Protocolo para la transferencia de microARN en médula ósea hematopoyéticas células madre adultas para permitir ingeniería celular combinado con orientación magnética
18 de junio de 2018
Este protocolo ilustra un procedimiento seguro y eficaz para modificar CD133+ las células madre hematopoyéticas. El presentado no virales, magnético polyplex enfoque puede proporcionar una base para la optimización de los efectos terapéuticos de células madre, así en cuanto a la supervisión del producto celular administrada a través de la proyección de imagen de resonancia magnética.
Nuestro protocolo puede responder a preguntas clave en el campo de la medicina regenerativa, como si las células pueden mejorarse por sus propiedades beneficiosas, así como si pueden dirigirse al sitio de interés. Una de las principales ventajas de nuestro protocolo es el hecho de que las células pueden ser modificadas genéticamente de forma transitoria utilizando nuestro método de transfección no viral, conservando así las propiedades de las células. El método de Sauter puede proporcionar información sobre la modificación de las células madre hematopoyéticas que se puede aplicar a otros tipos de células utilizadas para el trasplante, como las células madre mesenquimales.
Para comenzar el protocolo, precaliente el medio de linfocitos humanos a temperatura ambiente y descongele la colagenasa B y la DNasa. Recoja la médula ósea, o BM, en un tubo cónico de 50 mililitros. Deseche los coágulos existentes.
Tome una muestra de BM de 200 microlitros para su posterior análisis por citometría de flujo. Almacene la muestra a cuatro grados centígrados hasta que la necesite. A continuación, transfiera diez mililitros de BM a un nuevo tubo cónico de 50 mililitros y agregue seis mililitros de PBS EDTA, 20 mililitros de medio linfocitario humano, 175 microlitros de colagenasa B y 175 microlitros de DNasa.
Mezcle suavemente la solución e incube durante 30 minutos a temperatura ambiente en un agitador. Prepare un tubo de centrifugación en gradiente de densidad de 50 mililitros aplicando 15 mililitros de medio separador de linfocitos humanos en el tubo de 50 mililitros y centrifuérrelo a 1.000 veces G durante 30 segundos. Coloque con cuidado 35 mililitros de BM diluido sobre el filtro del tubo de centrifugación en gradiente de densidad y centrifugue el tubo a 445 veces G durante 35 minutos.
Retire suavemente el tubo de la centrífuga sin agitarlo. Deseche con cuidado un máximo de 20 mililitros de la solución transparente superior, sin tocar la capa turbia directamente sobre el filtro. Transfiera con cuidado la capa turbia que contiene las células mononucleares, o MNC, a un nuevo tubo cónico de 50 mililitros y llénelo con PBS EDTA hasta un volumen final de 50 mililitros.
Cuente las MNC transfiriendo 10 microlitros de la suspensión de celdas de 50 mililitros a un tubo de 1,5 mililitros. Añadir 10 microlitros de ácido acético al 3% con azul de metileno. Mezcle suavemente el contenido y aplique 10 microlitros en una cámara de conteo.
Calcule el número de MNC. Centrifugar la suspensión de MNC a 300 veces G durante 10 minutos. Deseche el sobrenadante.
Para preparar una selección magnética para uno por 10 hasta el octavo número total de celdas, vuelva a suspender cuidadosamente las MNC en 300 microlitros de tampón MACS. Añadir 100 microlitros de reactivo bloqueante FCR y 100 microlitros de partículas superparamagnéticas de hierro dextrano unidas a anticuerpos CD133. A continuación, mezcle suavemente la suspensión celular e incube durante 30 minutos a cuatro grados centígrados.
Agite suavemente la suspensión celular durante la incubación dos o tres veces. Después de la incubación, agregue dos mililitros de tampón MACS por una vez 10 celdas. Mezcle suavemente la suspensión celular y centrifugue la mezcla a 300 veces G durante 10 minutos a cuatro grados centígrados.
