCs trasplante previo podría ayudar a superar estos desafíos.
Un requisito para una terapia celular eficiente sería la reducción de la muerte de la célula inicial masiva para mejorar el engraftment de células pertinentes terapéutica10. Los estudios actuales demuestran una pérdida inmensa de la célula del 90 – 99% en órganos altamente perfundidos como el cerebro y el corazón durante las primeras 1-2 h, independientemente del tipo de célula trasplantado o aplicación ruta11,12,13 ,14,15,16,17,18,19,20,21. SC etiquetado utilizando nanopartículas magnéticas (MNPs) permite una estrategia invasiva innovadora a las células blanco para el sitio de interés22,23,24,25,26 y al mismo tiempo permite el celular control usando MRI27 y partículas magnéticas (MPI) la proyección de imagen. Más eficiente en vivo estudios aplicando células magnetizadas a retención celular usado después de la administración local preferentemente dirección de celda después de inyección intravenosa23,24,28 . Por lo tanto, nuestro grupo diseñó un sistema de entrega que consta de óxido de hierro superparamagnético nanopartículas29. Con esta técnica, CD133+ SCs y las células endoteliales de vena umbilical humano (HUVECs) eficiente podrían ser objetivo, como lo demuestra en vitro trata de30,31.
Otro obstáculo para las terapias de la SC es el hostil entorno inflamatorio del tejido afectado después del trasplante, que contribuye a la muerte celular inicial del32. Además de varios estudios de acondicionamiento previo, la aplicación de terapéuticas relevantes miRs fue probado33; se ha demostrado con éxito que la anti-apoptotic miRs inhiben apoptosis en vitro y el engraftment de la célula en vivo33. Estas moléculas pequeñas, compuesto por 20-25 nucleótidos, desempeñan un papel crucial como moduladores postranscripcional de mensajero RNAs (mRNAs) y así afectan el destino y el comportamiento de la célula de vástago34. Por otra parte, la introducción exógena de miRs evitar la no deseada integración estable en el anfitrión genoma34.
Intentos actuales para la introducción eficiente de los ácidos nucleicos (NAs) en SCs primarios en su mayoría se basan en virus recombinantes8,35. A pesar de la eficacia de transfección alta manipulación de virus recombinante presenta un gran obstáculo para una traducción de banco a cabecera, p. ej., expresión génica incontrolable, patogenicidad, inmunogenicidad y mutagénesis de insertional35 ,36. Por lo tanto, son críticos para desarrollar sistemas de vectores no virales como construcciones basados en polímeros. Entre los, polietilenimina (PEI) representa un vehículo de entrega válida que ofrece beneficios para la miRs como condensación de NA para proteger de la degradación, absorción celular, y liberación intracelular a través de endosomal escapar37,38. Además, complejos de miR-PEI demostraron una alta biocompatibilidad en ensayos clínicos39. Por lo tanto, nuestro sistema consiste en un biotinilado ramificado 25 kDa PEI enlazado a un cubierto de streptavidin MNP-core30,31,40.
En este manuscrito, presentamos un protocolo completo que describe (i) el aislamiento manual de CD133+ SC de donación de médula ósea humana (BM) con una caracterización detallada del producto de SC y (ii) una estrategia de transfección eficiente y suave de un sistema de entrega basados en polímeros magnéticamente no-virales para la ingeniería genética de CD133+ SCs utilizando miRs. CD133+ SCs son aislados y magnéticamente enriquecido de humano aspira BM esternal utilizando una superficie basados en anticuerpos activada por el magnético celular (MACS) sistema de clasificación. Luego, la viabilidad de las células, así como la pureza de la célula se analiza mediante citometría de flujo. Posteriormente, se preparan el miR/PEI/MNP complejos y CD133+ SCs son transfectadas. 18 h después de la transfección, la eficiencia de la absorción y el impacto de la transfección en SC marcador expresión celular la viabilidad y se analizan. Por otra parte, la evaluación de la distribución intracelular de los compuestos complejos de transfección se realiza utilizando etiquetado del cuatro-color y microscopía de iluminación estructurada (SIM).

