Name: Ablación de una población Neuronal utilizando un láser de dos fotones y su evaluación mediante grabación comportamiento y proyección de imagen de calcio en las larvas de pez cebra (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-06-02T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 29 s
Description: Aprende a ablar neuronas pretectales específicas en larvas de pez cebra utilizando un láser de dos fotones. Este método permite evaluar la actividad del circuito neuronal y el comportamiento de captura de presas mediante imagen de calcio.

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Estos estudios fueron financiados por subvenciones recibidas del MEXT, JSP KAKENHI Grant números JP25290009, JP25650120, JP17K07494 y JP17H05984.

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Los autores no tienen conflictos de interés al informe.

Aunque el régimen de dos fotones láser tiene una excelente resolución espacial a ablar específicamente las neuronas individuales, gran debe tener precaución para evitar daños no deseados en el tejido cerebral debido a la calor. El paso más importante en el experimento de ablación es determinar la cantidad óptima de la irradiación del laser. Insuficiente irradiación no mata a las neuronas. Demasiada irradiación será daño por calor el tejido circundante, que darán lugar a efectos no deseados. El rango óptimo de irradiación...

Para entender cómo el comportamiento surge de la actividad neuronal en el cerebro, es necesario identificar los circuitos neuronales que intervienen en la generación de ese comportamiento. En la etapa larval, el pez cebra proporciona un modelo animal ideal para estudiar la función cerebral asociado con el comportamiento porque sus cerebros pequeños, transparentes permiten investigar la actividad neuronal en una resolución de celular en una zona amplia de la cerebro mientras observa el comportamiento1. Proyección de imagen de la actividad neuronal en las neuronas específicas ha sido posible a través de la invención de indicadores genético codificados calcio (Ca) (GECIs) como GCaMP2. Pez cebra transgénico GCaMP han demostrado para ser útiles para asociar el circuito neuronal funcional con un comportamiento mediante la realización de proyección de imagen de Ca en comportamiento de animales3.
Mientras que la proyección de imagen de Ca puede demostrar las correlaciones entre la actividad neuronal y el comportamiento, para demostrar causalidad, supresión de la actividad neuronal y su consequence(s) sobre el comportamiento de la prueba son pasos importantes. Hay varias maneras de lograrlo: uso de la mutación genética que altera circuitos neurales específicos4, expresión de neurotoxinas en neuronas específicas5,6, uso de herramientas optogenetic como halorodopsina7, y laser de ablación de las neuronas específicas8,9. Ablación láser es especialmente adecuada para la eliminación de la actividad en un número relativamente pequeño de neuronas específicas. Eliminación irreversible de la actividad neuronal matando neuronas facilita la evaluación de consecuencias conductuales.
Un comportamiento interesante que se puede observar en la etapa larval en el pez cebra es la captura de presas (figura 1A). Este comportamiento guiado visualmente, intencionadas ofrece un favorable sistema experimental para el estudio de la agudeza visual10, transformación visuomotor11,12,13, percepción visual y reconocimiento de objetos14,15,16,17,18y19de la toma de decisiones. Cómo presa es reconocida por depredadores y cómo detección de presa lleva a la presa catching comportamiento ha sido una cuestión central en Neuroetología20. En este artículo, nos centramos en el papel del circuito hipotalámico pretecto formado por proyecciones de un núcleo en el pretectum (núcleo pretectalis superficialis equipara magnocellularis, en adelante, simplemente observado como el pretectum) al ILH. Ablación del laser del pretectum fue demostrada para reducir la actividad de captura de presas y suprimen la actividad neuronal en el ILH asociado a la percepción visual de la presa del21. Aquí, los protocolos para la realización de láser ablación y probar su efecto en Ca2 + la proyección de imagen y grabación de comportamiento describen a las larvas de pez cebra.

