Name: Generación de esferoides tumorales tridimensional de alto rendimiento para la detección de drogas (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-09-05T15:30:00.000+00:00
Duration: 5 min 54 s
Description: Aprende a generar esferoides tumorales tridimensionales en placas de 1536 pocillos para descubrimiento de fármacos oncológicos. Este método de alta capacidad mejora la identificación de candidatos terapéuticos.

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Los autores desean reconocer Marc Ferrer en el centro nacional para el avance de Ciencias traslacionales, institutos nacionales de salud por su apoyo y orientación sobre el desarrollo inicial de estos ensayos. Además, nos gustaría agradecer a Alyson Freeman, Mariela Jaskelioff, Michael Acker, Jacob Haling y Vesselina Cooke por sus contribuciones científicas y discusión como miembros del equipo del proyecto.

1. cultivo de esferoides de Tumor bien 1536 3D
<ol><li>Preparar un tallo mediano fresco 3D tumor esferoide (medio celular + recambio de nocaut suero insulina-transferrina-selenio) mediante la adición de los reactivos siguientes a 500 mL de medio de águilas modificado de Dulbecco (DMEM/F12): 1 x penicilina/estreptomicina, 10 ng/mL de humanos factor de crecimiento básico del fibroblasto (bFGF), 20 ng/mL de humano factor de crecimiento epidérmico (EGF), 0.4% albúmina de suero bovino (BSA) (fracción V), 1 x insulina-transferrina-selenio y el reemplazo de suero 1% nocaut (KO) (no hielo-deshielo).</li>
	<li>Filtro-esterilizar el medio entero con los suplementos a través de un sistema de filtro superior de la botella 0.4 μm.</li>
	<li>Separar las líneas celulares de cáncer, que han ido creciendo según condiciones de cultivo de rutina recomendados, de los frascos tradicionales de cultivo de células lavándolas x 3 con fosfato 1 x tampón salino (PBS) y agregar una cantidad apropiada de tripsina 0.25% (1 mL por 5 cm2) durante 5 minutos crear una fina capa sobre las células. Neutralizar la tripsina con 5 veces la cantidad de medio que contiene el suero y proceder a contar las células. Por ejemplo, utilizar 25 mL de medio de 5 mL de tripsina.</li>
	<li>Ajustar la concentración de la solución de células a 62,5 x 104 células/mL para un total de 500 células por pocillo en 8 μl del medio del esferoide de la semilla en las placas de tejido-cultura-Tratado de 1536-bien.</li>
	<li>En un gabinete de seguridad biológica, las células usando un cassette de punta de acero inoxidable esterilizado, pequeño con un sistema basado en la bomba peristáltica de la semilla. Entre diferentes líneas celulares, limpie el tubo del casete con 1 x PBS y el 70% de etanol durante 10 s.</li>
	<li>Por otra parte, la semilla las células usando un controlador líquido situado dentro de un cuarto de HEPA-filtrado utilizando una cinta esterilizada, la pequeña punta de acero inoxidable y una bomba peristáltica o una bomba de jeringa adjunta, dependiendo del número de placas por línea celular es necesitada.</li>
	<li>Sellar las placas usando un sello de placa adhesiva transpirable ya sea manualmente o usando un sellador de placas.</li>
	<li>Coloque las placas en una incubadora de spinning de 10 rpm y 37 ° C con 5% dióxido de carbono (CO2) y 95% de humedad relativa. Permita que los esferoides a forma d 3.</li>
</ol>2. cultivo de 1536-bien 2D del cáncer
Nota: Las líneas de cáncer 2D 1536-bien se deben cultivar 24 h antes de la adición del compuesto a las placas 3D.
<ol><li>Preparar un medio de células de cáncer 2D mediante la adición de los reactivos siguientes a 500 mL de un medio de crecimiento apropiado para las líneas seleccionadas: 1 x penicilina/estreptomicina y 10% suero fetal bovino (FBS).</li>
	<li>Filtro-esterilizar el medio entero con los suplementos a través de un sistema de filtro superior de la botella 0.4 μm.</li>
