Name: Del levator Auris Longus Preparación para examen de la transmisión Neuromuscular mamífero bajo condiciones de fijación de voltaje (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-05-05T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 45 s
Description: Aprende a aislar el músculo levator auris longus de ratón para registrar corrientes sinápticas en la unión neuromuscular mediante técnicas de fijación de voltaje. Este método permite estudiar la transmisión nerviosa en condiciones fisiológicas normales y patológicas.

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Agradecemos Dr. Mark M. Rich y Daniel Miranda comentarios editoriales, Ahmad Khedraki para ayudar a establecer esta técnica y la Universidad Estatal de Wright para apoyo financiero (fondos de arranque a A.A.V.).

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</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

Se describe aquí es la preparación y uso del ratón muscular LAL para la medición de la transmisión neuromuscular en condiciones de fijación de corriente o voltaje. Hay varios puntos importantes a considerar para la disección de la LAL. Limpieza excesiva del tejido conectivo de las ayudas de músculo en empalamiento del electrodo, como los electrodos puede conseguir el tejido conectivo al posicionamiento de empalamiento. Sin embargo, sólo quitar el tejido fino conectivo eso se puede quitar fácilmente para limitar las posib...

Estudio de transmisión sináptica en la Unión neuromuscular proporciona penetraciones en la relación dinámica entre los sistemas nervioso y esqueléticos musculares y es un excelente modelo de examen de Fisiología sináptica. El levator auris longus (LAL) es un músculo delgado, que permite las uniones neuromusculares a visualizarse fácilmente. Informes anteriores han descrito la conveniencia de utilizar el LAL para examinar las toxinas y drogas sinápticas y han caracterizado a las características del tipo de fibra del músculo esquelético de la LAL1,2. Numerosos estudios han utilizado el LAL examinar fisiología neuromuscular3,4,5,6,7,8. De electrofisiología, la capacidad de observar fácilmente las ensambladuras neuromusculares LAL permite la colocación exacta de microelectrodos en la placa motora y reduce problemas de abrazadera de espacio en la grabación de la transmisión sináptica. Fácilmente se obtienen grabaciones de abrazadera de la corriente de las propiedades de la membrana muscular, como la constante de tiempo de la membrana (τm) y la resistencia de entrada (Ren). Además, estas propiedades pueden medirse desde las fibras musculares mismo utilizadas para grabar la transmisión neuromuscular, lo que permite una comparación directa de la función sináptica a las propiedades de la membrana muscular. Análisis de estos datos puede proporcionar ideas claves en los mecanismos físicos de muchas enfermedades neuromusculares y Estados de actividad alterada.
Un aspecto clave de la técnica descrita aquí es el uso de pinza de voltaje para grabaciones sinápticas, que no están sujetos a la no-linearidad en la abrazadera de la corriente y son independientes de las propiedades de la membrana muscular. Ventajas de usar la abrazadera de tensión frente a la pinza de corriente para examinar la transmisión neuromuscular se establecieron por el pionero de los esfuerzos en la década de 19509. Debajo de la abrazadera de la corriente, EPPs que superan los 10-15 mV en amplitud no son un producto lineal del mEPP amplitud9. Por ejemplo, si el mEPP promedio es de 1 mV, un EPP de 5 mV puede ser asumido para ser el producto de 5 mEPPs (control de calidad de 5); Considerando que un EPP de 40 mV será el producto de más de 40 mEPPs. Esta no linealidad en EPPs más grandes se produce porque la conducción de la fuerza para el PPE, que es la diferencia entre el potencial de membrana y potencial de equilibrio para el receptor de acetilcolina (~ -10 mV), disminuye substancialmente durante grandes EPPs. Este problema se evita en los experimentos de fijación de voltaje porque el potencial de membrana del músculo no cambia durante los experimentos de fijación de voltaje. Un inconveniente es que experimentos de fijación de voltaje son técnicamente más difíciles de completar que la grabación de la abrazadera de la corriente. Con esto en mente, McLachlan y Martin desarrollaron una corrección matemática sencilla que representa no linealidades en grabaciones de la abrazadera de la corriente de productos ambientalmente preferibles10. Las correcciones funcionan bien11,12,13, pero lo importante es asuman que las propiedades de membrana del músculo no han sido perturbadas.
Las propiedades de membrana del músculo son especialmente importantes para considerar si estudiando las condiciones o Estados de enfermedad que alteran el músculo. Por ejemplo, el músculo esquelético del modelo transgénico R6/2 de la enfermedad de Huntington es hyperexcitable debido a una reducción progresiva en el descanso cloruro y potasio corrientes14,15. Como consecuencia, mEPPs y EPPs se amplifican en el músculo esquelético R6/2. Sin duda, otros factores pueden alterar mEPPs y EPPs. Trabajar con un modelo diferente de ratones de la enfermedad de Huntington (R6/1) encontraron cambios en los productos ambientalmente preferibles que parecen estar relacionada con proteínas SNARE8. Evaluar los mecanismos que causan alteración de la transmisión neuromuscular, sería beneficioso para eliminar los efectos de propiedades de la membrana muscular alterado mediante el uso de una abrazadera de tensión. En un estudio reciente, la transmisión neuromuscular R6/2 se estudió en ambas condiciones de abrazadera de la corriente y la tensión utilizando la técnica descrita en este documento. La totalidad de las placas de extremo motor estaban sujeta a tensión a con menos de 1% de error colocando dos microelectrodos en la constante de longitud de la placa de extremo16. Fue demostrado abrazadera de tensión y corregir registros de corriente abrazadera rindió contrastantes las mediciones de la transmisión neuromuscular en el músculo de R6/2. Esto pone de relieve que puede ser difícil corregir productos ambientalmente preferibles de no linealidad si se han alterado las propiedades de la membrana muscular y demuestra los beneficios de obtener registros de pinza de voltaje que son independientes de las propiedades de la membrana muscular. El protocolo aquí presentado es ideal para examinar las condiciones o Estados de enfermedad que afectan la transmisión sináptica y las propiedades de la membrana postsináptica.