<table><tbody><tr><td>NuSieve GTG Agarosa</td><td>Lonza</td><td>Cat.#50080</td><td>agarosa de baja temperatura de fusión</td></tr><tr><td>6 cm placa de Petri</td><td>FALCON</td><td>Producto#:351007</td><td></td></tr><tr><td>aguja de disección</td><td>AS ONE Corporation</td><td>Cat. Nº 2-013-01</td><td>https://keystone-lab.com/en/item/detail/404142</td></tr><tr><td>LSM7MP</td><td>Carl Zeiss</td><td></td><td>microscopio de barrido láser de dos fotones</td></tr><tr><td>W Plan-Apochromat 63x/1.0</td><td>Carl Zeiss</td><td></td><td>63X</td></tr><tr><td>objetivo lente Imager.Z1</td><td>Carl Zeiss</td><td></td><td>un microscopio de epifluorescencia</td></tr><tr><td>ZEN</td><td>Carl Zeiss Software de adquisición de</td><td></td><td>imágenes para microscopios confocales</td></tr> Junta <tr><td>de cámara de hibridación Secure-Seal, 8 cámaras, 9 mm de diámetro x 0,8 mm de profundidad</td><td>Catálogo de Sondas</td><td>Moleculares # S-24732</td><td>Utilizado como cámara de registro en cámaras de imagen de Ca</td></tr><tr>Cámaras<td>de imagen Grace</td><td>Bio-Labs</td><td>CoverWell PCI-A-2.5</td><td>Utilizado como cámara de registro de comportamiento</td></tr><tr><td>bisturí quirúrgico</td><td>MANI</td><td>Cuchillo oftálmico MST15</td><td></td></tr><tr><td>ORCA-Flash4.0</td><td>Modelo de Hamamatsu Photonics</td><td>:C11440-22CU</td><td>una cámara CMOS científica</td></tr><tr><td>HCImage</td><td>Hamamatsu Photonics</td><td></td><td>software de acusión de imágenes</td></tr><tr><td>Módulo de grabación de disco duro</td><td>Hamamatsu Photonics</td><td>Un módulo de software que permite guardar los archivos de película en una unidad de disco duro en poco tiempo</td>SZX7 Olympus estereoscopio DF PL 0.5X Olympus <td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td>lente de objetivo para SZX7</td></tr><tr><td>Point Grey Grasshopper3 4.1 MP Mono USB3 Visio</td><td>FLIR Systems, Inc.</td><td>N.º de producto GS3-U3-41C6NIR-C</td><td>CMOS cámara</td></tr><tr><td>XIMEA xiQ cámara</td><td>XIMEA</td><td>N.º de producto Cámara</td><td>CMOS</td>MQ042RG-CM</tr><tr><td>un anillo de luz LED</td><td>CCS</td><td>Modelo: LDR2-100SW2-LA</td><td>LED</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr> blanco <tr><td>Malla de nailon 32&micro; m</td><td>Tokyo Screen</td><td>N-No.380T</td><td>http://www.tokyo-screen.com/cms/sta20347/</td></tr> <tr><td>Malla de nylon 13&micro; m</td><td>Pantalla de Tokio</td><td>N-No. 508T-K</td><td>http://www.tokyo-screen.com/cms/sta20347/</td></tr> <tr><td>Pantalla de metal con apertura de 150 micras</td><td>Pantalla</td><td></td> de <td>http://www.tokyo-screen.com/cms/sta20341/#ami</td></tr><tr><td>de metal con apertura de 75 micras</td><td>Pantalla</td><td></td> de <td>http://www.tokyo-screen.com/cms/sta20341/#ami</td></tr><tr><td>EBIOS</td><td>Asahi Food & Cuidado de la salud, Co. Ltd.</td><td></td><td>levadura de cerveza seca</td></tr><tr><td>LabVIEW</td><td>National Instruments</td><td></td>, <td>un entorno de desarrollo integrado para la programación</td></tr><tr><td>de Mai-Tai HP</td><td>Spectra Physics&nbsp;</td><td></td><td>láser de dos fotones&nbsp;</td></tr></tbody></table>

ablación de una población neuronal utilizando un láser de dos fotones y su evaluación mediante grabación comportamiento y proyección de imagen de calcio en las larvas de pez cebra

Ablation of a Neuronal Population Using a Two-photon Laser and Its Assessment Using Calcium Imaging and Behavioral Recording in Zebrafish Larvae

Para identificar el papel de una subpoblación de neuronas en el comportamiento, es esencial para poner a prueba las consecuencias de bloquear su actividad en animales vivos. Ablación láser de las neuronas es un método eficaz para este propósito cuando las neuronas son selectivamente marcadas con sondas fluorescentes. En el presente estudio, se describen los protocolos para láser ablación una subpoblación de neuronas utilizando un microscopio de dos fotones y la prueba de sus consecuencias funcionales y conductuales. En este estudio, el comportamiento de captura de presas en las larvas de pez cebra se utiliza como un modelo de estudio. El circuito hipotalámico pretecto se conoce para ser la base de esta presa visualmente impulsado por captura de comportamiento. Pez cebra pretectum fue quitado por ablación láser, y la actividad neuronal en el lóbulo inferior del hipotálamo (ILH; el objetivo de la proyección pretectal) fue examinada. Comportamiento de captura de presas después de la ablación pretectal también fue probado.