<table><tbody><tr><td>7-AAD</td><td>BD Biosciences</td><td>559925</td><td></td></tr><tr><td>Ácido acético con azul de metileno</td><td>Tecnologías de células madre</td><td>7060</td><td>3%</td></tr><tr><td>anti-CD133/2-PE (clon: 293C3)</td><td>Miltenyi Biotec GmbH</td><td>130-090-853</td><td></td></tr><tr><td>anti-CD34-FITC (clon: AC136)</td><td>Miltenyi Biotec GmbH</td><td>130-081-001</td><td></td></tr><tr><td>anti-CD45-APC-H7 (clon: 2D1)</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td></td>560178</tr><tr><td>tinte de rodamina; Colorante Atto 565 conjugado con biotina</td><td>ATTO-TEC GmbH</td><td>AD 565-71</td><td></td></tr><tr><td>BD FACS LSRII citómetro de flujo</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>BD FACSDiva Software 6.1.2</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma-Aldrich GmbH</td><td>A7906</td><td></td></tr><tr><td>CD133 partículas superparamagnéticas de hierro dextrano unidas a anticuerpos; CD133 MicroBead Kit</td><td>Miltenyi Biotec GmbH</td><td>130-097-049</td><td></td></tr><tr><td>colagenasa B</td><td>Roche Diagnostics GmbH</td><td>11088831001</td><td></td></tr><tr><td>cámara de recuento</td><td>Paul Marienfeld GmbH & Co. KG</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cianina 3 colorante marcado precursor miR; Cy3 Colore-Marked Pre-miR Negative Control #1</td><td>Ambion</td><td>AM17120</td><td></td></tr><tr><td>Kit de etiquetado Cyanine 5 Dye miR; Kit de etiquetado de miARN Cy5 Label IT</td><td>Mirus Bio</td><td>MIR 9650</td><td></td></tr><tr><td>DNAse I</td><td>Roche Diagnostics GmbH</td><td>10104159001</td><td>(100 U/mL)</td></tr><tr><td>ELYRA PS.1 LSM 780 microscopio confocal</td><td>Carl Zeiss Jena GmbH</td><td></td><td></td></tr><tr><td>FcR Reactivo de bloqueo, humano</td><td>Miltenyi Biotec GmbH</td><td>130-059-901</td><td></td></tr><tr><td>kit de etiquetado de proteínas de color verde brillante; Oregon Green 488 Protein Labeling Kit Thermo</td><td>Fisher Scientific</td><td>O10241</td><td></td></tr><tr><td>medio de montaje acuoso; Tubo</td> de centrifugación en gradiente de densidad Fluoroshield <td>Sigma-Aldrich GmbH</td><td>F6182</td><td></td></tr><tr><td>; Tubo de centrífuga Leukosep</td><td>Greiner Bio-One</td><td>89048-932</td><td></td></tr><tr><td>MACS soporte magnético; MACS MultiStand</td><td>Miltenyi Biotec GmbH</td><td>130-042-303</td><td></td></tr><tr><td>Filtro de preseparación MACS</td><td>Miltenyi Biotec GmbH</td><td>130-041-407</td><td>30 &micro; m</td></tr><tr><td>Columna de separación MACS (MS / LS)</td><td>Miltenyi Biotec GmbH</td><td>130-042-201 / 130-042-401</td><td></td></tr><tr><td>Imán permanente MACS; Separador MACS</td><td>Miltenyi Biotec GmbH</td><td>130-042-302</td><td></td></tr><tr><td>Millex-HV Filtro PVDF</td><td>Merck</td><td>SLHV013SL</td><td>0.45 &mu; m</td></tr><tr><td>ratón IgG 2b-PE</td><td>Miltenyi Biotec GmbH</td><td>130-092-215</td><td></td></tr><tr><td>colorante reactivo a aminas; Kit de tinción de células muertas reparables Hot-IR Live/Dead</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>L10119</td><td></td></tr><tr><td>medio de separación de linfocitos humanos; Pancoll</td><td>Pan Biotech GmbH</td><td>P04-60500</td><td>densidad: 1.077 g/mL</td></tr><tr><td>PBS</td><td>Pan Biotech GmbH</td><td>P04-53500</td><td>sin Ca y Mg</td></tr><tr><td>PEI</td><td>Sigma-Aldrich GmbH</td><td>408727</td><td>ramificado; 25 kDa</td></tr><tr><td>Penicilina/Estreptomicina</td><td>Thermo Fisher Scientific 15140122</td><td></td><td>100 U/mL, 100 &mu; g/mL</td></tr><tr><td>de PFA</td><td>Merck Schuchardt OHG</td><td>1040051000</td><td></td></tr><tr><td>precursor sin etiquetar miR; Control negativo de precursores de miARN pre-miR # 1</td><td>Ambion</td><td>AM17110</td><td></td></tr><tr><td>tampón de lisis RBC</td><td>eBioscience</td><td>00-4333-57</td><td></td></tr><tr><td>Solución de descontaminación de ARNasa; RNaseZap</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>AM9780</td><td></td></tr><tr><td>medio linfocitario humano; Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 medio</td><td>Pan Biotech GmbH</td><td>P04-16500</td><td></td></tr><tr><td>suplemento de citoquinas humanas recombinantes; StemSpan CC100</td><td>Stemcell Technologies</td><td>2690</td><td></td></tr><tr><td>medio de expansión de células hematopoyéticas sin suero; StemSpan H3000</td><td>Stemcell Technologies</td><td>9800</td><td></td></tr><tr><td>Estreptavidina MagneSphere Partículas paramagnéticas</td><td>Promega Corporation</td><td>Z5481</td><td></td></tr><tr><td>Solución de Trypan</td><td>Blue Sigma-Aldrich GmbH</td><td>T8154</td><td>0,4 %</td></tr><tr><td>UltraPure EDTA</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15575020</td><td>0,5 M; pH 8,0</td></tr><tr><td>software ZEN2011</td><td>Carl Zeiss Jena GmbH</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Espectrofotómetro NanoDrop 1000</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sonorex RK 100 SH baño de agua sonicante</td><td>Bandelin electrónico</td><td></td><td>Ultrasonidos potencia nominal: 80 W; Frecuencia ultrasónica: 35 kHz</td></tr></tbody></table>