<table><tbody><tr><td>Microscopio compuesto Olympus</td><td>Olympus</td><td>BX51WI</td><td></td></tr><tr><td>10x Objetivo</td><td>Olympus</td><td>UMPLFLN10XW</td><td></td></tr><tr><td>40x Objetivo</td><td>Olympus</td><td>LUMPLFLN40XW</td><td></td></tr><tr><td>Vidrio de borosilicato</td><td>Cámara CCD</td><td>BF150-86-7.5</td><td></td>de Sutter</tr><tr><td></td><td>Instruments Santa Bárbara Instruments Group</td><td>ST-7XMEI</td><td></td></tr><tr><td>Mater-9 Pulse Generador</td><td>AMPI</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Iso-flex Aislador de estímulo</td><td>AMPI</td><td></td><td></td></tr><tr><td>pCLAMP 10 Software de adquisición y análisis de datos</td><td>Dispositivos moleculares</td><td>1-2500-0180</td><td></td></tr><tr><td>Electrodo bipolar concéntrico</td><td>FHC</td><td>CBDSH75</td><td></td></tr><tr><td>Manipulador de rótulas</td><td>Narishige&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Jeringas no metálicas Calibre 34</td><td>World Precision Instruments</td><td>MF34G-5</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio estereoscópico Nikon</td><td></td><td>SMZ800N</td><td></td></tr><tr><td>n.º 5 Pinzas</td><td>Herramientas</td><td></td><td></td>de ciencia</tr><tr><td>fina Tijeras de resorte</td><td>Herramientas de ciencia fina</td><td>15006-09</td><td></td></tr><tr><td>N.º 2 Pinzas</td><td>Roboz</td><td>RS-5Q41</td><td></td></tr><tr><td>Microdisección Tijeras</td><td>Roboz</td><td>RS-5912SC</td><td></td></tr><tr><td>Sylgard 184 Kit de elastómero de silicona</td><td>Dow Corning</td><td>2404019862</td><td></td></tr><tr><td>Crema Depilatoria</td><td>Nair</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Grass SD9 Estimulador</td><td>Grass Medical</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Model P-1000 Extractor de micropipetas</td><td>Sutter Instruments</td><td>P-1000</td><td></td></tr><tr><td>Axon Digidata 1550 Sistema de Acusión de Datos de Bajo Ruido</td><td>Dispositivos</td><td></td><td></td>moleculares</tr><tr><td>Filtro Bessell de paso bajo</td><td>Warner Instrument Corp.</td><td>LPF-8</td><td></td></tr><tr><td>Micromanipulador para zurdos</td><td>Siskiyou Corp.</td><td>MX1641/45DL</td><td></td></tr><tr><td>Micromanipulador para diestros</td><td>Siskiyou Corp.</td><td>MX1641/45DR</td><td></td></tr><tr><td>Controlador de movimiento único</td><td>Siskiyou Corp.</td>Micromanipulador de rodillos cruzados <td>MC100e</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Siskiyou Corp.</td><td>MX1641R</td><td>Esto se agregó al eje Z de los micromanipuladores para zurdos y diestros para permitir que el eje z sea motorizado. Esta configuración personalizada es más barata y menos voluminosa que comprar un micromanipulador motorizado de 4 ejes. También nos permite controlar ambos micromanipuladores con un controlador</td></tr><tr><td>Todos los productos químicos fueron ordenados por Fisher, excepto,</td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>BTS</td><td>Toronto Research Chemicals</td><td>B315190</td><td></td></tr><tr><td>CTX</td><td>Alomone Labs</td><td>C-270</td><td></td></tr><tr><td>4-Di-2-Asp</td><td>Molecular Probes</td><td></td><td>Molecular probes ya no es una empresa. Ahora pedido a través de Fisher</td></tr></tbody></table>