	<li>Separar las líneas celulares de cáncer, que han ido creciendo según condiciones de cultivo de rutina recomendados, de los frascos tradicionales de cultivo de células lavándolas 3 x 1 x PBS y agregar una cantidad apropiada de tripsina 0.25% (1 mL por 5 cm2) por 5 min a crear una capa fina sobre las células. Neutralizar la tripsina con 5 veces la cantidad de medio que contiene el suero y proceder a contar las células. Por ejemplo, utilizar 25 mL de medio de 5 mL de tripsina.</li>
	<li>Ajustar la concentración de la solución de células a 62,5 x 104 células/mL para un total de 500 células por pocillo en 8 μl de medio completo de semillas en placas tratados con tejido y cultura 1536-bien.</li>
	<li>En un gabinete de seguridad biológica, las células usando un cassette de punta de acero inoxidable esterilizado, pequeño con un sistema basado en la bomba peristáltica de la semilla. Entre las diferentes líneas celulares, limpie el tubo del casete con 1 x PBS estéril y el 70% de etanol durante 10 s.</li>
	<li>Por otra parte, la semilla las células usando un controlador líquido situado dentro de una sala de robótica HEPA-filtrado usando un cassette de punta de acero inoxidable esterilizado, pequeño y una bomba peristáltica o la bomba de jeringa adjunta, según el volumen de las placas por celda línea necesitada.</li>
	<li>Sellar las placas usando un sello de placa adhesiva transpirable ya sea manualmente o usando un sellador de placas.</li>
	<li>Coloque las placas en una incubadora de spinning de 10 rpm y 37 ° C durante 24 h antes de la adición compuesta, con 5% CO2 y 95% de humedad relativa.</li>
</ol>3. adición de compuestos
<ol><li>Preparar diluciones de 8 puntos, 3-fold serie de inhibidores de la MAPK en 100% de dimetilsulfóxido (DMSO) en un robot de manipulación de líquidos con una concentración superior de 10 mM. El inhibidor de proteasoma Bortezomib se utiliza como control positivo de una celda completa matando para determinar el rango dinámico del ensayo.</li>
	<li>Centrifugado rápido todo ensayo placas y placas compuestas a 100 x g para recoger la condensación. Retire el sello adhesivo de cada placa y coloque una placa en una configuración acústica dispensador para agregar un total de 8 nL de cada compuesto/dilución representando a una concentración final de 0.1% DMSO por pozo y una dosis superior compuesta de 10 μm.</li>
	<li>Una vez finalizada la adición del compuesto, coloque una tapa de cultura de célula a medida, acero inoxidable que previene la evaporación de la placa y coloca la placa en una incubadora de spinning a 37 ° C durante 5 d, con 5% CO2 y 95% de humedad relativa.</li>
</ol>4. adición de reactivo detección y adquisición de datos
<ol><li>Precaliente un volumen adecuado de un reactivo de lisis de la célula que contiene luciferin para detectar cambios en trifosfato de adenina (ATP) y, por lo tanto, en la proliferación celular a temperatura ambiente o en baño de agua de 37 ° C. Añadir un total de 3 μl del reactivo de detección a cada pocillo utilizando una bomba peristáltica e incubar la placa a temperatura ambiente durante al menos 15 minutos.</li>
	<li>Captura de la luminiscencia en un luminómetro de placa.</li>
</ol>5. procesamiento de datos
<ol><li>Extraer los datos en bruto del instrumento y normalizar todos los campos que contienen compuestos de prueba para la media de todos los pozos que contiene DMSO solamente como el control neutral. Calcular a partir de este valor, la inhibición del crecimiento porcentual de cada uno de ellos. Esto se ha completado utilizando la función fórmula en Microsoft Excel donde f (x) = {(muestra unidades de luz relativas de valor (RLUs) / (promedio de valor de DMSO RLUs) * 100)}.</li>
	<li>Generar las curvas de dosis-respuesta y IC50s inhibitorio graficando los valores de los datos normalizados de medida 5.1 contra la concentración de compuesto utilizando un programa de graficación. Nota: Se analizaron los datos utilizando Helios, una herramienta de software interna de NIBR. Para completar esta función, seleccionamos la herramienta de análisis no paramétrico de la curva.</li>
</ol>

