Name: CARIP-Seq y ChIP-Seq: métodos para identificar cromatina asociada RNAs y las interacciones DNA proteína en las células madre embrionarias (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-05-25T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 13 s
Description: Aprende ChIP-Seq y CARIP-Seq para mapear epigenomas globales en células madre embrionarias. Estas técnicas identifican interacciones proteína-DNA y RNAs asociados a cromatina con aplicaciones en epigenética.

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Este trabajo fue apoyado por Wayne estado Universidad, Karmanos Cancer Institute, una beca de la National Heart, Lung and Blood Institute (1K22HL126842-01A1) a B.L.K. Este trabajo utiliza el Wayne estado Universidad alto rendimiento Computación Grid de recursos computacionales (< https://www.grid.wayne.edu/>). Agradecemos Jiji Kurup ayuda con análisis de datos de CARIP-Seq.
CONTRIBUCIONES DE LOS AUTORES:
B.L.K. concibió el método de CARIP-Seq, diseñado y llevado a cabo los experimentos de ChIP-Seq y CARIP-Seq, analizó los datos de secuenciación y redactó el manuscrito. Todos los autores han leído y aprobado la versión final de este manuscrito.

<ol><li>Barski, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-resolution+profiling+of+histone+methylations+in+the+human+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">High-resolution profiling of histone methylations in the human genome.</a> Cell. 129 (4), 823-837 (2007).</li>
<li>Chen, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integration+of+external+signaling+pathways+with+the+core+transcriptional+network+in+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Integration of external signaling pathways with the core transcriptional network in embryonic stem cells.</a> Cell. 133 (6), 1106-1117 (2008).</li>
<li>Boyer, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Core+transcriptional+regulatory+circuitry+in+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Core transcriptional regulatory circuitry in human embryonic stem cells.</a> Cell. 122 (6), 947-956 (2005).</li>
<li>Kim, J., Chu, J., Shen, X., Wang, J., Orkin, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+extended+transcriptional+network+for+pluripotency+of+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">An extended transcriptional network for pluripotency of embryonic stem cells.</a> Cell. 132 (6), 1049-1061 (2008).</li>
<li>Kidder, B. L., Hu, G., Yu, Z. X., Liu, C., Zhao, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extended+self-renewal+and+accelerated+reprogramming+in+the+absence+of+Kdm5b%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Extended self-renewal and accelerated reprogramming in the absence of Kdm5b.</a> Mol Cell Biol. 33, 4793-4810 (2013).</li>
<li>Kidder, B. L., Hu, G., Zhao, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((KDM5B+focuses+H3K4+methylation+near+promoters+and+enhancers+during+embryonic+stem+cell+self-renewal+and+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biol%22%5BJournal%5D)">KDM5B focuses H3K4 methylation near promoters and enhancers during embryonic stem cell self-renewal and differentiation.</a> Genome Biol. 15 (2), R32(2014).</li>
<li>Zhao, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+identification+of+polycomb-associated+RNAs+by+RIP-seq%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">Genome-wide identification of polycomb-associated RNAs by RIP-seq.</a> Mol Cell. 40 (6), 939-953 (2010).</li>
<li>Baltz, A. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mRNA-bound+proteome+and+its+global+occupancy+profile+on+protein-coding+transcripts%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">The mRNA-bound proteome and its global occupancy profile on protein-coding transcripts.</a> Mol Cell. 46 (5), 674-690 (2012).</li>
<li>Castello, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insights+into+RNA+biology+from+an+atlas+of+mammalian+mRNA-binding+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Insights into RNA biology from an atlas of mammalian mRNA-binding proteins.</a> Cell. 149 (6), 1393-1406 (2012).</li>
<li>Hudson, W. H., Ortlund, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+structure%2C+function+and+evolution+of+proteins+that+bind+DNA+and+RNA%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Bio%22%5BJournal%5D)">The structure, function and evolution of proteins that bind DNA and RNA.</a> Nat Rev Mol Cell Bio. 15 (11), 749-760 (2014).</li>
<li>Khalil, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Many+human+large+intergenic+noncoding+RNAs+associate+with+chromatin-modifying+complexes+and+affect+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22P+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Many human large intergenic noncoding RNAs associate with chromatin-modifying complexes and affect gene expression.</a> P Natl Acad Sci USA. 106 (28), 11667-11672 (2009).</li>
