Generación de esferoides tumorales tridimensional de alto rendimiento para la detección de drogas
5 de septiembre de 2018
En una amplia variedad de indicaciones de enfermedad, modelos más fisiológico relevantes están siendo programas de descubrimiento de drogas desarrollado e implementado en. El nuevo sistema del modelo aquí descrito muestra tumor cómo tridimensional de esferoides pueden ser cultivados y defendidos en un sistema de base de placa de alto rendimiento 1536-bien buscar nuevos medicamentos de Oncología.
Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo del descubrimiento de fármacos, como por ejemplo, cuál es el entorno de cultivo de tejidos más relevante para la identificación de hit-to-lead. La principal ventaja de esta técnica es que permite el cultivo de células en tres dimensiones, de una manera de alto rendimiento, utilizando 1536 placas de pocillos. La demostración de este protocolo estará a cargo de Kalyani Gampa, un científico senior de mi laboratorio.
Para configurar un cultivo de esferoides tumorales en 3D, separe las líneas celulares cancerosas de interés con tres lavados de BBS. Seguido de la adición de un mililitro de tripsina por cada cinco centímetros cuadrados de área del matraz de cultivo. Después de cinco minutos, neutralice la tripsina con cinco veces el volumen de medio suplementado con suero en cada matraz y cuente las células.
Utilice un pequeño casete esterilizado con punta de acero inoxidable con un sistema basado en una bomba peristáltica para sembrar un total de 500 células en ocho microlitros de medio esferoide en cada pocillo de una placa tratada con cultivo de tejido de 1.536 pocillos. A continuación, utilice un sello de placa adhesiva transpirable para cubrir la placa. Y coloque la placa en una incubadora giratoria configurada a 37 grados centígrados y 10 rpm con 5% de dióxido de carbono y 95% de humedad relativa durante tres días.
El paso más crítico es asegurarse de que las placas estén bien selladas antes de colocarlas en la incubadora. Los esferoides necesitarán tres días para formarse y este paso evita la evaporación del medio. Al final de la incubación, gire rápidamente las placas de cultivo revestidas de cáncer a 100 veces la gravedad para recoger la condensación y retire los sellos adhesivos.
Coloque cada placa a tratar en un dispensador acústico configurado para suministrar un total de ocho nanolitros de cada compuesto. Dilución hasta una concentración final de 0,1% DMSO por pocillo y una dosis máxima de compuesto de 10 micromolares. Cuando el compuesto se haya agregado a las placas apropiadas, coloque una tapa de cultivo celular de acero inoxidable hecha a medida en cada placa para evitar la evaporación y devuelva las placas a la incubadora giratoria durante otros cinco días.
Al final de la incubación, agregue tres microlitros de reactivo de lisis celular precalentado, suplementado con luciferina a cada pocillo de cada placa de cultivo celular. E incubar las placas a temperatura ambiente durante al menos 15 minutos. A continuación, capture la luminiscencia del ATP en un luminómetro de placa.
Cuando se hayan analizado todas las placas, extraiga los datos brutos del instrumento y normalice todos los campos que contienen los compuestos de prueba al promedio de todos los pocillos que contienen DMSO solo como control neutro. A continuación, se puede calcular el porcentaje de inhibición del crecimiento de cada compuesto de acuerdo con la fórmula, y se pueden generar curvas de dosis-respuesta e IC50 inhibidores. Una variedad de células cancerosas establecidas que se sabe que crecen bien en condiciones de cultivo 2D también formaron estructuras 3D cuando se cultivaron, como se acaba de demostrar, a pesar de sus diferencias morfológicas.
Cuando se utiliza para el cribado a gran escala, se puede observar una sensibilidad diferencial de los compuestos entre los cultivos cultivados en 2D frente a los cultivados en 3D. Cada punto representa la concentración inhibitoria de un solo compuesto para el que se observa una respuesta de destrucción celular del 50% en ambos entornos de cultivo. En este experimento representativo, los dos compuestos inhibidores de la quinasa RAF probados fueron más potentes en condiciones 3D en un cultivo de línea de cáncer de pulmón de células no pequeñas que albergaba una mutación activadora en la proteína KRAS.