<ol><li>Lee, M., Vasioukhin, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+polarity+and+cancer--cell+and+tissue+polarity+as+a+non-canonical+tumor+suppressor%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Science%22%5BJournal%5D)">Cell polarity and cancer--cell and tissue polarity as a non-canonical tumor suppressor.</a> Journal of Cell Science. 121 (Pt 8), 1141-1150 (2008).</li>
<li>Nath, S., Devi, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+culture+systems+in+cancer+research%3A+Focus+on+tumor+spheroid+model%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmacology+%26+Therapeutics%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional culture systems in cancer research: Focus on tumor spheroid model.</a> Pharmacology & Therapeutics. 163, 94-108 (2016).</li>
<li>Weigelt, B., Ghajar, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+need+for+complex+3D+culture+models+to+unravel+novel+pathways+and+identify+accurate+biomarkers+in+breast+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+Drug+Delivery+Reviews%22%5BJournal%5D)">The need for complex 3D culture models to unravel novel pathways and identify accurate biomarkers in breast cancer.</a> Advanced Drug Delivery Reviews. 69, 42-51 (2014).</li>
<li>Li, Q., Chow, A. B., Mattingly, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+overlay+culture+models+of+human+breast+cancer+reveal+a+critical+sensitivity+to+mitogen-activated+protein+kinase+kinase+inhibitors%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Pharmacology+and+Experimental+Therapeutics%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional overlay culture models of human breast cancer reveal a critical sensitivity to mitogen-activated protein kinase kinase inhibitors.</a> The Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 332 (3), 821-828 (2010).</li>
<li>Li, L., Lu, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimizing+a+3D+Culture+System+to+Study+the+Interaction+between+Epithelial+Breast+Cancer+and+Its+Surrounding+Fibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cancer%22%5BJournal%5D)">Optimizing a 3D Culture System to Study the Interaction between Epithelial Breast Cancer and Its Surrounding Fibroblasts.</a> Journal of Cancer. 2, 458-466 (2011).</li>
<li>Pickl, M., Ries, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+3D+and+2D+tumor+models+reveals+enhanced+HER2+activation+in+3D+associated+with+an+increased+response+to+trastuzumab%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">Comparison of 3D and 2D tumor models reveals enhanced HER2 activation in 3D associated with an increased response to trastuzumab.</a> Oncogene. 28 (3), 461-468 (2009).</li>
<li>Nyga, A., Cheema, U., Loizidou, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((3D+tumour+models%3A+novel+in+vitro+approaches+to+cancer+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Communication+and+Signaling%22%5BJournal%5D)">3D tumour models: novel in vitro approaches to cancer studies.</a> Journal of Cell Communication and Signaling. 5 (3), 239-248 (2011).</li>
<li>Kimlin, L. C., Casagrande, G., Virador, V. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+three-dimensional+%283D%29+models+in+cancer+research%3A+an+update%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Carcinogenesis%22%5BJournal%5D)">In vitro three-dimensional (3D) models in cancer research: an update.</a> Molecular Carcinogenesis. 52 (3), 167-182 (2013).</li>
<li>Mathews Griner, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Large-scale+pharmacological+profiling+of+3D+tumor+models+of+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+%26+Disease%22%5BJournal%5D)">Large-scale pharmacological profiling of 3D tumor models of cancer cells.</a> Cell Death & Disease. 7 (12), e2492(2016).</li>
<li>Polo, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Responsiveness+to+PI3K+and+MEK+inhibitors+in+breast+cancer.+Use+of+a+3D+culture+system+to+study+pathways+related+to+hormone+independence+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Responsiveness to PI3K and MEK inhibitors in breast cancer. Use of a 3D culture system to study pathways related to hormone independence in mice.</a> PLoS One. 5 (5), e10786(2010).</li>