<li>Hendrickson, D. G., Kelley, D. R., Tenen, D., Bernstein, B., Rinn, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Widespread+RNA+binding+by+chromatin-associated+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biol%22%5BJournal%5D)">Widespread RNA binding by chromatin-associated proteins.</a> Genome Biol. 17, 28(2016).</li>
<li>Kelley, R. L., Kuroda, M. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Noncoding+RNA+genes+in+dosage+compensation+and+imprinting%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Noncoding RNA genes in dosage compensation and imprinting.</a> Cell. 103 (1), 9-12 (2000).</li>
<li>Koziol, M. J., Rinn, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA+traffic+control+of+chromatin+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Genet+Dev%22%5BJournal%5D)">RNA traffic control of chromatin complexes.</a> Curr Opin Genet Dev. 20 (2), 142-148 (2010).</li>
<li>Mercer, T. R., Mattick, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+and+function+of+long+noncoding+RNAs+in+epigenetic+regulation%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Struct+Mol+Bio%22%5BJournal%5D)">Structure and function of long noncoding RNAs in epigenetic regulation.</a> Nat Struct Mol Bio. 20 (3), 300-307 (2013).</li>
<li>Chu, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematic+discovery+of+Xist+RNA+binding+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Systematic discovery of Xist RNA binding proteins.</a> Cell. 161 (2), 404-416 (2015).</li>
<li>Mak, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reactivation+of+the+paternal+X+chromosome+in+early+mouse+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Reactivation of the paternal X chromosome in early mouse embryos.</a> Science. 303 (5658), 666-669 (2004).</li>
<li>Garfield, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Derivation+of+primary+mouse+embryonic+fibroblast+%28PMEF%29+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Derivation of primary mouse embryonic fibroblast (PMEF) cultures.</a> Methods Mol Biol. 633, 19-27 (2010).</li>
<li>Conner, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+embryo+fibroblast+%28MEF%29+feeder+cell+preparation%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Mouse embryo fibroblast (MEF) feeder cell preparation.</a> Curr Protoc Mol Biol. , Chapter 23 Unit 23 22 (2001).</li>
<li>Ying, Q. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+ground+state+of+embryonic+stem+cell+self-renewal%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The ground state of embryonic stem cell self-renewal.</a> Nature. 453 (7194), 519-523 (2008).</li>
<li>Langmead, B., Salzberg, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fast+gapped-read+alignment+with+Bowtie+2%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Fast gapped-read alignment with Bowtie 2.</a> Nat Methods. 9 (4), 357-359 (2012).</li>
<li>Zang, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+clustering+approach+for+identification+of+enriched+domains+from+histone+modification+ChIP-Seq+data%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">A clustering approach for identification of enriched domains from histone modification ChIP-Seq data.</a> Bioinformatics. 25 (15), 1952-1958 (2009).</li>
<li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Model-based+analysis+of+ChIP-Seq+%28MACS%29%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biol%22%5BJournal%5D)">Model-based analysis of ChIP-Seq (MACS).</a> Genome Biol. 9 (9), R137(2008).</li>
<li>Liu, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+model-based+Analysis+of+ChIP-Seq+%28MACS%29+to+analyze+short+reads+generated+by+sequencing+protein-DNA+interactions+in+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Use model-based Analysis of ChIP-Seq (MACS) to analyze short reads generated by sequencing protein-DNA interactions in embryonic stem cells.</a> Methods Mol Biol. 1150, 81-95 (2014).</li>
<li>Kidder, B. L., Hu, G., Zhao, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ChIP-Seq%3A+technical+considerations+for+obtaining+high-quality+data%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Immunol%22%5BJournal%5D)">ChIP-Seq: technical considerations for obtaining high-quality data.</a> Nat Immunol. 12 (10), 918-922 (2011).</li>
<li>Quail, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+large+genome+center%27s+improvements+to+the+Illumina+sequencing+system%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">A large genome center's improvements to the Illumina sequencing system.</a> Nat Methods. 5 (12), 1005-1010 (2008).</li>
<li>Schmidl, C., Rendeiro, A. F., Sheffield, N. C., Bock, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ChIPmentation%3A+fast%2C+robust%2C+low-input+ChIP-seq+for+histones+and+transcription+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">ChIPmentation: fast, robust, low-input ChIP-seq for histones and transcription factors.</a> Nat Methods. 12 (10), 963-965 (2015).</li>
</ol>