Coloque el soporte magnético MACS y coloque el imán permanente MACS. Instale la columna MACS y aplique el filtro de preseparación en la parte superior. Equilibre la primera columna MACS y el filtro de separación previa con el búfer MACS.
Deseche el sobrenadante y vuelva a suspender el pellet en 500 microlitros de tampón MACS. Aplique la suspensión de celdas al filtro de preseparación. Lave la columna MACS y el filtro de preseparación tres veces y deseche el filtro de preseparación.
Eluya la fracción de celda directamente en la segunda columna MACS. Transfiera inmediatamente la primera columna MACS por encima de la segunda columna MACS y empuje la suspensión de la celda a través de la columna MACS utilizando el émbolo suministrado. Lave la columna MACS 3 veces con el tampón MACS.
Eluya la fracción de celda de la columna agregando el búfer MACS en la segunda columna MACS y quitando la columna MACS del imán permanente MACS. Transfiera inmediatamente la segunda columna MACS por encima de un tubo y empuje la suspensión de la solución celular a través de la columna MACS. Centrifuga el tubo.
Deseche con cuidado el sobrenadante y vuelva a suspender el pellet en 100 microlitros de tampón MACS. Tome una muestra de una por 10 a la cuarta celda para su posterior análisis por citometría de flujo. Vuelva a suspender las células restantes en el medio de cultivo y siembre cinco veces 10 hasta la cuarta celda en una placa de 24 pocillos para la transfección.
Incubar las células a 37 grados centígrados, 5% de CO2 y 20% de O2. Utilice dos muestras de 10 microlitros de alícuotas de BM y una muestra de SC CD133 positivos recién aislados para el análisis. Transfiera las células a un tubo de 1,5 mililitros.
Añadir 10 microlitros de reactivo de bloqueo FcR y llenar el tubo con tampón MACS hasta un volumen de 33 microlitros. Agregue los anticuerpos en el lado interno del tubo. Después de que se hayan agregado todos los anticuerpos, agite el lado de anticuerpos del tubo.
Mezclar suavemente la solución, que tiene un volumen final de 50 microlitros, e incubarla durante 10 minutos a cuatro grados centígrados. Agregue un mililitro de un glóbulo rojo X o tampón de lisis de glóbulos rojos. Mezcle suavemente la suspensión e incube la solución en hielo durante 10 minutos.
A continuación, centrifuga la suspensión. Desechar el sobrenadante y volver a suspender el pellet obtenido en 100 microlitros de PBS. Evalúe la pureza y viabilidad de las células mediante mediciones de citometría de flujo.
Use 20 picomoles de MIR por pocillo de una placa de 24 pocillos. Diluir MIR en la solución de glucosa al 5% hasta una concentración final de 0,25% picomoles MIR por microlitro. Diluir el PEI en una cantidad igual de solución de glucosa al 5%.
A continuación, agregue el PEI prediluido en el MIR prediluido y el vórtice durante 30 segundos. Mientras incuba los complejos MIR PEI durante 30 minutos a temperatura ambiente, sonicase las nanopartículas magnéticas, o MNP, durante 20 minutos a 35 kilohercios en un baño de agua sonicante a temperatura ambiente. Asegúrese de que las partículas estén en suspensión y no se agreguen.
Añada las MNP sonicadas en los complejos MIR PEI y agite la solución durante 30 segundos. Incubar los complejos MIR PEI MNP durante 30 minutos a temperatura ambiente. Añada el complejo MIRNA PEI MNP gota a gota directamente en el pocillo apropiado que contenga los SC positivos CD133 recién aislados en medio de cultivo.
Mezcle suavemente balanceando el plato hacia adelante y hacia atrás. Incuba las células. 18 horas después de la transfección, recoja el contenido de cada pocillo en un tubo separado de 1,5 mililitros.
Lave cada pocillo una vez con 500 microlitros de PBS y transfiera esta suspensión celular al mismo tubo. A continuación, centrifugar las células a 300 veces G durante 10 minutos a cuatro grados centígrados. Después del centrifugado, deseche el sobrenadante y vuelva a suspender el pellet en 100 microlitros de tampón MACS.