<li>Hatzivassiliou, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RAF+inhibitors+prime+wild-type+RAF+to+activate+the+MAPK+pathway+and+enhance+growth%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">RAF inhibitors prime wild-type RAF to activate the MAPK pathway and enhance growth.</a> Nature. 464 (7287), 431-435 (2010).</li>
<li>Bhargava, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Registered+report%3A+RAF+inhibitors+prime+wild-type+RAF+to+activate+the+MAPK+pathway+and+enhance+growth%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">Registered report: RAF inhibitors prime wild-type RAF to activate the MAPK pathway and enhance growth.</a> Elife. 5, e09976(2016).</li>
<li>Mathews, L. A., Hurt, E. M., Zhang, X., Farrar, W. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epigenetic+regulation+of+CpG+promoter+methylation+in+invasive+prostate+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cancer%22%5BJournal%5D)">Epigenetic regulation of CpG promoter methylation in invasive prostate cancer cells.</a> Molecular Cancer. 9, 267(2010).</li>
<li>Mathews, L. A., Crea, F., Farrar, W. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epigenetic+gene+regulation+in+stem+cells+and+correlation+to+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Differentiation%22%5BJournal%5D)">Epigenetic gene regulation in stem cells and correlation to cancer.</a> Differentiation. 78 (1), 1-17 (2009).</li>
<li>Mathews, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increased+expression+of+DNA+repair+genes+in+invasive+human+pancreatic+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Pancreas%22%5BJournal%5D)">Increased expression of DNA repair genes in invasive human pancreatic cancer cells.</a> Pancreas. 40 (5), 730-739 (2011).</li>
<li>Mathews, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+1536-well+quantitative+high-throughput+screen+to+identify+compounds+targeting+cancer+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomolecular+Screening%22%5BJournal%5D)">A 1536-well quantitative high-throughput screen to identify compounds targeting cancer stem cells.</a> Journal of Biomolecular Screening. 17 (9), 1231-1242 (2012).</li>
<li>Horii, T., Nagao, Y., Tokunaga, T., Imai, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Serum-free+culture+of+murine+primordial+germ+cells+and+embryonic+germ+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Theriogenology%22%5BJournal%5D)">Serum-free culture of murine primordial germ cells and embryonic germ cells.</a> Theriogenology. 59 (5-6), 1257-1264 (2003).</li>
<li>Sun, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epigenetic+regulation+of+SOX9+by+the+NF-kappaB+signaling+pathway+in+pancreatic+cancer+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Epigenetic regulation of SOX9 by the NF-kappaB signaling pathway in pancreatic cancer stem cells.</a> Stem Cells. 31 (8), 1454-1466 (2013).</li>
<li>Mathews, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+1536-well+quantitative+high-throughput+screen+to+identify+compounds+targeting+cancer+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomolecular+Screening%22%5BJournal%5D)">A 1536-well quantitative high-throughput screen to identify compounds targeting cancer stem cells.</a> Journal of Biomolecular Screening. 17 (9), 1231-1242 (2012).</li>
<li>Mathews Griner, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+combinatorial+screening+identifies+drugs+that+cooperate+with+ibrutinib+to+kill+activated+B-cell-like+diffuse+large+B-cell+lymphoma+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">High-throughput combinatorial screening identifies drugs that cooperate with ibrutinib to kill activated B-cell-like diffuse large B-cell lymphoma cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (6), 2349-2354 (2014).</li>
<li>Herter, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+three-dimensional+heterotypic+spheroid+model+for+the+assessment+of+the+activity+of+cancer+immunotherapy+agents%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Immunology%2C+Immunotherapy%22%5BJournal%5D)">A novel three-dimensional heterotypic spheroid model for the assessment of the activity of cancer immunotherapy agents.</a> Cancer Immunology, Immunotherapy. 66 (1), 129-140 (2017).</li>
</ol>