Los autores no declaran conflicto de intereses.

ChIP-Seq es un método útil para evaluar la situación de las interacciones proteína-ADN global (por ej., factores de transcripción/histona modificación de enzimas/histona modificaciones y ADN) en células madre embrionarias, mientras que el nuevo protocolo de CARIP-Seq es útil en interrogatorio de Asociación de genoma de ARN con los componentes de la cromatina. ChIP-Seq es una herramienta fundamental que se utiliza para evaluar paisaje epigenético de células madre embrionarias y otros tipos de células. La calidad ...

Las decisiones de destino de células madre embrionarias (ES) son reguladas por la comunicación entre las señales extracelulares y un anfitrión de transcripcional reguladores, como modificadores de histonas, modificación post traducción de colas de las histonas. Estas interacciones facilitan la accesibilidad de la cromatina y empaquetado de la cromatina en uno de dos Estados: eucromatina, que es abierto y transcripcionalmente activo, y la heterocromatina, que es compacto y generalmente transcripcionalmente inactiva. Factores de transcripción con afinidades de unión de la secuencia específica de ADN y modificadores epigenéticos asociados con regiones euchromatic para participar en el control de la expresión génica. Métodos de secuenciación de próxima generación, incluyendo ChIP-Seq1, han sido fundamentales en la asignación de redes transcripcionales del genoma que son fundamentales para ES celular auto renovación y pluripotencia2,3,4 ,5,6. Por otra parte, mientras que immunopreciation RNA seguido por generación de secuenciación (RIP-Seq)7 las evaluaciones de las interacciones RNA-proteína sugieren que proteínas ADN interactuarán con RNAs regulación transcripcional eventos7, 8 , 9 , 10 , 11 , 12, pocos estudios han investigado la localización de todo el genoma de ARN asociado con cromatina12o interacciones globales entre el ARN y la histona modificación. ARN largo no codificante (lncRNAs) es una clase de RNAs que se han encontrado para regular la actividad de las proteínas asociadas a cromatina13,14,15. Por ejemplo, Xist es un lncRNA que regula, en células de mamífero femenino, la inactivación de un cromosoma de X, a través de la contratación de represores epigenéticos16,17. Sin embargo, el espectro completo de RNAs asociados con cromatina es desconocido. Aquí, describimos un protocolo nuevo, asociada a la cromatina RNA inmunoprecipitación (CARIP) seguida por secuenciación de próxima generación (CARIP-Seq), para identificar ARN cromatina asociados sobre una base de todo el genoma en células madre embrionarias, incluyendo preparación de biblioteca para secuenciación de próxima generación y ChIP-Seq mapa ocupación global de modificaciones de las histonas, factores de transcripción y modificadores de la epigenéticos. A diferencia de otros métodos de RIP-Seq7, CARIP-Seq incluye pasos de reticulación y sonicación, que permiten la identificación directa de ARN asociada a la cromatina. Juntos, ChIP-Seq es una poderosa herramienta para identificar las interacciones de la proteína del genoma-ADN, mientras que CARIP-Seq es un método poderoso para RNAs asociados con componentes de la cromatina.