Añade 0,5 microlitros de un colorante reactivo a la amina para distinguir entre células vivas y muertas. Mezcle suavemente la suspensión e incube las células durante 10 minutos a cuatro grados centígrados. Añadir un mililitro de PBS y centrifugar las células de nuevo a 300 veces G durante 10 minutos a cuatro grados centígrados.
Deseche el sobrenadante, vuelva a suspender el pellet obtenido en 100 microlitros de PBS, agregue 33 microlitros de PFA al 4% y mezcle vigorosamente. Evalúe la eficiencia de la absorción de MIR y la citotoxicidad mediada por la transfección mediante mediciones de citometría de flujo. Siguiendo el método descrito en el protocolo, la citometría de flujo determinó que la fracción celular positiva para CD133 enriquecida magnéticamente produjo una viabilidad y pureza superiores al 80%El método de transfección descrito aquí permite una introducción altamente efectiva de MIR en estas SC positivas para CD133 humanos recién aisladas.
Con una eficiencia de absorción de aproximadamente el 80% de las células viables. Además, no hay efectos citotóxicos significativos evidentes 18 horas después de la transfección en comparación con las células control. Además, se puede observar una entrega suficiente y una distribución habitual de los compuestos del complejo de transfección dentro del citoplasma de las células mediante microscopía de iluminación estructurada o SIM.
Siguiendo este procedimiento, se pueden realizar otros métodos como la aplicación in vivo de células madre modificadas. Esto permitirá investigar la supervivencia real y los efectos en condiciones dinámicas. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo aplicar la transfección basada en polímeros y nanopartículas magnéticas para introducir de manera eficiente el microARN en las células madre hematopoyéticas frescas.
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Descripción general
Este protocolo describe un procedimiento seguro y eficiente para modificar células madre hematopoyéticas CD133+. El enfoque no viral basado en polipléjicos magnéticos permite optimizar los efectos terapéuticos de las células madre y su monitorización mediante imágenes por resonancia magnética.
Componentes Clave del Estudio
Área de la ciencia
- Medicina Regenerativa
- Modificación de Células Madre
- Técnicas de Transfección Celular
Antecedentes
- Las células madre hematopoyéticas pueden ser modificadas genéticamente.
- La modificación genética transitoria conserva las propiedades de las células.
- El método puede aplicarse a otros tipos celulares para trasplante.
- La imagen por resonancia magnética puede utilizarse para monitorear los productos celulares.
Objetivo del estudio
- Mejorar las propiedades beneficiosas de las células madre.
- Dirigir las células hacia sitios específicos de interés.
- Proporcionar información sobre las técnicas de modificación de células madre.
Métodos Utilizados
- Método de transfección no viral para ingeniería genética.
- Uso de colagenasa B y DNasa para la preparación de células.
- Recolección de médula ósea en tubos cónicos.
- Eliminación de coágulos para asegurar la viabilidad celular.
Resultados principales
- Modificación exitosa de células madre hematopoyéticas CD133+.
- Mantenimiento de las propiedades celulares tras la modificación.
- Aplicación potencial a células madre mesenquimales.
- Factibilidad de monitoreo mediante imágenes por resonancia magnética.
Conclusiones
- El protocolo ofrece un método seguro para la modificación de células madre.
- Mejora el potencial terapéutico de las células madre.
- Proporciona un marco para futuras aplicaciones en medicina regenerativa.
Preguntas frecuentes
Relevancia Ejecutiva para la Industria
Este protocolo permite el direccionamiento magnético no viral de células madre hematopoyéticas para mejorar la retención y la eficacia terapéutica en medicina regenerativa. Al lograr una alta incorporación de microARN sin comprometer las propiedades de las células madre, apoya la desaceleración predictiva en el desarrollo de terapias celulares. El enfoque proporciona una plataforma escalable y monitorizable mediante resonancia magnética para optimizar productos basados en células madre antes de su traslación clínica.