Neuronas específicas fueron etiquetadas genéticamente con EGFP o GCaMP6s, cuya expresión fueron conducidos en líneas de Gal4. Un gSAIzGFFM119B de la línea de Gal4 fue utilizada para etiquetar un núcleo en el área pretectal (núcleo pretectal superficial magnocelulares) y una subpoblación de neuronas del bulbo olfatorio. Otra línea de Gal4, hspGFFDMC76A, fue utilizado para etiquetar el ILH. Laser-ablación las neuronas pretectal bilateral (panel de la izquierdafigura 2</...

Aquí, presentamos un protocolo para ablación de una subpoblación genéticamente marcada de neuronas por un láser de dos fotones de larvas de pez cebra.

Ablación de una población Neuronal utilizando un láser de dos fotones y su evaluación mediante grabación comportamiento y proyección de imagen de calcio en las larvas de pez cebra

To identify the role of a subpopulation of neurons in behavior, it is essential to test the consequences of blocking its activity in living animals. Laser ...

El objetivo general de este experimento es probar el efecto de la ablación con láser de ciertas neuronas en la actividad y el comportamiento de los circuitos. Con esta técnica experimental podemos examinar la necesidad de neuronas en un circuito subyacente al comportamiento. Este método puede ayudar a responder nuestras preguntas clave en el campo del comportamiento y la neurociencia, como cómo se percibe la presa y cómo se genera el comportamiento capturado por la actividad neuronal.La principal ventaja de esta técnica es que las neuronas pueden ser ablacionadas específicamente debido al marcaje genético de estas neuronas y también a la alta resolución espacial del láser. Después de criar larvas y montarlas en agarosa de bajo punto de fusión al 2% de acuerdo con el protocolo de texto, coloque las larvas incrustadas en agarosa bajo un microscopio de escaneo láser de dos fotones y comience el sistema de microscopía. Abra el software de adquisición de imágenes y, en la pestaña láser, haga clic en el botón de encendido para encender el láser.Espere a que el estado del láser cambie de ocupado a modo bloqueado. En la pestaña de canales, establezca la longitud de onda del láser en 880 nanómetros para la ablación con EGFP o 800 nanómetros para la ablación con GCaMP. Seleccione la lente subjetiva 20X moviendo manualmente el revólver de la lente.A continuación, haga clic en la pestaña Localizar, haga clic en GFP para cambiar las vías ópticas y ver directamente la fluorescencia a ojo. Centre el cerebro de la larva de pez cebra en el campo de visión, luego haga clic en la pestaña de adquisición para volver a la microscopía de dos fotones y establecer la potencia y la ganancia del láser. Como registro de la condición anterior a la ablación, haga clic en Pila Z para seleccionar la opción Pila Z.Luego, después de enfocarse en el extremo ventral del cerebro de la larva, haga clic en el botón establecer primero para establecer el límite inferior y después de concentrarse en la superficie más dorsal del cerebro, haga clic en el último botón establecer para establecer el límite superior. Por último, haga clic en el botón Iniciar experimento para ejecutar la adquisición de imágenes de la pila Z. A continuación, seleccione la lente subjetiva 63X moviendo manualmente el revólver de la lente.A continuación, haga clic en la pestaña localizar para cambiar a la microscopía de epifluorescencia. Centre las células que se van a ablacionar a ojo y, a continuación, haga clic en la pestaña de adquisición para volver a la microscopía de barrido láser. En la pestaña Modo de adquisición, establezca el tamaño de fotograma en 256 por 256.Haz clic en vivo y observa las neuronas de interés. Luego, comenzando desde el lado más dorsal, encuentre un plano focal en el que las células a ablacionar estén enfocadas. Usando la función de regiones, marque una pequeña área circular de aproximadamente 1/3 del tamaño de la célula en diámetro en cada neurona como un ROI.Establezca la velocidad de escaneo en 13,9 segundos por 256 por 256 píxeles, lo que corresponde a un tiempo de permanencia del láser de aproximadamente 200 microsegundos por píxel o 200 microsegundos por media micra. Además, establezca el ciclo de iteración en cuatro repeticiones. Haga clic en iniciar experimento para ejecutar las funciones de serie temporal y blanqueo.Compare la imagen antes de la ablación con la imagen después de la ablación en el ciclo de series temporales para asegurarse de que la fluorescencia de las células objetivo ha desaparecido. A continuación, mueva el plano focal un poco más profundo y elija el siguiente plano focal donde aparecen las celdas no abladas. Lleve a cabo la función de blanqueo como se acaba de demostrar y repita el proceso hasta que todas las células de la estructura neuronal de interés hayan sido ablacionadas.Después de la ablación, compruebe si las células han abolido la fluorescencia y repita la irradiación láser si es necesario. Después de la irradiación, es necesario recuperar las