protocolo para la transferencia de microarn en médula ósea hematopoyéticas células madre adultas para permitir ingeniería celular combinado con orientación magnética

Protocol for MicroRNA Transfer into Adult Bone Marrow-derived Hematopoietic Stem Cells to Enable Cell Engineering Combined with Magnetic Targeting

Mientras CD133+ las células madre hematopoyéticas (SCs) se han demostrado para proporcionar alto potencial en el campo de la medicina regenerativa, sus tasas de retención baja después de la inyección en los tejidos lesionados, así como las tasas de muerte celular masiva observada conducen a muy efectos terapéuticos restringidos. Para superar estas limitaciones, intentamos establecer un protocolo basado no-virales para la ingeniería celular adecuado antes de su administración. La modificación de CD133 humano+ expresando SCs utilizando microARN (miR) cargada magnética polyplexes fue tratado con respecto a la eficiencia de absorción y seguridad así como el potencial de segmentación de las células. Confiando en nuestro protocolo, podemos lograr tasas de absorción miR alta de 80 – 90% mientras el CD133+ propiedades de células madre siguen siendo inafectadas. Además, estas células modificadas ofrecen la opción de orientación magnética. Aquí describimos un procedimiento seguro y altamente eficiente para la modificación de CD133+ SCs. Esperamos que este enfoque para proporcionar una tecnología estándar para la optimización de los efectos terapéuticos de células madre y para el seguimiento del producto celular administrada a través de la proyección de imagen de resonancia magnética (MRI).

El protocolo presentado describe un aislamiento manual y enriquecimiento magnético de CD133 humano derivados de BM+ CS con una célula independiente del virus posterior ingeniería de estrategia, como una tecnología no invasiva para la manipulación de la célula en vitro y en vivo herramienta de monitorización.
Esta tecnología de aislamiento de tres pasos permite una separación de las empresas multinaci...

Este protocolo ilustra un procedimiento seguro y eficaz para modificar CD133+ las células madre hematopoyéticas. El presentado no virales, magnético polyplex enfoque puede proporcionar una base para la optimización de los efectos terapéuticos de células madre, así en cuanto a la supervisión del producto celular administrada a través de la proyección de imagen de resonancia magnética.

Protocolo para la transferencia de microARN en médula ósea hematopoyéticas células madre adultas para permitir ingeniería celular combinado con orientación magnética

While CD133+ hematopoietic stem cells (SCs) have been proven to provide high potential in the field of regenerative medicine, their low retention rates ...

Nuestro protocolo puede responder a preguntas clave en el campo de la medicina regenerativa, como si las células pueden mejorarse por sus propiedades beneficiosas, así como si pueden dirigirse al sitio de interés. Una de las principales ventajas de nuestro protocolo es el hecho de que las células pueden ser modificadas genéticamente de forma transitoria utilizando nuestro método de transfección no viral, conservando así las propiedades de las células. El método de Sauter puede proporcionar información sobre la modificación de las células madre hematopoyéticas que se puede aplicar a otros tipos de células utilizadas para el trasplante, como las células madre mesenquimales.Para comenzar el protocolo, precaliente el medio de linfocitos humanos a temperatura ambiente y descongele la colagenasa B y la DNasa. Recoja la médula ósea, o BM, en un tubo cónico de 50 mililitros. Deseche los coágulos existentes.Tome una muestra de BM de 200 microlitros para su posterior análisis por citometría de flujo. Almacene la muestra a cuatro grados centígrados hasta que la necesite. A continuación, transfiera diez mililitros de BM a un nuevo tubo cónico de 50 mililitros y agregue seis mililitros de PBS E

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Combinatorias 5 proteínas fluorescentes de marcado de las células madre y progenitoras hematopoyéticas permite in vivo seguimiento clonal a través confocal y microscopía de dos fotones, que proporciona conocimientos sobre la médula ósea hematopoyética arquitectura durante la regeneración. Este método permite la correlación de destino no invasiva de las células derivadas de HSPCs espectralmente-codificados en tejidos intactos durante largos períodos de tiempo después del trasplante.

