Name: Ablación de una población Neuronal utilizando un láser de dos fotones y su evaluación mediante grabación comportamiento y proyección de imagen de calcio en las larvas de pez cebra (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-06-02T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 29 s
Description: Aprende a ablar neuronas pretectales específicas en larvas de pez cebra utilizando un láser de dos fotones. Este método permite evaluar la actividad del circuito neuronal y el comportamiento de captura de presas mediante imagen de calcio.

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Estos estudios fueron financiados por subvenciones recibidas del MEXT, JSP KAKENHI Grant números JP25290009, JP25650120, JP17K07494 y JP17H05984.

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Los autores no tienen conflictos de interés al informe.

Aunque el régimen de dos fotones láser tiene una excelente resolución espacial a ablar específicamente las neuronas individuales, gran debe tener precaución para evitar daños no deseados en el tejido cerebral debido a la calor. El paso más importante en el experimento de ablación es determinar la cantidad óptima de la irradiación del laser. Insuficiente irradiación no mata a las neuronas. Demasiada irradiación será daño por calor el tejido circundante, que darán lugar a efectos no deseados. El rango óptimo de irradiación...

Para entender cómo el comportamiento surge de la actividad neuronal en el cerebro, es necesario identificar los circuitos neuronales que intervienen en la generación de ese comportamiento. En la etapa larval, el pez cebra proporciona un modelo animal ideal para estudiar la función cerebral asociado con el comportamiento porque sus cerebros pequeños, transparentes permiten investigar la actividad neuronal en una resolución de celular en una zona amplia de la cerebro mientras observa el comportamiento1. Proyección de imagen de la actividad neuronal en las neuronas específicas ha sido posible a través de la invención de indicadores genético codificados calcio (Ca) (GECIs) como GCaMP2. Pez cebra transgénico GCaMP han demostrado para ser útiles para asociar el circuito neuronal funcional con un comportamiento mediante la realización de proyección de imagen de Ca en comportamiento de animales3.
Mientras que la proyección de imagen de Ca puede demostrar las correlaciones entre la actividad neuronal y el comportamiento, para demostrar causalidad, supresión de la actividad neuronal y su consequence(s) sobre el comportamiento de la prueba son pasos importantes. Hay varias maneras de lograrlo: uso de la mutación genética que altera circuitos neurales específicos4, expresión de neurotoxinas en neuronas específicas5,6, uso de herramientas optogenetic como halorodopsina7, y laser de ablación de las neuronas específicas8,9. Ablación láser es especialmente adecuada para la eliminación de la actividad en un número relativamente pequeño de neuronas específicas. Eliminación irreversible de la actividad neuronal matando neuronas facilita la evaluación de consecuencias conductuales.
Un comportamiento interesante que se puede observar en la etapa larval en el pez cebra es la captura de presas (figura 1A). Este comportamiento guiado visualmente, intencionadas ofrece un favorable sistema experimental para el estudio de la agudeza visual10, transformación visuomotor11,12,13, percepción visual y reconocimiento de objetos14,15,16,17,18y19de la toma de decisiones. Cómo presa es reconocida por depredadores y cómo detección de presa lleva a la presa catching comportamiento ha sido una cuestión central en Neuroetología20. En este artículo, nos centramos en el papel del circuito hipotalámico pretecto formado por proyecciones de un núcleo en el pretectum (núcleo pretectalis superficialis equipara magnocellularis, en adelante, simplemente observado como el pretectum) al ILH. Ablación del laser del pretectum fue demostrada para reducir la actividad de captura de presas y suprimen la actividad neuronal en el ILH asociado a la percepción visual de la presa del21. Aquí, los protocolos para la realización de láser ablación y probar su efecto en Ca2 + la proyección de imagen y grabación de comportamiento describen a las larvas de pez cebra.