<table><tbody><tr><td>Factor inhibidor de la leucemia en ratón (ESGRO LIF)</td><td>EMD Millipore</td><td></td><td>106 o 107 units</td></tr><tr><td>GSK3&beta; inhibidor CHIR99021 (GSK3i)</td><td>Disolvente derivante</td><td></td><td>: DMSO 10mM</td></tr><tr><td>Inhibidor de MEK PD0325901 (MEKi)</td><td>Disolvente derivante</td><td></td><td>: DMSO 10mM</td></tr><tr><td>Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM), alto contenido de glucosa</td><td>Invitrogen</td><td>11965092</td><td></td></tr><tr><td>PBS (solución salina tamponada con fosfato)</td><td>Invitrogen</td><td>10010031</td><td></td></tr><tr><td>Tripsina-EDTA (0,25%), rojo de fenol</td><td>Gibco</td><td>25200056</td><td></td></tr><tr><td>Penicilina-Estreptomicina (10.000 U/mL)</td><td>Gibco</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>2-Mercaptoetanol (50 mM)</td><td>Gibco</td><td>31350010</td><td></td></tr><tr><td>MEM Solución de aminoácidos no esenciales (100X)</td><td>Gibco</td><td>11140076</td><td></td></tr><tr><td>EmbryoMax ES Suero Fetal Bovino Calificado para Células, 500 ml</td><td>EMD Millipore</td><td>ES-009-B</td><td></td></tr><tr><td>EmbryoMax 0.1% Solución de Gelatina</td><td>EMD Millipore</td><td>ES-006-B</td><td></td></tr><tr><td>Glycine</td><td>Sigma</td><td>G7126-500G</td><td>1.25 M caldo de conentración en agua</td></tr><tr><td>Solución de formaldehído</td><td>Sigma</td><td>F8775-500ML</td><td></td></tr><tr><td>TE (Tris EDTA) pH 8.0 1X</td><td>Calidad Biológico</td><td>351-011-131</td><td></td></tr><tr><td>Solución de fluoruro de fenilmetanosulfonilo (PMSF)</td><td>Sigma</td><td>93482-250ML-F</td><td></td></tr><tr><td>cOmplete Cóctel de inhibidores de proteasa</td><td>Roche</td><td>11697498001</td><td></td></tr><tr><td>Solución de dodecil sulfato de sodio (20%)</td><td>Calidad Biológico</td><td>A611-0837-10</td><td></td></tr><tr><td>Q125 sonificador Qsonica</td><td></td><td>4422</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100 solución</td><td>Sigma</td><td>93443-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Desoxicolato de sodio</td><td>Sigma</td><td>30970</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma</td><td>S7653</td><td></td></tr><tr><td>Dynabeads Proteína G para inmunoprecipitación</td><td>Invitrogen</td><td>10004D</td><td></td></tr><tr><td>Dynabeads Proteína A para inmunoprecipitación</td><td>Invitrogen</td><td>10002D</td><td></td></tr><tr><td>Dynabeads Proteína A/Proteína G y Paquete de inicio de imanes</td><td>Invitrogen</td><td>10015D</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro de litio</td><td>Sigma</td><td>L4408</td><td></td></tr><tr><td>IGEPAL CA-630</td><td>Sigma</td><td>I8896</td><td></td></tr><tr><td>RNeasy Mini Kit</td><td>Qiagen</td><td>74104</td><td></td></tr><tr><td>Dynabeads Kit de purificación de ARNm (para la purificación de ARNm a partir de preparaciones totales de ARN)</td><td>Invitrogen</td><td>61006</td><td></td></tr><tr><td>SuperScript Síntesis de ADNc de doble cadena Kit</td><td>Invitrogen</td><td>11917010</td><td></td></tr><tr><td>QIAquick PCR Kit de purificación</td><td>Qiagen</td><td>28104</td><td></td></tr><tr><td>End-It DNA End-Repair Kit</td><td>Lucigen</td><td>ER81050</td><td></td></tr><tr><td>Klenow Fragment (3'&rarr; 5' exo-)</td><td>NEB</td><td>M0212L</td><td></td></tr><tr><td>dATP (10 mM)</td><td>Invitrogen</td><td>18252015</td><td></td></tr><tr><td>T4 ADN ligasa</td><td>NEB</td><td>M0202L</td><td></td></tr><tr><td>TrackIt 1 Kb Plus DNA Ladder</td><td>Invitrogen</td><td>10488085</td><td></td></tr><tr><td>E-gel EX geles de agarosa, 2%</td><td>Invitrogen</td><td>G402002</td><td></td></tr><tr><td>Phusion mezcla maestra 2X de alta fidelidad con tampón HF</td><td>Thermo Fisher</td><td></td><td></td>F531LPM</tr><tr><td>ChIPAb+ Trimetil-Histona H3 (Lys4) - Anticuerpo validado por ChIP</td><td>EMD Millipore</td><td>17-614</td><td></td></tr><tr><td>Anti-histona H3 (di metil K4) anticuerpo [Y47] - Grado ChIP (ab32356)</td><td>Abcam</td><td>ab32356</td><td></td></tr><tr><td>Corning Costar Placas de cultivo celular de fondo plano (6 pocillos)</td><td>Fisher</td><td>720083</td><td></td></tr><tr><td>Falcon Placas de cultivo de tejidos estándar (10 cm)</td><td>Fisher</td><td>08772E</td><td></td></tr><tr><td>Bioruptor pico</td><td>Diagenode</td><td>B01010001</td><td></td></tr><tr><td>Qubit Flurometer 2.0</td><td>Thermo Fisher</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Qubit dsDNA HS Kit de ensayo</td><td>Thermo Fisher</td><td>Q32851</td><td></td></tr><tr><td>MinElute Reaction Cleanup Kit</td><td>Qiagen</td><td>28204</td><td></td></tr><tr><td>MinElute Kit de extracción de gel</td><td>Qiagen</td><td>28604</td><td></td></tr><tr><td>Anti-histona H4 (tri metilo K20) anticuerpo - Grado ChIP (ab9053)</td><td>Abcam</td><td>ab9053</td><td></td></tr><tr><td>Rotador Labquake</td><td>Thermo Fisher</td><td>400110Q</td><td></td></tr><tr><td>Illumina Plataforma HiSeq</td><td>Illumina</td><td></td><td></td></tr><tr><td>TURBO DNase</td><td>Invitrogen</td><td>AM2238</td><td></td></tr></tbody></table>

