CARIP-Seq y ChIP-Seq: métodos para identificar cromatina asociada RNAs y las interacciones DNA proteína en las células madre embrionarias

El objetivo general de CARIP-Seq es estudiar los ARN asociados a la cromatina de todo el genoma. El objetivo de ChIP-Seq es evaluar las interacciones proteína-ADN a escala global en células madre embrionarias. Estos métodos pueden ayudar a responder preguntas clave en los campos de la epigenética y las células madre, identificar la ubicación del genoma, los factores de transcripción o la unión al regulador epigenético o la modificación de histonas, la ocupación o los ARN asociados a la cromatina en las células madre embrionarias.

La principal ventaja de estas técnicas es que permiten la interrogación imparcial de todo el genoma de los ARN asociados con los constituyentes de la cromatina y la identificación global de las interacciones entre proteínas y ADN. Aunque estos métodos pueden proporcionar información sobre la biología de las células madre embrionarias, también se pueden aplicar a otros tipos de células de mamíferos para estudiar la biología del cáncer u otras enfermedades humanas. Para recolectar las células madre embrionarias, primero lave las células con solución salina tamponada con fosfato.

A continuación, separe las células con tripsina al 0,25%, precalentada a 37 grados centígrados. Después de la tripsinización, vuelva a suspender las células en medio MEF precalentado, complementado con un 10% de suero bovino fetal. Luego, agregue 37% de formaldehído a las células en un tubo cónico hasta una concentración final de 1% e incube a 37 grados Celsius durante ocho minutos para reticular las células.

Para detener la reacción de fijación, agregue glicina 1,25 molar previamente enfriada a cuatro grados centígrados hasta una concentración final de 0,125 molar. Luego, coloque el tubo en un rotador e inviértalo a ocho revoluciones por minuto durante cinco minutos a temperatura ambiente. Después de cinco minutos, centrifugar la muestra a 300 g durante cinco minutos a temperatura ambiente.

Una vez finalizada la centrifugación, deseche el sobrenadante. A continuación, lavar el pellet con solución salina tamponada con fosfato preenfriado y volver a centrifugar la muestra. Luego, retire la solución salina tamponada con fosfato y congele las células en nitrógeno líquido durante un minuto.

Una vez que las células madre embrionarias se descongelen en hielo, vuelva a suspender el pellet en 2,5 mililitros de tampón de sonicación. Para estudiar los factores de transcripción o los factores epigenéticos, vuelva a suspender el pellet celular en un tampón de sonicación sin dodecil sulfato de sodio. Para las modificaciones de histonas, vuelva a suspender el gránulo celular en un tampón que contenga dodecil sulfato de sodio.

A continuación, para la inmunoprecipitación de cromatina, sonicar la cromatina durante 14 a 18 ciclos al 40% de amplitud con 30 segundos encendido y 30 segundos en modo de reposo. Para solubilizar la cromatina para el factor proteico ChIP, complementar el tampón de sonicación con 28 microlitros de dodecil sulfato de sodio al 10%. Para los factores proteicos en las modificaciones de histonas, agregue 28 microlitros de desoxicolato de sodio y 0,28 mililitros de Triton X-100 al 10% y mezcle bien.

A continuación, centrifugar la muestra a 10.000 g durante 10 minutos a cuatro grados centígrados para aclarar previamente la cromatina. En un tubo de baja unión de 1,5 mililitros, agregue 40 microlitros de perlas magnéticas A o G. A continuación, lavar las perlas con 600 microlitros de solución salina tamponada con fosfato y transferir el tubo con las perlas a una rejilla que contenga un imán e incubar durante un minuto a temperatura ambiente.

A continuación, retire la solución salina tamponada con fosfato y vuelva a suspender las perlas en 100 microlitros de solución salina tamponada con fosfato. Al tubo, agregue de dos a cuatro microgramos de anticuerpo e incubelo colocándolo en un rotador durante 40 minutos a ocho revoluciones por minuto para promover la unión del anticuerpo a las perlas. A continuación, añade 200 microlitros de solución salina tamponada con fosfato para lavar las perlas.

Después del lavado, incubar el extracto de cromatina sonicado en un rotador a cuatro grados centígrados durante la noche para inmunoprecipitar las proteínas unidas a la cromatina. Al día siguiente, lave las perlas e incube con tampón RIPA, tampón RIPA con sal, tampón de cloruro de litio, tampón Tris-EDTA con Triton X-100 y tampón Tris-EDTA, cada uno durante 10 minutos en un rotador. Para desvincular el ChIP, vuelva a suspender las perlas en 100 microlitros de tampón Tris-EDTA.

