Del levator Auris Longus Preparación para examen de la transmisión Neuromuscular mamífero bajo condiciones de fijación de voltaje

El objetivo general de este procedimiento es aislar el músculo elevador del auris largo y su nervio con el fin de registrar las corrientes sinápticas en la unión muscular neural. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en fisiología sináptica, como el tamaño de la corriente de la placa terminal, el contenido cuantitativo, la probabilidad de liberación y las relaciones entre la neurotransmisión y la excitabilidad muscular. La principal ventaja de esta técnica es que los registros electrofisiológicos detallados de una sola sinapsis se pueden combinar fácilmente con experimentos ópticos con células vivas.

Aunque este método puede proporcionar información sobre la función sináptica y la comunicación de retroalimentación entre el nervio y el músculo, también se puede aplicar a otros sistemas que van desde la drosophila hasta los mamíferos. Por lo general, las personas nuevas en este método tendrán dificultades porque la preparación del músculo nervioso de los mamíferos es frágil, particularmente el nervio. La adquisición e interpretación cuidadosa de los datos posteriores de la pinza de voltaje también puede ser un desafío.

Una vez dominada, esta técnica se puede realizar en una hora si se realiza correctamente. La demostración del procedimiento estará a cargo de Steve Burke, de mi laboratorio. Para comenzar este procedimiento, bajo un microscopio de disección estereoscópica, haga una pequeña incisión en la piel del dorso del ratón a nivel de las escápulas.

Usa un par de tijeras de microdisección. Corta la piel sobre la cabeza y la espalda. A continuación, tire de la piel hacia arriba a lo largo de la incisión cerca de las escápulas.

Corta los músculos que son inferiores al LAL comenzando por la escápula derecha. Luego, levante suavemente el tejido cortado inmediatamente a la derecha de la línea media. Haz un corte hacia la oreja izquierda con las hojas de las tijeras presionadas contra el cráneo para eliminar varias capas de músculo que son inferiores al LAL izquierdo.

Evite cortar el nervio que inerva el LAL, que se envuelve alrededor del canal auditivo e ingresa a los músculos del lado medial del oído. Continúe cortando a través del canal auditivo manteniendo la mayor cantidad posible del nervio adherido. Luego, corte el tejido graso detrás del canal auditivo a lo largo de la porción ventrolateral de la oreja.

Corte a lo largo de la escápula izquierda de manera similar a los procedimientos que se realizan en el lado derecho para eliminar el músculo por completo del ratón. A continuación, corte el pabellón auricular de la oreja a lo largo de la base dejando la parte cartilaginosa de la oreja unida al LAL. Voltee el músculo para que el lado inferior quede hacia arriba.

Para aislar el músculo LAL, coloque el LAL y el tejido circundante en una placa de Petri con un fondo de elastómero de silicona y fije el tejido diseccionado al fondo. Lave el tejido con frecuencia en una solución salina fisiológica. Luego, coloque un alfiler para insectos a través del canal auditivo para mantener la preparación en su lugar.

Con alfileres más pequeños, sujete el tejido restante en el lado opuesto de la línea media del LAL. Usa un par de fórceps. Tire suavemente de la piel hacia arriba en la parte lateral de la oreja para estirar el músculo y coloque un pequeño alfiler a través de la piel.

Repita este paso hasta que el pañuelo esté bien asegurado al plato. Retire los músculos que cubren el LAL y los que están unidos al LAL a través del tejido conectivo y que están especialmente tensos cerca de la línea media. Posteriormente, tire hacia arriba de la capa muscular suprayacente y corte el tejido conectivo con las cuchillas orientadas hacia la capa muscular que se está tirando.

Corta hacia la línea media hasta aproximadamente 3/4 del camino hasta la línea media y sigue eliminando las capas musculares hasta que solo quede el LAL. Durante el proceso de limpieza, asegúrese de que los nervios no se dañen. A continuación, retire parte del tejido conectivo restante que cubre el LAL para ayudar a empalar los electrodos.