En Tracking Clonal vivo de madre hematopoyéticas y células progenitoras Marcado por cinco proteínas fluorescentes utilizando confocal y Microscopía Multifotónica

La administración celular dirigida es útil en una variedad de aplicaciones biomédicas.  El objetivo de este protocolo es utilizar nanopartículas superparamagnéticas de óxido de hierro (SPION) para marcar células y, por lo tanto, permitir enfoques de orientación de células magnéticas para un alto grado de control sobre la entrega y localización de células.

Etiquetado Celular y Orientación con superparamagnético nanopartículas de óxido de hierro

Condrogénesis de células madre requiere un ajuste fino de las condiciones de cultivo. A continuación, presentamos un enfoque magnético para la condensación de las células, un paso esencial para iniciar la condrogénesis. Además, mostramos que la maduración dinámica en un biorreactor se aplica estimulación mecánica a las construcciones celulares y mejora la producción de la matriz extracelular cartilaginosa.

3D agregación magnética Stem Cell y biorreactor de maduración para la regeneración del cartílago

Este manuscrito describe la entrega eficiente, no viral de miR a las células endoteliales por un vector de PEI / MNP y su magnetización. Por lo tanto, además de la modificación genética, este enfoque permite la orientación magnética de las células y de detección de MRI. La técnica se puede utilizar para mejorar las características de los productos de células terapéuticas.

Preparación y<em&gt; In Vitro</em&gt; Caracterización de Magnetized miR-modificado células endoteliales

Este protocolo describe la ingeniería genética transitoria de células dentales extraídas del folículo dental humano. La estrategia de modificación no aplicada puede llegar a ser una base para la mejora de los productos terapéuticos de células madre.

Aislamiento, caracterización y MicroRNA basado en la modificación genética de las células madre del folículo Dental humano

Describimos el uso de trasplante de células madre hematopoyéticas (HSCT) para evaluar el potencial maligno de las células hematopoyéticas genéticamente. TCMH es útil para evaluar varias células hematopoyéticas malignas en vivo así como generar una cohorte grande de ratones con síndromes mielodisplásicos (MDS) o leucemia para evaluar nuevas terapias.

Uso de trasplante de células madre hematopoyéticas para evaluar el origen del síndrome mielodisplásico

El objetivo de este protocolo es aislar a primates no humanos CD34 de las células+ de cebada la médula ósea, estas células con vectores lentivirales de modificar genes y para preparar un producto para infusión en el huésped autólogo. La longitud del protocolo total es aproximadamente de 48 h.

Preparación y modificación genética de primates no humanos tallo hematopoyéticas y células progenitoras

Se describen protocolos para la edición del genoma altamente eficiente de células madre hematopoyéticas murinas (HSPC) por el sistema CRISPR/Cas9 para desarrollar rápidamente sistemas de modelos de ratón con modificaciones genéticas específicas del sistema hematopoyético.

Edición del genoma mediado por CRISPR/Cas9 para el estudio de células hematopoyéticas en modelos de enfermedades

El presente protocolo describe un procedimiento optimizado de cultivo de células madre y progenitoras hematopoyéticas (HSPC) para el injerto robusto de células editadas genéticamente in vivo.

Edición génica CRISPR/Cas9 de células madre y progenitoras hematopoyéticas para aplicaciones de terapia génica

Este protocolo describe el procedimiento para la edición del genoma en macrófagos derivados de la médula ósea de ratón utilizando complejos de ribonucleoproteínas Cas9-sgRNA ensamblados in vitro y administrados por electroporación.

Disrupción génica de alta eficiencia en macrófagos primarios derivados de la médula ósea mediante complejos Cas9-sgRNA electroporados

Este protocolo describe la inyección intrafemoral de unas pocas células madre hematopoyéticas o leucémicas, incluidas las células editadas genéticamente, en modelos de xenoinjertos murinos, lo que no solo permitirá el trasplante rápido y seguro de células, sino también análisis seriados de la médula ósea.

Las inyecciones intrafemorales simplificadas con ratones vivos permiten un análisis continuo de la médula ósea

Aprende a transferir microARN en células madre hematopoyéticas CD133+ mediante transfección no viral con nanopartículas magnéticas. Este método seguro permite la ingeniería celular transitoria con monitoreo por resonancia magnética.

Protocolo para la transferencia de microARN en médula ósea hematopoyéticas células madre adultas para permitir ingeniería celular combinado con orientación magnética (Video) | JoVE Journal

Protocolo para la transferencia de microARN en médula ósea hematopoyéticas células madre adultas para permitir ingeniería celular combinado con orientación magnética

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