Ablación de una población Neuronal utilizando un láser de dos fotones y su evaluación mediante grabación comportamiento y proyección de imagen de calcio en las larvas de pez cebra

El objetivo general de este experimento es probar el efecto de la ablación con láser de ciertas neuronas en la actividad y el comportamiento de los circuitos. Con esta técnica experimental podemos examinar la necesidad de neuronas en un circuito subyacente al comportamiento. Este método puede ayudar a responder nuestras preguntas clave en el campo del comportamiento y la neurociencia, como cómo se percibe la presa y cómo se genera el comportamiento capturado por la actividad neuronal.

La principal ventaja de esta técnica es que las neuronas pueden ser ablacionadas específicamente debido al marcaje genético de estas neuronas y también a la alta resolución espacial del láser. Después de criar larvas y montarlas en agarosa de bajo punto de fusión al 2% de acuerdo con el protocolo de texto, coloque las larvas incrustadas en agarosa bajo un microscopio de escaneo láser de dos fotones y comience el sistema de microscopía. Abra el software de adquisición de imágenes y, en la pestaña láser, haga clic en el botón de encendido para encender el láser.

Espere a que el estado del láser cambie de ocupado a modo bloqueado. En la pestaña de canales, establezca la longitud de onda del láser en 880 nanómetros para la ablación con EGFP o 800 nanómetros para la ablación con GCaMP. Seleccione la lente subjetiva 20X moviendo manualmente el revólver de la lente.

A continuación, haga clic en la pestaña Localizar, haga clic en GFP para cambiar las vías ópticas y ver directamente la fluorescencia a ojo. Centre el cerebro de la larva de pez cebra en el campo de visión, luego haga clic en la pestaña de adquisición para volver a la microscopía de dos fotones y establecer la potencia y la ganancia del láser. Como registro de la condición anterior a la ablación, haga clic en Pila Z para seleccionar la opción Pila Z.

Luego, después de enfocarse en el extremo ventral del cerebro de la larva, haga clic en el botón establecer primero para establecer el límite inferior y después de concentrarse en la superficie más dorsal del cerebro, haga clic en el último botón establecer para establecer el límite superior. Por último, haga clic en el botón Iniciar experimento para ejecutar la adquisición de imágenes de la pila Z. A continuación, seleccione la lente subjetiva 63X moviendo manualmente el revólver de la lente.

A continuación, haga clic en la pestaña localizar para cambiar a la microscopía de epifluorescencia. Centre las células que se van a ablacionar a ojo y, a continuación, haga clic en la pestaña de adquisición para volver a la microscopía de barrido láser. En la pestaña Modo de adquisición, establezca el tamaño de fotograma en 256 por 256.

Haz clic en vivo y observa las neuronas de interés. Luego, comenzando desde el lado más dorsal, encuentre un plano focal en el que las células a ablacionar estén enfocadas. Usando la función de regiones, marque una pequeña área circular de aproximadamente 1/3 del tamaño de la célula en diámetro en cada neurona como un ROI.

Establezca la velocidad de escaneo en 13,9 segundos por 256 por 256 píxeles, lo que corresponde a un tiempo de permanencia del láser de aproximadamente 200 microsegundos por píxel o 200 microsegundos por media micra. Además, establezca el ciclo de iteración en cuatro repeticiones. Haga clic en iniciar experimento para ejecutar las funciones de serie temporal y blanqueo.

Compare la imagen antes de la ablación con la imagen después de la ablación en el ciclo de series temporales para asegurarse de que la fluorescencia de las células objetivo ha desaparecido. A continuación, mueva el plano focal un poco más profundo y elija el siguiente plano focal donde aparecen las celdas no abladas. Lleve a cabo la función de blanqueo como se acaba de demostrar y repita el proceso hasta que todas las células de la estructura neuronal de interés hayan sido ablacionadas.

Después de la ablación, compruebe si las células han abolido la fluorescencia y repita la irradiación láser si es necesario. Después de la irradiación, es necesario recuperar las larvas. Con cuidado, haga pequeños cortes perpendiculares en la agarosa alrededor de las larvas.

Luego, espere a que el pez salga nadando de la agarosa por sí solo cuando desaparezca el efecto de la anestesia. Después de cultivar paramecia y anestesiar una larva de pez cebra de acuerdo con el protocolo de texto, coloque las larvas en agarosa al 2% de punto de fusión bajo e inmediatamente elimine cualquier exceso de agarosa para que la superficie de la agarosa se vea ligeramente convexa. Con una aguja de disección, oriente rápidamente las larvas en posición vertical.