Los autores son empleados de Novartis, y algunos empleados son también accionistas.

Los métodos presentados aquí demuestran un protocolo detallado en cómo producir esferoides tumorales en placas 1536 pocillos para proyecciones a gran escala de compuestos. Estos métodos fueron inicialmente adaptados del trabajo del Instituto Nacional del cáncer donde esferoides tumorales fueron cultivadas en los ensayos de rendimiento bajo en placas bien 6 y 96 pocillos para hacer preguntas sobre las dependencias genéticas y sensibilidad compuesto13, 14 ,</s...

En la última década, cada vez más estudios han implementado el uso de modelos de cultura celular 3D para entender conceptos que no son completamente recapitulados por cultivo de células en 2D en el plástico. Ejemplos de estos conceptos incluyen las alteraciones en células epiteliales normales polaridad1 donde la orientación espacial de las capas basals y apicales de las células se pierden, así como el papel de la matriz extracelular en la regulación de la supervivencia y el destino celular. Investigación oncológica, en particular, ha utilizado modelos 3D para entender la biología básica de las células cancerosas y las diferencias entre 2D y 3D de la célula cultura sistemas3,4. El desarrollo de técnicas más sofisticadas de la cultura de célula y su posterior adaptación a formatos múltiples bien ha permitido la búsqueda de nuevos fármacos en entornos 3D. En contraste con las células cultivadas bajo condiciones de 2D, modelos en 3D de la gama de tumores en la complejidad de sistemas celulares5 esferas solo tipo de células de diferentes tamaños, esferas de celdas de tipo complejo6,7, 8. el descubrimiento de nuevos compuestos o productos biológicos que potentemente inducen muerte celular en estos sistemas de modelo 3D es, por tanto, de gran interés en las campañas de desarrollo de drogas. Puntos finales de estos ensayos son a menudo idénticos a los realizados en culturas 2D para evaluar los cambios en la proliferación celular, pero cuando llevó a cabo en un entorno más fisiológicamente relevante, puede revelar el verdadero nivel de dependencia de la gene de la blanco o vía interrogado.
Como anteriormente, se han desarrollado una variedad de sistemas modelo para estudiar las respuestas de la droga en los sistemas de cultivo 3D, pero la mayoría utiliza o placas de microtitulación de 96 o 384 pocillos y no es fácilmente adaptable a los formatos de high-throughput screening (HTS) de uso frecuente en campañas de proyección de descubrimiento de drogas. Tales sistemas incluyen el uso de colgantes tecnologías de gotita, culturas del esferoide, pulsátil de las células con partículas magnéticas para inducir la levitación y las culturas incorpora geles naturales o sintéticos tales como colágeno, Matrigel o polietilenglicol (PEG)2 . Aquí, presentamos los métodos detallados de una técnica previamente desarrollado para producir cultivos 3D esferoide de líneas celulares de cáncer establecido en un formato de placa de la pozo 1536. En este protocolo, se utiliza un medio altamente definido que evita que el accesorio de celular normalmente adherente líneas9. Este sistema tiene limitaciones (es decir, no puede recapitular completamente un sistema modelo complejo de cáncer), pero sin embargo, estos ensayos permiten una proyección de alto rendimiento de grandes colecciones de moléculas pequeñas y transversales comparaciones de la respuesta de la droga entre las culturas 2D y 3D contra una variedad de líneas de células y compuestos.
Las líneas celulares seleccionaron para demostrar los métodos en este artículo todo Puerto mutaciones en genes relacionados con la vía, un camino que es muy desequilibrada en el cáncer, de señalización de MAPK y de que muchos tratamientos están disponibles. Muchas de las líneas tienen activación oncogénicas mutaciones en el virus del Sarcoma de rata Kirsten también denominado KRAS, el RAS de Neuroblastoma o ANR, oncogene del virus del Sarcoma de Harvey rata o HRAS y las quinasas asociadas rápidamente acelerado Fibrosarcomas, también conocido como RAFs. La literatura reciente sugiere que los inhibidores de distintos nodos de esta vía son únicamente más eficaces en un subgrupo de las líneas celulares cuando se cultivan bajo condiciones 3D9,10. Un estudio encontró que cuando las células cancerosas con RAS activa fueron cultivadas en 3D, demostró una mayor sensibilidad a los inhibidores de la MAPK y además, que este enfoque podría identificar vías y dirigido inhibidores que podrían perderse en el tradicional 2D ajuste. El objetivo de este estudio es presentar los métodos utilizados para estas líneas celulares de la cultura, y además, para demostrar el diferencial de las respuestas a estos inhibidores que se pueden observar solamente cuando se usa 3D celular sistemas de cultivo.