del levator auris longus preparación para examen de la transmisión neuromuscular mamífero bajo condiciones de fijación de voltaje

Levator Auris Longus Preparation for Examination of Mammalian Neuromuscular Transmission Under Voltage Clamp Conditions

Este protocolo describe una técnica para grabar transmisión sináptica de la placa neuromuscular bajo condiciones de corriente abrazadera y pinza de voltaje. Una preparación ex vivo del levator auris longus (LAL) se utiliza porque es un músculo delgado que proporciona una visualización fácil de la placa neuromuscular para empalamiento de microelectrodos en la placa motora. Este método permite la grabación de potenciales de placa miniatura espontáneos y corrientes (mEPPs y mEPCs), potenciales evocados del nervio tapa y corrientes (productos ambientalmente preferibles y EPC), así como las propiedades de la membrana de la placa motora. Resultados obtenidos de este método incluyen el contenido cuántico (QC), número de sitios de lanzamiento de vesícula (n), la probabilidad de liberación de la vesícula (prel), facilitación sináptica y depresión, así como la constante de tiempo de la membrana muscular (τ m) y la resistencia de entrada. Aplicación de esta técnica en modelos de ratón de la enfermedad humana puede destacar patologías fundamentales en Estados de enfermedad y ayudar a identificar estrategias de tratamiento novedosas. Por voltaje-sujeción totalmente una sola sinapsis, este método proporciona uno de los más detallados análisis de la transmisión sináptica actualmente disponible.

La figura 8 muestra un ejemplo de los pulsos corriente (figura 8A) y las respuestas de tensión (figura 8B) de una fibra LAL debajo de la abrazadera de la corriente de un tipo de salvaje de 12 semanas de edad ratón R6/2. La presencia de mEPPs indica que estos registros fueron tomados de la placa motora. Los registros se obtuvieron en solución salina fisiológica normal. Estos registros de abrazadera de...

El protocolo descrito en este artículo utiliza el músculo levator auris longus (LAL) de ratón para grabar espontánea y nervio postsynaptic potenciales evocados (abrazadera de la corriente) y corrientes (abrazadera de tensión) en la Unión neuromuscular. Uso de esta técnica puede proporcionar ideas claves en los mecanismos de transmisión sináptica en condiciones normales y la enfermedad.

Del levator Auris Longus Preparación para examen de la transmisión Neuromuscular mamífero bajo condiciones de fijación de voltaje

This protocol describes a technique to record synaptic transmission from the neuromuscular junction under current-clamp and voltage-clamp conditions. An ...