Luego, con un cuchillo quirúrgico, haga algunos cortes pequeños en la agarosa para eliminar la agarosa alrededor de la cabeza del pez cebra, lo que deja espacio para que nade el paramecio. Retire con cuidado la agarosa residual vertiendo suavemente el agua del sistema en la cámara. A continuación, coloque un paramecio en la cámara de grabación para que sirva como estímulo visual.

A continuación, coloque la cámara de grabación bajo un microscopio de epifluorescencia equipado con una cámara CMOS científica y seleccione un objetivo de 2,5X. Inicie la aplicación de adquisición de imágenes para la cámara equipada. Haga clic en Panel de secuencia y seleccione Registro de disco duro en el panel.

En la sección de configuración de escaneo, establezca el recuento de fotogramas en 900 o cualquier otro número total de fotogramas que desee. En el panel de captura, establezca el tiempo de exposición en 30 milisegundos y el agrupamiento en dos por dos. Haga clic en vivo en el panel de captura para ubicar las larvas en la vista de la cámara y el enfoque y, a continuación, haga clic en Detener en vivo y haga clic en el botón Inicio.

Guarde la película en formato cxd y analice los datos de acuerdo con el protocolo de texto. Después de configurar el sistema de registro de comportamiento y colocar una larva en una cámara de registro de acuerdo con el protocolo de texto, use una micropipeta para recolectar 50 paramecas y colocarlas en la cámara de registro. Para colocar un cubreobjetos en la parte superior de la cámara de grabación, ponga una pequeña gota de agua sobre el cubreobjetos antes de colocarlo sobre la superficie del agua de la cámara de grabación, para evitar introducir aire en la cámara.

Coloque la cámara de grabación en el sistema de iluminación. A continuación, inicie la grabación de lapso de tiempo a 10 fotogramas por segundo durante 11 minutos. Por último, realizar el análisis según el protocolo de texto.

En este experimento con la línea Gal4 que marca núcleos en el área pretectal y una subpoblación de neuronas del bulbo olfatorio. Las neuronas pretectales fueron ablacionadas bilateralmente con láser. Las neuronas olfativas fueron ablacionadas como control.

Los resultados muestran que el láser de dos fotones puede extirpar las células objetivo sin afectar a las neuritas adyacentes. En este experimento se investigó la conectividad funcional de las neuronas pretectales que proyectan sus axones hacia la ILH ipsilateralmente. Tanto el pretectum como el ILH mostraron actividad neuronal en presencia proximal de la presa, lo que sugiere que ambas actividades neuronales son impulsadas visualmente.

También se utilizaron imágenes de calcio para observar la actividad neuronal en el pretectum y la ILH en las larvas ablacionadas con neuronas pretectales. El pretectum izquierdo que fue ablacionado con láser mostró actividad neuronal residual o nula. Además, la ILH ipsilateral mostró una actividad neuronal drásticamente desplazada, lo que sugiere que la mayor entrada a la ILH proviene del pretectum ipsilateral.

Por el contrario, la ILH en el otro lado del pretectum ablacionado con láser mostró una actividad neuronal comparable a la actividad neuronal en el pretectum ipsilateral, lo que sugiere que la ILH derecha está recibiendo entradas del pretectum derecho. Una vez dominado, la ablación láser se puede realizar en aproximadamente una hora para cada larva de pez cebra. Al intentar este procedimiento, es importante recordar que solo se deben extirpar las neuronas objetivo con la irradiación láser adecuada, evitando el daño por calor del láser.

Siguiendo este procedimiento, se puede realizar la ablación de neuronas en otras áreas del cerebro como el prosencéfalo o el cerebro posterior para responder preguntas adicionales como cómo estas neuronas están involucradas en las funciones cognitivas o motoras. Después de su desarrollo, esta técnica allanó el camino para que los investigadores en el campo de la neurociencia del comportamiento exploraran los circuitos neuronales funcionales en modelos de peces cebra. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo extirpar específicamente las neuronas con láser en el cerebro de las larvas de pez cebra y evaluar las consecuencias funcionales y conductuales.

No olvide que trabajar con un láser puede ser extremadamente peligroso y siempre cumpla con las instrucciones del fabricante mientras realiza este procedimiento.