<table><tbody><tr><td>NuSieve GTG Agarosa</td><td>Lonza</td><td>Cat.#50080</td><td>agarosa de baja temperatura de fusión</td></tr><tr><td>6 cm placa de Petri</td><td>FALCON</td><td>Producto#:351007</td><td></td></tr><tr><td>aguja de disección</td><td>AS ONE Corporation</td><td>Cat. Nº 2-013-01</td><td>https://keystone-lab.com/en/item/detail/404142</td></tr><tr><td>LSM7MP</td><td>Carl Zeiss</td><td></td><td>microscopio de barrido láser de dos fotones</td></tr><tr><td>W Plan-Apochromat 63x/1.0</td><td>Carl Zeiss</td><td></td><td>63X</td></tr><tr><td>objetivo lente Imager.Z1</td><td>Carl Zeiss</td><td></td><td>un microscopio de epifluorescencia</td></tr><tr><td>ZEN</td><td>Carl Zeiss Software de adquisición de</td><td></td><td>imágenes para microscopios confocales</td></tr> Junta <tr><td>de cámara de hibridación Secure-Seal, 8 cámaras, 9 mm de diámetro x 0,8 mm de profundidad</td><td>Catálogo de Sondas</td><td>Moleculares # S-24732</td><td>Utilizado como cámara de registro en cámaras de imagen de Ca</td></tr><tr>Cámaras<td>de imagen Grace</td><td>Bio-Labs</td><td>CoverWell PCI-A-2.5</td><td>Utilizado como cámara de registro de comportamiento</td></tr><tr><td>bisturí quirúrgico</td><td>MANI</td><td>Cuchillo oftálmico MST15</td><td></td></tr><tr><td>ORCA-Flash4.0</td><td>Modelo de Hamamatsu Photonics</td><td>:C11440-22CU</td><td>una cámara CMOS científica</td></tr><tr><td>HCImage</td><td>Hamamatsu Photonics</td><td></td><td>software de acusión de imágenes</td></tr><tr><td>Módulo de grabación de disco duro</td><td>Hamamatsu Photonics</td><td>Un módulo de software que permite guardar los archivos de película en una unidad de disco duro en poco tiempo</td>SZX7 Olympus estereoscopio DF PL 0.5X Olympus <td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td>lente de objetivo para SZX7</td></tr><tr><td>Point Grey Grasshopper3 4.1 MP Mono USB3 Visio</td><td>FLIR Systems, Inc.</td><td>N.º de producto GS3-U3-41C6NIR-C</td><td>CMOS cámara</td></tr><tr><td>XIMEA xiQ cámara</td><td>XIMEA</td><td>N.º de producto Cámara</td><td>CMOS</td>MQ042RG-CM</tr><tr><td>un anillo de luz LED</td><td>CCS</td><td>Modelo: LDR2-100SW2-LA</td><td>LED</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr> blanco <tr><td>Malla de nailon 32&micro; m</td><td>Tokyo Screen</td><td>N-No.380T</td><td>http://www.tokyo-screen.com/cms/sta20347/</td></tr> <tr><td>Malla de nylon 13&micro; m</td><td>Pantalla de Tokio</td><td>N-No. 508T-K</td><td>http://www.tokyo-screen.com/cms/sta20347/</td></tr> <tr><td>Pantalla de metal con apertura de 150 micras</td><td>Pantalla</td><td></td> de <td>http://www.tokyo-screen.com/cms/sta20341/#ami</td></tr><tr><td>de metal con apertura de 75 micras</td><td>Pantalla</td><td></td> de <td>http://www.tokyo-screen.com/cms/sta20341/#ami</td></tr><tr><td>EBIOS</td><td>Asahi Food & Cuidado de la salud, Co. Ltd.</td><td></td><td>levadura de cerveza seca</td></tr><tr><td>LabVIEW</td><td>National Instruments</td><td></td>, <td>un entorno de desarrollo integrado para la programación</td></tr><tr><td>de Mai-Tai HP</td><td>Spectra Physics&nbsp;</td><td></td><td>láser de dos fotones&nbsp;</td></tr></tbody></table>

ablación de una población neuronal utilizando un láser de dos fotones y su evaluación mediante grabación comportamiento y proyección de imagen de calcio en las larvas de pez cebra

Ablation of a Neuronal Population Using a Two-photon Laser and Its Assessment Using Calcium Imaging and Behavioral Recording in Zebrafish Larvae

Para identificar el papel de una subpoblación de neuronas en el comportamiento, es esencial para poner a prueba las consecuencias de bloquear su actividad en animales vivos. Ablación láser de las neuronas es un método eficaz para este propósito cuando las neuronas son selectivamente marcadas con sondas fluorescentes. En el presente estudio, se describen los protocolos para láser ablación una subpoblación de neuronas utilizando un microscopio de dos fotones y la prueba de sus consecuencias funcionales y conductuales. En este estudio, el comportamiento de captura de presas en las larvas de pez cebra se utiliza como un modelo de estudio. El circuito hipotalámico pretecto se conoce para ser la base de esta presa visualmente impulsado por captura de comportamiento. Pez cebra pretectum fue quitado por ablación láser, y la actividad neuronal en el lóbulo inferior del hipotálamo (ILH; el objetivo de la proyección pretectal) fue examinada. Comportamiento de captura de presas después de la ablación pretectal también fue probado.

Neuronas específicas fueron etiquetadas genéticamente con EGFP o GCaMP6s, cuya expresión fueron conducidos en líneas de Gal4. Un gSAIzGFFM119B de la línea de Gal4 fue utilizada para etiquetar un núcleo en el área pretectal (núcleo pretectal superficial magnocelulares) y una subpoblación de neuronas del bulbo olfatorio. Otra línea de Gal4, hspGFFDMC76A, fue utilizado para etiquetar el ILH. Laser-ablación las neuronas pretectal bilateral (panel de la izquierdafigura 2</...