larvas. Con cuidado, haga pequeños cortes perpendiculares en la agarosa alrededor de las larvas.Luego, espere a que el pez salga nadando de la agarosa por sí solo cuando desaparezca el efecto de la anestesia. Después de cultivar paramecia y anestesiar una larva de pez cebra de acuerdo con el protocolo de texto, coloque las larvas en agarosa al 2% de punto de fusión bajo e inmediatamente elimine cualquier exceso de agarosa para que la superficie de la agarosa se vea ligeramente convexa. Con una aguja de disección, oriente rápidamente las larvas en posición vertical.Luego, con un cuchillo quirúrgico, haga algunos cortes pequeños en la agarosa para eliminar la agarosa alrededor de la cabeza del pez cebra, lo que deja espacio para que nade el paramecio. Retire con cuidado la agarosa residual vertiendo suavemente el agua del sistema en la cámara. A continuación, coloque un paramecio en la cámara de grabación para que sirva como estímulo visual.A continuación, coloque la cámara de grabación bajo un microscopio de epifluorescencia equipado con una cámara CMOS científica y seleccione un objetivo de 2,5X. Inicie la aplicación de adquisición de imágenes para la cámara equipada. Haga clic en Panel de secuencia y seleccione Registro de disco duro en el panel.En la sección de configuración de escaneo, establezca el recuento de fotogramas en 900 o cualquier otro número total de fotogramas que desee. En el panel de captura, establezca el tiempo de exposición en 30 milisegundos y el agrupamiento en dos por dos. Haga clic en vivo en el panel de captura para ubicar las larvas en la vista de la cámara y el enfoque y, a continuación, haga clic en Detener en vivo y haga clic en el botón Inicio.Guarde la película en formato cxd y analice los datos de acuerdo con el protocolo de texto. Después de configurar el sistema de registro de comportamiento y colocar una larva en una cámara de registro de acuerdo con el protocolo de texto, use una micropipeta para recolectar 50 paramecas y colocarlas en la cámara de registro. Para colocar un cubreobjetos en la parte superior de la cámara de grabación, ponga una pequeña gota de agua sobre el cubreobjetos antes de colocarlo sobre la superficie del agua de la cámara de grabación, para evitar introducir aire en la cámara.Coloque la cámara de grabación en el sistema de iluminación. A continuación, inicie la grabación de lapso de tiempo a 10 fotogramas por segundo durante 11 minutos. Por último, realizar el análisis según el protocolo de texto.En este experimento con la línea Gal4 que marca núcleos en el área pretectal y una subpoblación de neuronas del bulbo olfatorio. Las neuronas pretectales fueron ablacionadas bilateralmente con láser. Las neuronas olfativas fueron ablacionadas como control.Los resultados muestran que el láser de dos fotones puede extirpar las células objetivo sin afectar a las neuritas adyacentes. En este experimento se investigó la conectividad funcional de las neuronas pretectales que proyectan sus axones hacia la ILH ipsilateralmente. Tanto el pretectum como el ILH mostraron actividad neuronal en presencia proximal de la presa, lo que sugiere que ambas actividades neuronales son impulsadas visualmente.También se utilizaron imágenes de calcio para observar la actividad neuronal en el pretectum y la ILH en las larvas ablacionadas con neuronas pretectales. El pretectum izquierdo que fue ablacionado con láser mostró actividad neuronal residual o nula. Además, la ILH ipsilateral mostró una actividad neuronal drásticamente desplazada, lo que sugiere que la mayor entrada a la ILH proviene del pretectum ipsilateral.Por el contrario, la ILH en el otro lado del pretectum ablacionado con láser mostró una actividad neuronal comparable a la actividad neuronal en el pretectum ipsilateral, lo que sugiere que la ILH derecha está recibiendo entradas del pretectum derecho. Una vez dominado, la ablación láser se puede realizar en aproximadamente una hora para cada larva de pez cebra. Al intentar este procedimiento, es importante recordar que solo se deben extirpar las neuronas objetivo con la irradiación láser adecuada, evitando el daño por calor del láser.Siguiendo este procedimiento, se puede realizar la ablación de neuronas en otras áreas del cerebro como el prosencéfalo o el cerebro posterior para responder preguntas adicionales como cómo estas neuronas están involucradas en las funciones cognitivas o motoras. Después de su desarrollo, esta técnica allanó el camino para que los investigadores en el campo de la neurociencia del comportamiento exploraran los circuitos neuronales funcionales en modelos de peces cebra. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo extirpar específicamente las neuronas con láser en el cerebro de las larvas de pez cebra y evaluar las consecuencias funcionales y conductuales.No olvide que trabajar con un láser puede ser extremadamente peligroso y siempre cumpla con las instrucciones del fabricante mientras realiza este procedimiento.