El objetivo general de este procedimiento es aislar el músculo elevador del auris largo y su nervio con el fin de registrar las corrientes sinápticas en la unión muscular neural. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en fisiología sináptica, como el tamaño de la corriente de la placa terminal, el contenido cuantitativo, la probabilidad de liberación y las relaciones entre la neurotransmisión y la excitabilidad muscular. La principal ventaja de esta técnica es que los registros electrofisiológicos detallados de una sola sinapsis se pueden combinar fácilmente con experimentos ópticos con células vivas.Aunque este método puede proporcionar información sobre la función sináptica y la comunicación de retroalimentación entre el nervio y el músculo, también se puede aplicar a otros sistemas que van desde la drosophila hasta los mamíferos. Por lo general, las personas nuevas en este método tendrán dificultades porque la preparación del músculo nervioso de los mamíferos es frágil, particularmente el nervio. La adquisición e interpretación cuidadosa de los datos posteriores de la pinza de voltaje también puede ser un desafío.Una vez dominada, esta técnica se puede realizar en una hora si se realiza correctamente. La demostración del procedimiento estará a cargo de Steve Burke, de mi laboratorio. Para comenzar este procedimiento, bajo un microscopio de disección estereoscópica, haga una pequeña incisión en la piel del dorso del ratón a nivel de las escápulas.Usa un par de tijeras de microdisección. Corta la piel sobre la cabeza y la espalda. A continuación, tire de la piel hacia arriba a lo largo de la incisión cerca de las escápulas.Corta los músculos que son inferiores al LAL comenzando por la escápula derecha. Luego, levante suavemente el tejido cortado inmediatamente a la derecha de la línea media. Haz un corte hacia la oreja izquierda con las hojas de las tijeras presionadas contra el cráneo para eliminar varias capas de músculo que son inferiores al LAL izquierdo.Evite cortar el nervio que inerva el LAL, que se envuelve alrededor del canal auditivo e ingresa a los músculos del lado medial del oído. Continúe cortando a través del canal auditivo manteniendo la mayor cantidad posible del nervio adherido. Luego, corte el tejido graso detrás del canal auditivo a lo largo de la porción ventrolateral de la oreja.Corte a lo largo de la escápula izquierda de manera similar a los procedimientos que se realizan en el lado derecho para eliminar el músculo por completo del ratón. A continuación, corte el pabellón auricular de la oreja a lo largo de la base dejando la parte cartilaginosa de la oreja unida al LAL. Voltee el músculo para que el lado inferior quede hacia arriba.Para aislar el músculo LAL, coloque el LAL y el tejido circundante en una placa de Petri con un fondo de elastómero de silicona y fije el tejido diseccionado al fondo. Lave el tejido con frecuencia en una solución salina fisiológica. Luego, coloque un alfiler para insectos a través del canal auditivo para mantener la preparación en su lugar.Con alfileres más pequeños, sujete el tejido restante en el lado opuesto de la línea media del LAL. Usa un par de fórceps. Tire suavemente de la piel hacia arriba en la parte lateral de la oreja para estirar el músculo y coloque un pequeño alfiler a través de la piel.Repita este paso hasta que el pañuelo esté bien asegurado al plato. Retire los músculos que cubren el LAL y los que están unidos al LAL a través del tejido conectivo y que están especialmente tensos cerca de la línea media. Posteriormente, tire hacia arriba de la capa muscular suprayacente y corte el tejido conectivo con las cuchillas orientadas hacia la capa muscular que se está tirando.Corta hacia la línea media hasta aproximadamente 3/4 del camino hasta la línea media y sigue eliminando las capas musculares hasta que solo quede el LAL. Durante el proceso de limpieza, asegúrese de que los nervios no se dañen. A continuación, retire parte del tejido conectivo restante que cubre el LAL para ayudar a empalar los electrodos.Solo elimine el tejido que se pueda hacer fácilmente sin riesgo de