carip-seq y chip-seq: métodos para identificar cromatina asociada rnas y las interacciones dna proteína en las células madre embrionarias

CARIP-Seq and ChIP-Seq: Methods to Identify Chromatin-Associated RNAs and Protein-DNA Interactions in Embryonic Stem Cells

Auto-renovación de células madre embrionarias (ES) y diferenciación se rige por señales extrínsecas e intrínsecas redes de factores de transcripción, reguladores epigenéticos y traducción posteriores modificaciones de las histonas que influyen combinatorially en el gene Estado de expresión de los genes cercanos. RNA se ha demostrado también al interactuar con diversas proteínas para regular la dinámica de la cromatina y expresión génica. Asociada a la cromatina RNA inmunoprecipitación (CARIP) seguida por secuenciación de próxima generación (CARIP-Seq) es un método novedoso para la encuesta de ARN asociado a proteínas de cromatina, mientras que de inmunoprecipitación de cromatina, seguida por secuenciación de próxima generación ( ChIP-Seq) es una técnica poderosa genómica para asignar la ubicación de modificaciones post-traduccionales de las histonas, factores de transcripción y epigenéticos modificadores a escala mundial en células madre embrionarias. Aquí, describimos los métodos para realizar CARIP-Seq y ChIP-Seq, incluyendo la construcción de la biblioteca para secuenciación de próxima generación, para generar ARN cromatina asociado global y mapas epigenómicos en células madre embrionarias.