Sin embargo, los compuestos demuestran una potencia similar en los cultivos de cáncer de colon esferoide 3D y 2D que contienen una mutación activadora G13D en KRAS. El ensayo 3D también permite observar el fenómeno paradójico de activación del crecimiento, que ocurre cuando hay una inhibición incompleta de los dímeros RAF en líneas mutantes de RAFs altamente activadas, como lo demuestra el crecimiento celular a bajas concentraciones del fármaco, que se reprime a altas concentraciones. Después de su desarrollo, esta técnica allanó el camino para que los investigadores en el campo del descubrimiento de fármacos contra el cáncer exploraran condiciones de cultivo alternativas para identificar materia química nueva y eficaz contra objetivos conocidos.
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Descripción general
Este artículo presenta un método novedoso para el descubrimiento de fármacos utilizando esferoides tumorales tridimensionales cultivados en un sistema de placas de 1536 pocillos de alto rendimiento. Este enfoque pretende mejorar la relevancia de los entornos de cultivo de tejidos en la identificación de posibles fármacos en oncología.
Componentes Clave del Estudio
Área de la Ciencia
- Oncología
- Descubrimiento de fármacos
- Técnicas de cultivo celular
Antecedentes
- Los cultivos celulares tradicionales en dos dimensiones suelen no imitar el microambiente tumoral.
- Los cultivos en tres dimensiones proporcionan un modelo más fisiológicamente relevante para estudiar el cáncer.
- El cribado de alto rendimiento es esencial para un descubrimiento eficiente de fármacos.
- Este estudio se centra en optimizar el cultivo de esferoides tumorales.
Objetivo del estudio
- Desarrollar un método de alto rendimiento para el cultivo de esferoides tumorales.
- Evaluar la relevancia de este modelo en el descubrimiento de fármacos.
- Facilitar la identificación de nuevos fármacos en oncología.
Métodos Utilizados
- Separación de líneas celulares cancerosas mediante lavados con BBS.
- Uso de tripsina para la disociación celular y neutralización con medio suplementado con suero.
- Cultivo de células en formato de placa de 1536 pozos.
- Tamizaje de posibles candidatos a fármacos de manera de alto rendimiento.
Resultados principales
- El método permite el cultivo eficiente de esferoides tumorales tridimensionales.
- Las capacidades de alto rendimiento permiten la cribado rápido de candidatos a fármacos.
- Relevancia demostrada del modelo de cultivo tridimensional en el descubrimiento de fármacos.
- Potencial para mejorar el proceso de identificación de compuestos activos promisorios.
Conclusiones
- Este método de cultivo de esferoides tumorales tridimensionales mejora los esfuerzos de descubrimiento de fármacos.
- Proporciona una representación más precisa de la biología tumoral.
- El enfoque puede conducir al descubrimiento de nuevas terapias en oncología.
Preguntas frecuentes
Relevancia Ejecutiva para la Industria
Este método aborda la brecha traslacional en el descubrimiento de fármacos oncológicos al permitir la selección de alto rendimiento en un modelo de esferoides tumorales tridimensionales fisiológicamente relevante. Apoya la confianza predictiva en la validación de dianas al revelar respuestas diferenciales a fármacos entre condiciones de cultivo en 2D y 3D. El enfoque mejora la identificación de compuestos activos promisorios para inhibidores de la vía MAPK en modelos de cáncer con definición genética.
Aplicaciones Estratégicas en I+D de Biotecnología Farmacéutica
Descubrimiento Temprano y Validación de Blancos
- Valor científico: Permite la evaluación de hipótesis terapéuticas en un sistema relevante para la enfermedad que captura interacciones celulares tridimensionales y organización espacial.
- Valor operativo: Apoya la reducción de riesgos mecanicistas mediante la comparación de la eficacia de compuestos en cultivos bidimensionales frente a tridimensionales para identificar actividades dependientes del contexto.
- Valor predictivo: Facilita la identificación de compuestos líderes al detectar sensibilidades diferenciales en modelos de cáncer de pulmón de células no pequeñas con mutación en KRAS bajo condiciones tridimensionales.