dañar el LAL en el proceso. Para identificar el nervio que inerva el LAL, usando un estimulador nervioso, toque los nervios con el estimulador nervioso. Cuando el músculo se contrae, se ha identificado el nervio correcto.Luego, agarre con cuidado el tejido cerca del nervio y use unas tijeras de resorte para separar el nervio del tejido que rodea la oreja. Para minimizar el daño, mantenga la mayor parte del nervio incrustado en algún tejido circundante que se utilizará más tarde para asegurar el nervio a la placa de registro. En este punto, el investigador puede tomar un descanso de una hora, siempre y cuando el LAL se bañe en 20 mililitros o más de una solución salina fisiológica.A continuación, desfije y transfiera el músculo a un inserto de etapa bajo el microscopio de disección para experimentos de electrofisiología. Sujeta el músculo en los extremos y a lo largo de su borde. Coloque el nervio perpendicular a las fibras musculares y sujételo al fondo del plato a través de un exceso de tejido que quedó intacto al final del nervio.Mantenga el tejido bañado en una solución salina fisiológica en todo momento. Para el experimento de electrofisiología, asegure la cámara de perfusión con el LAL a la etapa del microscopio. Coloque el electrodo de referencia en una taza llena de cloruro de potasio de tres molares que está conectada a la cámara de registro a través de un puente de agar.En este punto, coloque el electrodo estimulante del nervio en el nervio. Exponga la preparación de LAL a 4-Di-2-Asp durante 10 minutos para lograr una florescencia adecuada para la visualización de la unión neuromuscular. Después de 10 minutos, cambie la solución de 4-Di-2-Asp por la solución de calcio normal.Mientras tanto, llene los capilares de vidrio con las soluciones adecuadas para los electrodos de detección de voltaje y de paso de corriente. Golpee suavemente el capilar para eliminar las burbujas de aire y asegure el capilar lleno en el soporte de electrodos en la cabecera. Usando un microscopio vertical con iluminación estándar de campo claro y florescencia, busque una banda brillante de uniones neuromusculares de color verde fluorescente que corran perpendiculares a las fibras musculares a lo largo de la preparación con un objetivo de inmersión en agua de bajo aumento.Luego, cambie a un objetivo de inmersión en agua de mayor aumento para identificar una unión neuromuscular en la capa superior del músculo con el fin de examinarlo con electrofisiología. Utilizando principalmente un campo brillante, coloque el electrodo por encima de la membrana muscular a menos de 100 micras de la unión neuromuscular identificada. Esta figura muestra un ejemplo de los pulsos de corriente y las respuestas de voltaje de una fibra LAL bajo pinza amperimétrica de un mouse R62 de tipo salvaje de 12 semanas de antigüedad.Los registros se obtuvieron en solución salina fisiológica normal y la presencia de mEPPs indica que estos registros se tomaron de la placa terminal del motor. Aquí hay una grabación representativa de un EPC y dos mEPC obtenidos bajo la condición de pinza de voltaje. Esta figura muestra los EPCs y mEPCs superpuestos de una fibra representativa.Una vez dominada, esta técnica se puede realizar en una hora si se realiza correctamente. Siguiendo este procedimiento, se pueden realizar otros métodos, como la obtención de imágenes de células vivas con colorantes de membrana como FM143 o la histología, con el fin de responder a preguntas relacionadas con la liberación de vesículas, la captación o los cambios morfológicos. Después de su desarrollo, esta técnica allanó el camino para que los investigadores en el campo de la fisiología exploraran la transmisión sináptica y la comunicación entre células nerviosas en organismos que van desde Drosophila hasta mamíferos.Después de ver este video, debe tener una buena comprensión de cómo aislar el músculo elevador del auris largo inervado para registrar las corrientes sinápticas en la unión neuromuscular. Al intentar este procedimiento, es importante recordar tener mucho cuidado al eliminar el tejido muscular adjunto al LAL y aislar el nervio.