Nos interrogó con éxito la Unión de todo el genoma de H3K4me3, H3K4me2 y KDM5B en células madre embrionarias usando este ChIP-Seq protocolo6. Células madre embrionarias fueron cultivados en condiciones libres de alimentación (figura 1) y reticulado como se describió anteriormente. Sonicación fue posteriormente realizado como se describe en el paso 3.2 del protocolo ChIP-Seq y evaluada mediante la ejecución de DNA en gel de agarosa al 2...

Aquí, describimos los métodos para realizar ChIP-Seq y mapas de CARIP-Seq, incluyendo preparación de biblioteca para secuenciación de próxima generación, generar global epigenómica y RNA asociada a la cromatina en células madre embrionarias.

CARIP-Seq y ChIP-Seq: métodos para identificar cromatina asociada RNAs y las interacciones DNA proteína en las células madre embrionarias

Embryonic stem (ES) cell self-renewal&#160;and differentiation is governed by extrinsic signals and intrinsic networks of transcription factors, ...

El objetivo general de CARIP-Seq es estudiar los ARN asociados a la cromatina de todo el genoma. El objetivo de ChIP-Seq es evaluar las interacciones proteína-ADN a escala global en células madre embrionarias. Estos métodos pueden ayudar a responder preguntas clave en los campos de la epigenética y las células madre, identificar la ubicación del genoma, los factores de transcripción o la unión al regulador epigenético o la modificación de histonas, la ocupación o los ARN asociados a la cromatina en las células madre embrionarias.La principal ventaja de estas técnicas es que permiten la interrogación imparcial de todo el genoma de los ARN asociados con los constituyentes de la cromatina y la identificación global de las interacciones entre proteínas y ADN. Aunque estos métodos pueden proporcionar información sobre la biología de las células madre embrionarias, también se pueden aplicar a otros tipos de células de mamíferos para estudiar la biología del cáncer u otras enfermedades humanas. Para recolectar las células madre embrionarias, primero lave las células con solución salina tamponada con fosfato.A continuación, separe las células con tripsina al 0,25%, precalentada a 37 grados

carip-seq-chip-seq-methods-to-identify-chromatin-associated-rnas

Research

Investigación

JoVE Journal

Developmental Biology

Biología del Desarrollo

La diferenciación de ESC coincide con los cambios de tipo de células específicas en la estructura y composición de la cromatina. La detección de los cambios proporciona información valiosa sobre los mecanismos que definen stemcellness y la diferenciación celular. Inmunoprecipitación de cromatina (CHIP) representa un método valioso para diseccionar los mecanismos moleculares que subyacen a la diferenciación de células madre.

Inmunoprecipitación de la cromatina de células estaminales embrionarias humanas

Demostramos una inmunoprecipitación de cromatina (CHIP) para identificar las interacciones factor en genes específicos de tejido durante o después de la aparición de tejidos específicos de expresión génica en el tejido embrionario del ratón. Este protocolo debe ser ampliamente aplicable para el estudio de la activación de genes específicos de tejido, como ocurre durante el desarrollo embrionario normal.

Ensayo de inmunoprecipitación de la cromatina de los genes específicos de tejido utilizando etapa temprana de embriones de ratón

Este video muestra los pasos básicos para realizar el análisis del transcriptoma completo en muestras de médula espinal embrionarias de pollo disecadas después de la transfección con electroporación in ovo.