<table><tbody><tr><td>Reagents</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>DMEM Dulbecco's Modified Eagle Media (DMEM)/F12</td><td>ATCC</td><td>30-2006</td><td>Comprado como solución preparada. Se encontró que este recibo era el preferido en comparación con otros proveedores.</td></tr><tr><td>DMEM Dulbecco's Modified Eagle Media (DMEM)/F12</td><td>Lonza</td><td>12-604F</td><td>Comprado como solución preparada.</td></tr><tr><td>Roswell Park Memorial Institute (RPMI)</td><td>Lonza</td><td>12-115Q</td><td>Comprado como una solución preparada.</td></tr><tr><td>Suero Fetal Bovino (FBS)</td><td>Seradigm</td><td>1500-500</td><td>Comprado como solución preparada.</td></tr><tr><td>1x Tripsina al 0,25% con ácido etilendiaminotetraacético (EDTA)</td><td>Hidrocona</td><td>SH30042.01</td><td>Comprado como solución preparada.</td></tr><tr><td>1x Penicilina/Estreptomicina</td><td>Gibco</td><td>15140</td><td>Comprado como solución preparada.</td></tr><tr><td>10 ng/mL Factor de Crecimiento Fibrobast básico humano (bFGF)</td><td>Sigma</td><td>F0291</td><td>Resuspender en agua estéril.</td></tr><tr><td>20 ng/mL Factor de Crecimiento Epidérmico Humano (EGF)</td><td>Sigma</td><td>E9644</td><td>Resuspender en agua estéril.</td></tr><tr><td>0.4% Albúmina sérica bovina (BSA)</td><td>Sigma</td><td>A9418</td><td>Resuspender en PBS estéril y filtro.</td></tr><tr><td>1x Insulina Transferrina Selenio (ITS)</td><td>Gibco</td><td>51500056</td><td></td></tr><tr><td>1% KnockOut (KO) Reemplazo de Suero</td><td>Gibco</td><td>10828-028</td><td>Agregue fresco justo antes de usar.</td></tr><tr><td>100% Dimetilsulfóxido (DMSO)</td><td>Sigma</td><td>276855-100ML</td><td></td></tr><tr><td>CellTiter-Glo</td><td>Promega</td><td>G7573</td><td>Comprado como solución preparada.</td></tr><tr><td><Consumibles fuertes></Resistentes></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pequeño Cassette</td><td>Combi ThermoFisher</td><td>24073295</td><td></td></tr><tr><td>Casete Multiflujo Pequeño</td><td>BioTek</td><td>294085</td><td></td></tr><tr><td>1536 pocillos estériles Placas TC (blanco)</td><td>Corning</td><td>3727</td><td></td></tr><tr><td>Placas TC estériles de 1536 pocillos (negro)</td><td>Placas</td><td></td> Corning 3893 <td></td></tr><tr><td>Scivax</td><td>MBL International</td><td>NCP-LH384-10<</td><td></td></tr><tr><td>strong>Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Adhesivos Sellos ThermoFisher</td><td></td><td>AB0718</td><td></td></tr><tr><td>Incubadora</td> giratoria <td>LiCONiC</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tapas de acero inoxidable</td><td>El Instituto de Genómica de la Fundación de Investigación Novartis (GNF)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ATS Dispensador acústico</td><td>EDS Biosystems</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Echo Dispensador Acústico</td><td>Labcyte</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Luminómetro</td><td>Envision-Perkin Elmer</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bomba Peristáltica- Multidrop Combi</td><td>ThermoFisher</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Liquid Handler-Multiflow FX</td><td>BioTek</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

generación de esferoides tumorales tridimensional de alto rendimiento para la detección de drogas

Generation of High-Throughput Three-Dimensional Tumor Spheroids for Drug Screening