Luego agregue tres microlitros de dodecil sulfato de sodio al 10% y cinco microlitros de 20 miligramos por mililitro de proteinasa K, e incube las perlas a 65 grados centígrados durante la noche. Después de la incubación, al día siguiente, invierta los tubos varias veces, déjelos en la rejilla magnética y transfiera el sobrenadante a un tubo nuevo. A continuación, lavar las perlas magnéticas añadiendo 100 microlitros de tampón Tris-EDTA, que contiene cloruro de sodio 0,5 molar, y combinar los dos sobrenadantes.

Para desenlazar para CARIP, vuelva a suspender las perlas en 100 microlitros de tampón Tris-EDTA. A continuación, añade tres microlitros de dodecil sulfato de sodio al 10% y cinco microlitros de 20 miligramos por mililitro de proteinasa K e incuba las perlas a 65 grados centígrados durante cuatro a 12 horas. Nuevamente, invierta el tubo varias veces y colóquelo en la rejilla magnética para transferir el sobrenadante a un tubo nuevo.

A continuación, lave las perlas magnéticas añadiendo 100 microlitros de tampón Tris-EDTA, que contiene cloruro de sodio 0,5 molar, y luego combine los dos sobrenadantes. Finalmente, aísle la muestra de ARN mediante el uso de alcohol isoamílico de cloroformo fenol en una proporción de 25 a 24 a un volumen por volumen. A continuación, utilice la DNasa para eliminar el ADN de la muestra de ARN inmunoprecipitado asociada a la cromatina.

A continuación, añada un tampón de DNasa 10X a la muestra CARIP y ajuste el volumen final a una concentración de 1X. Luego, incube la muestra a 37 grados centígrados durante 30 minutos. A continuación, sintetiza la primera hebra de ADN complementario configurando una reacción de PCR añadiendo 10,5 microlitros de ARN y un microlitro de tres microgramos por mililitro de cebadores de hexámero aleatorios.

Para desnaturalizar la estructura secundaria, primero, incube el tubo a 65 grados centígrados durante cinco minutos y luego en hielo durante dos minutos. A continuación, añade la mezcla maestra al tubo de PCR e incuba a 25 grados centígrados durante dos minutos. A continuación, añada un microlitro de 200 unidades por microlitro de superíndice dos y ejecute el programa del termociclador.

Para sintetizar la segunda hebra de ADN complementario, configure la reacción en hielo agregando los reactivos, el tampón y las enzimas. A continuación, se agita suavemente los reactivos y se incuba a 16 grados centígrados durante dos horas. Una vez que se haya sintetizado el ADN, purifique el ADN complementario utilizando un kit de purificación de PCR.

A continuación, desfragmenta el ADN bicatenario, utiliza un sonificador de baño de agua y un tubo de 1,5 mililitros para compartir el ADN a un tamaño de 250 a 500 pares de bases durante tres veces 10 minutos o cuatro veces 10 minutos. A continuación, prepare la biblioteca y realice la secuenciación de próxima generación. Aquí, se capturaron imágenes de contraste de fase de células madre embrionarias para visualizar las colonias de células madre.

En este protocolo, las células se cultivaron en presencia o ausencia de fibroblastos embrionarios de ratón mitóticamente inactivados con LIF y/o GSK3i en los medios de cultivo para evitar la diferenciación de las células. A continuación, para visualizar la eficacia de la sonicación de la cromatina de las células madre embrionarias reticuladas, se cargó ADN bicatenario sonicado en un gel de agarosa al 2%. La imagen en gel muestra cromatina cortada en el rango de 200 a 500 pares de bases.

A continuación, se generaron y secuenciaron bibliotecas ChIP-Seq utilizando una plataforma de secuenciación de próxima generación para evaluar la ocupación en todo el genoma de una enzima modificadora de histonas y las modificaciones de histonas en células madre embrionarias. Desde la vista personalizada del navegador UCSC, la trimetilación H3K4 enriquecida, la dimetilación H3K4 y KDM5B son visibles en el gen regulador de pluripotencia central, POU5F1 y en el clúster HOXC. También se realizó el análisis CARIP-Seq para evaluar los ARN asociados a la cromatina en células madre embrionarias.

La vista personalizada del navegador UCSC muestra el ARN asociado a la trimetilación H4K20 y la ocupación de la trimetilación H4K20 en células madre embrionarias. A partir de los resultados de CARIP-Seq, se puede interpretar que, aunque el ARN está asociado con la trimetilación de H4K20, es posible que no interactúe con el locus en particular. Una vez dominada, esta técnica se puede realizar en cuatro días si se realiza correctamente.

Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo estudiar los ARN asociados a la cromatina usando CARIP-Seq e identificar las interacciones del ADN de las proteínas a escala global en las células madre embrionarias.