RNA-Seq Análisis de Expresión diferencial de genes en electroporación de embriones de pollo de la médula espinal

La cuestión de cómo los reguladores y los estados de la cromatina cromatina afecta al genoma in vivo es fundamental para nuestra comprensión de cómo los primeros se toman las decisiones del destino celular en el embrión en desarrollo. Chip-Sec-el método más popular para investigar las características de la cromatina en un nivel se describe aquí mundial para los embriones de Xenopus.

Instantánea de todo el genoma de los Reguladores de la cromatina y los Estados en<em&gt; Xenopus</em&gt; Los embriones por chip-Sec

Una regulación de puesta a punto de la transcripción génica subyace en la decisión del destino celular embrionaria. En este documento, se describen ensayos de inmunoprecipitación de la cromatina utilizados para investigar la regulación epigenética de tanto la diferenciación cardiaca de células madre y el desarrollo cardiaco de embriones de ratón.

La regulación epigenética de Cardíaca diferenciación de células madre embrionarias y Tejidos

Describimos la división endógena de la cromatina junto con la secuenciación de alto rendimiento (ChEC-seq), un método ortogonal de inmunoprecipitación de cromatina (ChIP) para cartografiar los sitios de unión a proteínas del genoma con proteínas de fusión de nucleasa micrococcal (MNasa).

Genoma de todo el mapa de las interacciones Proteína-ADN con ChEC-seq in<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

Aquí, describimos una inmunoprecipitación de cromatina (ChIP) y el protocolo de preparación de biblioteca de ChIP-seq para generar perfiles de epigenómica global de muestras embrionarias de pollo baja abundancia.

Cromatina (ChIP) de la inmunoprecipitación protocolo para muestras embrionarias baja abundancia

La determinación precisa de las ubicaciones de unión a proteínas en todo el genoma es importante para entender la regulación genética. Aquí describimos un método de mapeo genómico que trata el ADN inmunoprecipitado con cromatina con digestión exonucleasa (ChIP-exo) seguido de secuenciación de alto rendimiento. Este método detecta interacciones proteína-ADN con resolución cartográfica de par base cercano y alta relación señal-ruido en las neuronas de mamíferos.

Mapeo de alta resolución de interacciones proteína-ADN en neuronas derivadas de células madre del ratón utilizando inmunoprecipitación de cromatina-exonucleasa (ChIP-Exo)

Este protocolo proporciona una canalización computacional optimizada para cuantificar las transcripciones de potenciadores nacientes. Al integrar la accesibilidad de la cromatina, la característica de la cromatina y los datos transcripcionales, permite una detección precisa y un análisis específico de la actividad potenciadora de la hebra en regiones intragénicas complejas, sin dejar de ser accesible para los investigadores sin una amplia formación en bioinformática.

Una canalización computacional para la cuantificación de ARN potenciador intergénico / intragénico en células madre embrionarias de ratón

Aquí presentamos un protocolo para capturar las interacciones ADN-ADN de cromatina asociadas al ARN para mapear la organización del genoma tridimensional relacionada con el ARN.

Método de interacción ADN-ADN con cromatina asociada a ARN

Un método ChIRP basado en UV para identificar interacciones directas entre ARNN y proteína.

Un método de chiIRP basado en UV para la identificación verificable de proteínas que interactúan directamente con el ARNnc: desde células cultivadas hasta testículo de ratón

Aprende ChIP-Seq y CARIP-Seq para mapear epigenomas globales en células madre embrionarias. Estas técnicas identifican interacciones proteína-DNA y RNAs asociados a cromatina con aplicaciones en epigenética.

CARIP-Seq y ChIP-Seq: métodos para identificar cromatina asociada RNAs y las interacciones DNA proteína en las células madre embrionarias (Video) | JoVE Journal

CARIP-Seq y ChIP-Seq: métodos para identificar cromatina asociada RNAs y las interacciones DNA proteína en las células madre embrionarias

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