Las células cancerosas han sido cultivadas habitualmente en dos dimensiones (2D) en una superficie de plástico. Esta técnica, sin embargo, carece de un tumor verdadero medio ambiente masa está expuesta a en vivo. Tumores sólidos crecen no como una hoja de plástico, pero en su lugar como una colección de células clonales en una tridimensional (3D) espacio interactuando con sus vecinos y con distintas propiedades espaciales como la alteración de la polaridad celular normal. Estas interacciones provocan las células cultivadas 3D adquieren características morfológicas y celulares que son más relevantes para tumores en vivo . Además, un tumor masa está en contacto directo con otros tipos celulares como células stromal e inmunes, así como la matriz extracelular de todos los tipos de célula. La matriz depositada se compone de macromoléculas como colágeno y fibronectina.
En un intento por aumentar la traducción de resultados de la investigación en oncología de banco a cabecera, muchos grupos han comenzado a investigar el uso de sistemas de modelo 3D en sus estrategias de desarrollo de drogas. Estos sistemas son probablemente más fisiológico relevantes porque intentar recapitular el ambiente complejo y heterogéneo de un tumor. Estos sistemas, sin embargo, pueden ser bastante complejos y, aunque susceptibles de crecimiento en formatos de 96 pozos y algunos incluso en 384, ofrecen pocas opciones para el crecimiento a gran escala y proyección. Esto observado diferencia ha conducido al desarrollo de los métodos descritos aquí en detalle esferoides tumorales de cultura en una capacidad de alto rendimiento en placas 1536 pocillos. Estos métodos representan un compromiso para los sistemas basados en matriz muy complejos, que son difíciles de pantalla y los análisis 2D convencionales. Una variedad de líneas celulares de cáncer que diferentes mutaciones genéticas son correctamente evaluados, examinar eficacia compuesto mediante el uso de una biblioteca de comisariado de compuestos contra el camino del Kinase de proteína Mitogen-Activated o MAPK. Las respuestas de la cultura de esferoide entonces se compararon con la respuesta de las células cultivadas en 2D, y se divulgan actividades diferenciadas. Estos métodos proporcionan un protocolo único para las pruebas de actividad compuesto en un entorno 3D de alto rendimiento.

Una variedad de células de cáncer establecido líneas que crecen bien bajo condiciones de cultivo 2D se analizaron usando los métodos descritos aquí. Imágenes representativas de una variedad de cáncer mutante MAPK líneas celulares (Calu-6:KRAS, NCI-H1299:NRAS, SK-MEL-30:NRAS y KNS-62:HRAS) se ven en la figura 1. Estas imágenes demuestran que aunque las líneas celulares tienen morfologías diferentes, cada uno formado estructuras 3D en las placas de ensayo de 15...

En una amplia variedad de indicaciones de enfermedad, modelos más fisiológico relevantes están siendo programas de descubrimiento de drogas desarrollado e implementado en. El nuevo sistema del modelo aquí descrito muestra tumor cómo tridimensional de esferoides pueden ser cultivados y defendidos en un sistema de base de placa de alto rendimiento 1536-bien buscar nuevos medicamentos de Oncología.

Generación de esferoides tumorales tridimensional de alto rendimiento para la detección de drogas

Cancer cells have routinely been cultured in two dimensions (2D) on a plastic surface. This technique, however, lacks the true environment a tumor mass is ...

Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo del descubrimiento de fármacos, como por ejemplo, cuál es el entorno de cultivo de tejidos más relevante para la identificación de hit-to-lead. La principal ventaja de esta técnica es que permite el cultivo de células en tres dimensiones, de una manera de alto rendimiento, utilizando 1536 placas de pocillos. La demostración de este protocolo estará a cargo de Kalyani Gampa, un científico senior de mi laboratorio.Para configurar un cultivo de esferoides tumorales en 3D, separe las líneas celulares cancerosas de interés con tres lavados de BBS. Seguido de la adición de un mililitro de tripsina por cada cinco centímetros cuadrados de área del matraz de cultivo. Después de cinco minutos, neutralice la tripsina con cinco veces el volumen de medio suplementado con suero en cada matraz y cuente las células.Utilice un pequeño casete esterilizado con punta de acero inoxidable con un sistema basado en una bomba peristáltica para sembrar un total de 500 células en ocho microlitros de medio esferoide en cada pocillo de una placa tratada con cultivo de tejido de 1.536 pocillos. A continuación, utilice un sello de placa adhesiva tr

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Research

Investigación

JoVE Journal

Cancer Research

Investigación del cáncer

Se introduce un protocolo para la generación de números grandes (miles a cientos de miles) de talla y esferoides tumorales composición controlado uniforme, utilizando placas de micropocillos disponibles en el mercado.

La producción de grandes cantidades de esferoides tumorales Tamaño controlados utilizando placas de micropocillos

La invasión de los tejidos normales circundantes es una característica definitoria de los tumores malignos. Proporcionamos aquí un ensayo de microplaca simple y semiautomatizado de invasión en una biomatriz 3D natural que se ha ejemplificado con una serie de modelos de cánceres humanos avanzados.