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Investigación

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Neurociencia

A continuación se describen los métodos electrofisiológicos para la medición de la transmisión sináptica en la unión neuromuscular de larvas de Drosophila. Liberación evocada se inicia artificialmente mediante la estimulación de los axones de la neurona motora, y la transmisión a través de la UNM se puede medir por la respuesta postsináptica evocado en el músculo.

Los métodos electrofisiológicos para la grabación de los potenciales sinápticos de la UNM de larvas de Drosophila

Aplicación de la electrofisiología de las sinapsis accesibles proporciona una medida cuantificable de la actividad sináptica, útil en el análisis de mutantes sinápticos. Este artículo describe un método de disección utilizado para exponer la uniones neuromusculares (UNM)...

Disección y de grabación de la unión neuromuscular C. Elegans

Registro electrofisiológico en el Drosophila Embrión

El abridor de los músculos de la pierna cangrejos de río se presenta por su importancia histórica y la versatilidad experimental en el fenotipo muscular, la fisiología sináptica y la plasticidad.

Ver histórico y demostración de Fisiología en la UNM de los músculos inaugural cangrejo de río

Se describen los procedimientos para la administración repetida de los inhibidores de la señalización de receptores muscarínicos a la largo del músculo elevador del auris (LAL) del músculo de los ratones adultos jóvenes y de inmunotinción posterior de sus uniones neuromusculares (NMJs) en wholemounts. El músculo LAL tiene ventajas únicas para...

La administración subcutánea de antagonistas muscarínicos y Triple-inmunotinción del músculo largo del elevador del Auris en ratones

Este nuevo método permite la grabación simultánea intracelular de una motoneuron adulto solo ratón y la medición de la fuerza producida por sus fibras musculares. La investigación combinada de las propiedades eléctricas y mecánicas de las unidades motoras en los animales normales y genéticamente modificadas es un gran avance para el estudio del sistema neuromuscular.

Grabación simultánea intracelular de una motoneurona lumbar y la Fuerza producida por su unidad motora en el ratón adulto<em&gt; En vivo</em

Una evaluación funcional de la placa neuromuscular (NMJ) puede proporcionar información esencial sobre la comunicación entre el músculo y del nervio. Aquí se describe un protocolo para evaluar exhaustivamente el NMJ y músculo funcionalidad utilizando dos preparaciones diferentes músculo-nerviosa, es decir, sóleo-ciático y frénico-diafragma.

Medir la funcionalidad de la placa neuromuscular

La excitabilidad axonal técnicas proporcionan una poderosa herramienta para analizar la fisiopatología y los cambios biofísicos que preceden acontecimientos degenerativos irreversibles. Este manuscrito muestra el uso de estas técnicas en el nervio cubital de ratas anestesiados.

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El protocolo describe el método de carga de un tinte de calcio fluorescente a través del nervio cortado en las terminales nerviosas motoras del ratón. Además, se presenta un método único para registrar transitorios rápidos de calcio en las terminaciones nerviosas periféricas mediante microscopía confocal.

Registro de transitorios de calcio en unión neuromuscular de ratón con alta resolución temporal mediante microscopía confocal

Aquí, presentamos un protocolo que combina la electroporación in vivo y la denervación del músculo elevador del auris largo craneal (LAL). Este procedimiento permite estudiar el papel potencial de las proteínas derivadas del músculo en la regeneración de la sinapsis neuromuscular.

Electroporación in vivo combinada y reinervación a corto plazo del músculo esquelético elevador del auris largo craneal

La electrofisiología de pinza dinámica puede establecer vínculos causales entre los déficits de activación neuronal y la disfunción del canal iónico. Describimos los métodos y protocolos de pinzamiento dinámico en neuronas de Purkinje cerebelosas de ratón, señalando recursos útiles y consideraciones técnicas. En un estudio representativo, agregamos conductancia de sodio modelada a las neuronas de Purkinje Tsc1-/- para rescatar disparos repetitivos.

Métodos de pinza dinámica para investigar la alteración de la excitabilidad neuronal asociada con el autismo

Aprende a aislar el músculo levator auris longus de ratón para registrar corrientes sinápticas en la unión neuromuscular mediante técnicas de fijación de voltaje. Este método permite estudiar la transmisión nerviosa en condiciones fisiológicas normales y patológicas.

Del levator Auris Longus Preparación para examen de la transmisión Neuromuscular mamífero bajo condiciones de fijación de voltaje (Video) | JoVE Journal

Del levator Auris Longus Preparación para examen de la transmisión Neuromuscular mamífero bajo condiciones de fijación de voltaje

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