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Aquí se describe un método para el montaje de embriones de pez cebra a largo plazo de imágenes, de dos fotones de imágenes y técnicas de daño a los tejidos, y de lapso de tiempo de imagen confocal.

De dos fotones axotomía y de lapso de tiempo de imagen confocal en embriones de pez cebra en vivo

Este video describe el ensayo de captura de presas. El video discute el método para estudiar el comportamiento de captura de presas de las larvas de pez cebra después de la ablación con láser de neuronas específicas.

Ensayo de captura de presas: un método para estudiar el comportamiento de captura de presas de la larva de pez cebra

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Axotomía láser de dos fotones: un método para dañar los axones en embriones de pez cebra y observar la recuperación axonal

Este video demuestra el método para estudiar la detección visual de presas en larvas de pez cebra transgénicas utilizando imágenes fluorescentes basadas en indicadores de calcio con sus neuronas expresando complejos indicadores de calcio fluorescentes.

Análisis de la actividad neuronal evocada por presas en una larva de pez cebra transgénica

Source: Morsch, M.,  et. al., desencadenando el estrés y la muerte celular utilizando microscopía confocal convencional con láser UV. J. Vis. Exp. (2017) En este video, exploramos la técnica de ablación con láser UV de alta intensidad para apuntar y estudiar con precisión las neuronas individuales en el pez cebra transgénico. Demostramos cómo preparar, inmovilizar y visualizar las respuestas neuronales, destacando la dinámica celular de la lesión y la recuperación.

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Fuente: Muto, A., et al. Ablación de una población neuronal mediante láser de dos fotones y su evaluación mediante imágenes de calcio y registro de comportamiento en larvas de pez cebra. J. Vis. Exp. (2018) En este video,  Se demuestra un procedimiento de ablación con láser de dos fotones, que permite la destrucción selectiva de neuronas fluorescentes en larvas de pez cebra inmovilizadas con agarosa. Las imágenes de alta resolución antes y después del procedimiento confirman un daño neuronal...

Ablación neuronal dirigida mediante microscopía de dos fotones en un pez cebra Larava

Aunque el sistema nervioso periférico (SNP) es capaz de reparación después de una lesión significativa, poco se sabe acerca de los mecanismos celulares y moleculares que rigen este fenómeno. El uso directo, el pez cebra transgénico y un ensayo de corte transversal del nervio reproducible, podemos estudiar los comportamientos de células gliales dinámicos durante la degeneración del nervio y la regeneración.

Motor transección del nervio y Time-lapse de imágenes de Conductas de células gliales en el pez cebra en vivo

La ablación láser es una tecnología ampliamente aplicable para el estudio de la regeneración en sistemas biológicos. El protocolo presentado describe el uso de un microscopio confocal de escaneo láser estándar para la ablación láser y la posterior imagen de lapso de tiempo de las células interneuromas regeneradoras en la línea lateral del pez cebra.

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Aquí, presentamos un protocolo para realizar imágenes de calcio de dos fotones en el prosencéfalo dorsal de pez cebra adulto.

Imágenes de calcio de dos fotones de la actividad del prosencéfalo en peces cebra adultos que se comportan

Este protocolo describe un enfoque de ablación con láser de dos fotones llevado a cabo en larvas de pez cebra, que sirve como modelo para estudiar la regeneración ósea y los efectos de la respuesta inmune a la ablación.

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Aquí, presentamos un protocolo detallado para examinar la actividad neuronal en regiones cerebrales de pez cebra transgénico que expresan indicadores de calcio GCaMP utilizando microscopía confocal.

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Aprende a ablar neuronas pretectales específicas en larvas de pez cebra utilizando un láser de dos fotones. Este método permite evaluar la actividad del circuito neuronal y el comportamiento de captura de presas mediante imagen de calcio.

Ablación de una población Neuronal utilizando un láser de dos fotones y su evaluación mediante grabación comportamiento y proyección de imagen de calcio en las larvas de pez cebra (Video) | JoVE Journal

Ablación de una población Neuronal utilizando un láser de dos fotones y su evaluación mediante grabación comportamiento y proyección de imagen de calcio en las larvas de pez cebra

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