Solo elimine el tejido que se pueda hacer fácilmente sin riesgo de dañar el LAL en el proceso. Para identificar el nervio que inerva el LAL, usando un estimulador nervioso, toque los nervios con el estimulador nervioso. Cuando el músculo se contrae, se ha identificado el nervio correcto.

Luego, agarre con cuidado el tejido cerca del nervio y use unas tijeras de resorte para separar el nervio del tejido que rodea la oreja. Para minimizar el daño, mantenga la mayor parte del nervio incrustado en algún tejido circundante que se utilizará más tarde para asegurar el nervio a la placa de registro. En este punto, el investigador puede tomar un descanso de una hora, siempre y cuando el LAL se bañe en 20 mililitros o más de una solución salina fisiológica.

A continuación, desfije y transfiera el músculo a un inserto de etapa bajo el microscopio de disección para experimentos de electrofisiología. Sujeta el músculo en los extremos y a lo largo de su borde. Coloque el nervio perpendicular a las fibras musculares y sujételo al fondo del plato a través de un exceso de tejido que quedó intacto al final del nervio.

Mantenga el tejido bañado en una solución salina fisiológica en todo momento. Para el experimento de electrofisiología, asegure la cámara de perfusión con el LAL a la etapa del microscopio. Coloque el electrodo de referencia en una taza llena de cloruro de potasio de tres molares que está conectada a la cámara de registro a través de un puente de agar.

En este punto, coloque el electrodo estimulante del nervio en el nervio. Exponga la preparación de LAL a 4-Di-2-Asp durante 10 minutos para lograr una florescencia adecuada para la visualización de la unión neuromuscular. Después de 10 minutos, cambie la solución de 4-Di-2-Asp por la solución de calcio normal.

Mientras tanto, llene los capilares de vidrio con las soluciones adecuadas para los electrodos de detección de voltaje y de paso de corriente. Golpee suavemente el capilar para eliminar las burbujas de aire y asegure el capilar lleno en el soporte de electrodos en la cabecera. Usando un microscopio vertical con iluminación estándar de campo claro y florescencia, busque una banda brillante de uniones neuromusculares de color verde fluorescente que corran perpendiculares a las fibras musculares a lo largo de la preparación con un objetivo de inmersión en agua de bajo aumento.

Luego, cambie a un objetivo de inmersión en agua de mayor aumento para identificar una unión neuromuscular en la capa superior del músculo con el fin de examinarlo con electrofisiología. Utilizando principalmente un campo brillante, coloque el electrodo por encima de la membrana muscular a menos de 100 micras de la unión neuromuscular identificada. Esta figura muestra un ejemplo de los pulsos de corriente y las respuestas de voltaje de una fibra LAL bajo pinza amperimétrica de un mouse R62 de tipo salvaje de 12 semanas de antigüedad.

Los registros se obtuvieron en solución salina fisiológica normal y la presencia de mEPPs indica que estos registros se tomaron de la placa terminal del motor. Aquí hay una grabación representativa de un EPC y dos mEPC obtenidos bajo la condición de pinza de voltaje. Esta figura muestra los EPCs y mEPCs superpuestos de una fibra representativa.

Una vez dominada, esta técnica se puede realizar en una hora si se realiza correctamente. Siguiendo este procedimiento, se pueden realizar otros métodos, como la obtención de imágenes de células vivas con colorantes de membrana como FM143 o la histología, con el fin de responder a preguntas relacionadas con la liberación de vesículas, la captación o los cambios morfológicos. Después de su desarrollo, esta técnica allanó el camino para que los investigadores en el campo de la fisiología exploraran la transmisión sináptica y la comunicación entre células nerviosas en organismos que van desde Drosophila hasta mamíferos.

Después de ver este video, debe tener una buena comprensión de cómo aislar el músculo elevador del auris largo inervado para registrar las corrientes sinápticas en la unión neuromuscular. Al intentar este procedimiento, es importante recordar tener mucho cuidado al eliminar el tejido muscular adjunto al LAL y aislar el nervio.