Aplicaciones Estratégicas en I+D de Biotecnología Farmacéutica
Descubrimiento Temprano y Validación de Blancos
- Valor científico: Permite la validación funcional de las propiedades de las células madre hematopoyéticas tras la ingeniería mediada por microARN.
- Valor operativo: Facilita la modificación genética transitoria que preserva la identidad y viabilidad de las células madre para ensayos posteriores.
Desarrollo de Pruebas y Cribado
- Valor científico: Genera poblaciones de células madre cuantitativamente evaluable con una eficiencia de incorporación superior al 80 % para la selección de la entrega de microARN.
- Valor operativo: Produce células etiquetables magnéticamente compatibles con flujos de trabajo de seguimiento y clasificación basados en imágenes.
Investigación Traductacional y Preclínica
- Valor científico: Facilita la evaluación de la supervivencia y el injerto de células madre modificadas en modelos relevantes para la enfermedad mediante el direccionamiento magnético.
- Valor operativo: Permite el monitoreo no invasivo de los productos celulares administrados mediante resonancia magnética, apoyando estudios longitudinales de biodistribución.
Integración de la Línea de Producción y Flujo de Trabajo
El método se integra en la continuación del descubrimiento, desde el aislamiento de células madre hasta la ingeniería genética y la validación preclínica, apoyando las decisiones de continuar o no continuar en el desarrollo de terapias celulares.
- Biología del Descubrimiento: Permite la verificación de hipótesis sobre la función de microARN en células madre, manteniendo la integridad fenotípica para la desactivación de riesgos mecanicistas.
- Cribado: Ofrece poblaciones estandarizadas de células madre listas para transfección, con alta reproducibilidad, para la evaluación de bibliotecas de compuestos o ácidos nucleicos.
- Análisis: Proporciona lecturas basadas en citometría de flujo e imágenes para cuantificar la eficiencia de transfección, viabilidad y distribución subcelular.
- Investigación Traducional: Facilita la continuidad desde la modificación ex vivo hasta el seguimiento in vivo mediante imágenes por resonancia magnética, aumentando la confianza predictiva.
- Reutilización Empresarial: Establece una plataforma modular de transfección adaptable a otros tipos de células madre, como las células madre mesenquimales, para aplicaciones amplias en diversos programas.
Impacto Operativo y Empresarial
- Valor científico: Mejora la confianza en la validación del objetivo al vincular la modulación de microARN con la función de células madre sin riesgos de integración genómica.
- Valor operativo: Asegura la reproducibilidad mediante pasos estandarizados de separación magnética y transfección, reduciendo la variabilidad en la preparación del producto celular.
- Valor estratégico: Aumenta la eficiencia del capital al mejorar la retención de células madre y reducir las dosis necesarias para lograr un efecto terapéutico.
- Impacto en la cartera: Permite la priorización ajustada al riesgo de candidatos de células madre basada en funcionalidad ingenierizada y capacidad de rastreo.
Consideraciones de Implementación
- Requiere experiencia en el aislamiento de células madre, clasificación celular activada por magnetismo y técnicas de transfección de ácidos nucleicos.
- Depende del acceso a columnas MACS, centrífugas, citómetros de flujo y microscopía de iluminación estructurada para la validación.
- Necesita la estandarización de la preparación de nanopartículas magnéticas y poliplexes entre lotes para lograr una eficiencia de absorción constante.
- Requiere la optimización de la dosis de microARN y del tiempo de incubación para equilibrar la eficacia de la transfección con la viabilidad de las células madre.
- Se limita a la modificación ex vivo; la eficacia del direccionamiento magnético in vivo depende de la intensidad del imán externo y de la accesibilidad del tejido.
Preguntas frecuentes sobre biofármacos
Chapters in this video
0:04
Title
0:53
CD133 SC Isolation
6:00
Characterization of Freshly Isolated CD133 SCs
7:21
Preparation of Transfection Complexes
8:26
CD133 SCs Transfection and Analysis
10:03
Results: Successful Engineering of miR-loaded Magnetized CD133 Cells
11:02
Conclusion