Tumor Ensayo tridimensional (3D) esferoide Invasion

Se presenta un protocolo para la impresión robótica de esferoides de células cancerosas en un formato de placa de 96 pocillos de alto rendimiento utilizando un sistema acuoso de dos fases.

Producción Robótica de Cancer Cell esferoides con un sistema acuoso de dos fases para la prueba de la droga

Los xenoinjertos derivados del paciente de glioblastoma multiforme pueden miniaturizarse en microtumores vivos utilizando un sistema de cultivo de biogel humano en 3D. Este ensayo tumoral 3D de tipo in vivo es adecuado para las pruebas de respuesta a fármacos y la elaboración de perfiles moleculares, incluido el análisis cinómico.

Generación de microtumores Uso Humano 3D Biogel sistema de cultivo y las células de glioblastoma derivados de los pacientes para Kinomic de perfiles y pruebas de respuesta a los fármacos

Tomografía de coherencia óptica (OCT), una tecnología de imagen tridimensional, fue utilizada para monitorear y caracterizar la cinética de crecimiento de esferoides multicelulares tumor. Cuantificación volumétrica precisa de esferoides tumorales usando un voxel contando el enfoque y la detección de tejido libre de etiqueta muerto en esferoides basado en contraste intrínseco atenuación óptica, fueron demostrados.

Longitudinal control morfológico y fisiológico de esferoides tumorales tridimensional mediante tomografía de coherencia óptica

Este protocolo describe la generación de esferoides derivados del paciente, y el análisis posterior, incluyendo la cuantificación de la proliferación, las pruebas de citotoxicidad, la citometría de flujo, la tinción de inmunofluorescencia y la toma de imágenes confocales, con el fin de evaluar la droga potencial de los candidatos como terapias antineoplásicas. Este protocolo apoya la medicina de precisión con la identificación de medicamentos específicos para cada paciente y etapa de la...

Paisidio Paciente Derivado Esferoides 3D para la detección de drogas antineoplásicas para apuntar a las células madre del cáncer

Este protocolo detalla un método para la producción de tres tipos diferentes de esferoides de una manera que los hace adecuados para la detección y el análisis de alto contenido a gran escala. Además, se presentan ejemplos que muestran cómo se pueden analizar a nivel de células esferoides e individuales.

Un método robusto para la producción a gran escala de esferoides para aplicaciones de detección y análisis de alto contenido

Los esferoides tumorales se utilizan cada vez más para evaluar las interacciones entre células tumorales y microambientes y la respuesta a la terapia. El presente protocolo describe un método robusto pero simple para imágenes de semi-alto rendimiento de esferoides tumorales 3D utilizando una limpieza óptica rápida.

Limpieza óptica rápida para el análisis de semi-alto rendimiento de esferoides tumorales

El presente protocolo describe la generación de modelos de cultivo tumoral 3D a partir de células cancerosas primarias y la evaluación de su sensibilidad a los fármacos mediante ensayos de viabilidad celular y exámenes microscópicos.

Establecimiento de esferoides tridimensionales a partir de muestras tumorales derivadas de pacientes y evaluación de su sensibilidad a los fármacos

Este artículo demuestra un método estandarizado para construir esferoides tumorales tridimensionales. También se describe una estrategia para la observación de esferoides y el análisis de aprendizaje profundo basado en imágenes utilizando un sistema automatizado de imágenes.

Generación de esferoides tumorales 3D para estudios de evaluación de fármacos

Aquí, establecemos una plataforma de perfiles metabólicos que integra esferoides de glioma tridimensionales (3D) y normalización basada en imágenes a través del análisis de flujo extracelular. Este enfoque permite una evaluación más precisa de las respuestas metabólicas de los tumores a los tratamientos farmacológicos y proporciona información sobre los posibles mecanismos de resistencia.

Avances en el perfil metabólico de esferoides tumorales cerebrales tridimensionales para la detección de fármacos

Aprende a generar esferoides tumorales tridimensionales en placas de 1536 pocillos para descubrimiento de fármacos oncológicos. Este método de alta capacidad mejora la identificación de candidatos terapéuticos.

Generación de esferoides tumorales tridimensional de alto rendimiento para la detección de drogas

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