Desarrollo de Pruebas y Tamizaje
- Valor científico: Proporciona un sistema estandarizado y reproducible de cultivo 3D compatible con formatos de 1536 pocillos para cribado a gran escala de compuestos.
- Valor operativo: Permite lecturas cuantitativas de luminiscencia basadas en ATP para medir la inhibición del crecimiento y generar curvas de respuesta dosis-respuesta y valores de IC50.
- Preparación del ensayo: Utiliza dispensación acústica para una entrega precisa de compuestos en nanolitros y una incubación sellada para prevenir la evaporación, asegurando la integridad del ensayo.
Investigación Traductacional y Preclínica
- Continuidad Translacional: Conecta los flujos de trabajo de descubrimiento y preclínicos al modelar interacciones entre tumor y estroma y condiciones similares a la matriz extracelular en un formato escalable.
- Avance Ajustado al Riesgo: Permite observar la activación paradójica del crecimiento en mutantes del dímero RAF, orientando estrategias de terapia combinada y reduciendo riesgos en candidatos clínicos.
- Alineación de Biomarcadores: Facilita la evaluación de inhibidores específicos de vías (por ejemplo, MAPK) en contextos genéticamente definidos para correlacionar genotipo con respuesta al fármaco.
Integración de la tubería y flujo de trabajo
El método se integra en la continuidad del descubrimiento, desde la validación del blanco hasta la identificación de compuestos activos, permitiendo una evaluación temprana de la eficacia del compuesto en un contexto fisiológicamente más relevante antes de la inversión preclínica.
- Biología del Descubrimiento: Apoya la comprobación de hipótesis al revelar cómo el cultivo 3D altera la sensibilidad a fármacos en modelos impulsados por oncogenes, como el carcinoma pulmonar no microcítico con mutación en KRAS.
- Cribado: Proporciona disponibilidad del ensayo y reproducibilidad mediante la formación estandarizada de esferoides en placas de 1536 pocillos, con protocolos controlados de incubación y sellado.
- Análisis: Permite la medición cuantitativa de variables dependientes mediante la normalización de la luminiscencia de ATP respecto a los controles con DMSO, facilitando el cálculo del IC50 y el análisis comparativo de potencia.
- Investigación Traducional: Se conecta con la continuidad preclínica al modelar la arquitectura espacial del tumor y las interacciones clonales ausentes en sistemas bidimensionales.
- Reutilización Empresarial: Establece una plataforma reutilizable para el cribado de diversas líneas celulares de cáncer y bibliotecas de compuestos dirigidos a vías conservadas como MAPK.
Impacto Operativo y Empresarial
- Valor científico: Aumenta la confianza predictiva al reducir la ambigüedad mecanicista mediante la comparación directa de las respuestas a fármacos en 2D y 3D.
- Valor operativo: Proporciona estandarización, reproducibilidad y escalabilidad mediante protocolos en placas de 1536 pocillos compatibles con robótica y un incubado sellado.
- Valor estratégico: Mejora las decisiones de avance o interrupción al identificar compuestos con actividad específica al contexto, reduciendo el riesgo biológico en fases tardías.
- Impacto en la cartera: Permite la priorización de candidatos ajustada al riesgo, basada en la eficacia diferencial en modelos fisiológicamente relevantes.
Consideraciones de Implementación
- Requiere experiencia en técnicas de cultivo celular tridimensional, incluyendo la neutralización de tripsina, el recuento celular y el enplacado estéril.
- Depende de instrumentación como sistemas de cassetes basados en bombas peristálticas, dispensadores acústicos, incubadoras rotativas y luminómetros de placas.
- Necesita la estandarización entre equipos de los protocolos de sellado, los parámetros de incubación (37°C, 10 rpm, 5 % de CO2, 95 % de humedad) y los procedimientos de normalización de datos.
- Implica consideraciones de adaptación para diferentes líneas celulares de cáncer, ya que la eficiencia de formación de esferoides puede variar a pesar de lograrse con éxito en líneas establecidas.
- Incluye limitaciones prácticas, como la necesidad de prevenir la evaporación durante incubaciones prolongadas y la optimización de la dosificación de compuestos en volúmenes de nanolitros.