Aquí, presentamos un protocolo para ablación de una subpoblación genéticamente marcada de neuronas por un láser de dos fotones de larvas de pez cebra.

Ablación de una población Neuronal utilizando un láser de dos fotones y su evaluación mediante grabación comportamiento y proyección de imagen de calcio en las larvas de pez cebra

To identify the role of a subpopulation of neurons in behavior, it is essential to test the consequences of blocking its activity in living animals. Laser ...

El objetivo general de este experimento es probar el efecto de la ablación con láser de ciertas neuronas en la actividad y el comportamiento de los circuitos. Con esta técnica experimental podemos examinar la necesidad de neuronas en un circuito subyacente al comportamiento. Este método puede ayudar a responder nuestras preguntas clave en el campo del comportamiento y la neurociencia, como cómo se percibe la presa y cómo se genera el comportamiento capturado por la actividad neuronal.La principal ventaja de esta técnica es que las neuronas pueden ser ablacionadas específicamente debido al marcaje genético de estas neuronas y también a la alta resolución espacial del láser. Después de criar larvas y montarlas en agarosa de bajo punto de fusión al 2% de acuerdo con el protocolo de texto, coloque las larvas incrustadas en agarosa bajo un microscopio de escaneo láser de dos fotones y comience el sistema de microscopía. Abra el software de adquisición de imágenes y, en la pestaña láser, haga clic en el botón de encendido para encender el láser.Espere a que el estado del láser cambie de ocupado a modo bloqueado. En la pestaña de canales, establezca la longitud de onda del láser en 880 na

ablation-neuronal-population-using-two-photon-laser-its-assessment

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Investigación

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Aquí se describe un método para el montaje de embriones de pez cebra a largo plazo de imágenes, de dos fotones de imágenes y técnicas de daño a los tejidos, y de lapso de tiempo de imagen confocal.

De dos fotones axotomía y de lapso de tiempo de imagen confocal en embriones de pez cebra en vivo

Este video describe el ensayo de captura de presas. El video discute el método para estudiar el comportamiento de captura de presas de las larvas de pez cebra después de la ablación con láser de neuronas específicas.

Ensayo de captura de presas: un método para estudiar el comportamiento de captura de presas de la larva de pez cebra

Este video describe el método para dañar los axones en embriones de pez cebra utilizando axotomía con láser de dos fotones y observando la recuperación axonal de la lesión.

Axotomía láser de dos fotones: un método para dañar los axones en embriones de pez cebra y observar la recuperación axonal

Este video demuestra el método para estudiar la detección visual de presas en larvas de pez cebra transgénicas utilizando imágenes fluorescentes basadas en indicadores de calcio con sus neuronas expresando complejos indicadores de calcio fluorescentes.

Análisis de la actividad neuronal evocada por presas en una larva de pez cebra transgénica

Source: Morsch, M.,  et. al., desencadenando el estrés y la muerte celular utilizando microscopía confocal convencional con láser UV. J. Vis. Exp. (2017) En este video, exploramos la técnica de ablación con láser UV de alta intensidad para apuntar y estudiar con precisión las neuronas individuales en el pez cebra transgénico. Demostramos cómo preparar, inmovilizar y visualizar las respuestas neuronales, destacando la dinámica celular de la lesión y la recuperación.

Ablación selectiva con láser de una sola neurona en una larva de pez cebra utilizando un microscopio confocal

Fuente: Muto, A., et al. Ablación de una población neuronal mediante láser de dos fotones y su evaluación mediante imágenes de calcio y registro de comportamiento en larvas de pez cebra. J. Vis. Exp. (2018) En este video,  Se demuestra un procedimiento de ablación con láser de dos fotones, que permite la destrucción selectiva de neuronas fluorescentes en larvas de pez cebra inmovilizadas con agarosa. Las imágenes de alta resolución antes y después del procedimiento confirman un daño neuronal...

Ablación neuronal dirigida mediante microscopía de dos fotones en un pez cebra Larava

Aunque el sistema nervioso periférico (SNP) es capaz de reparación después de una lesión significativa, poco se sabe acerca de los mecanismos celulares y moleculares que rigen este fenómeno. El uso directo, el pez cebra transgénico y un ensayo de corte transversal del nervio reproducible, podemos estudiar los comportamientos de células gliales dinámicos durante la degeneración del nervio y la regeneración.

Motor transección del nervio y Time-lapse de imágenes de Conductas de células gliales en el pez cebra en vivo

La ablación láser es una tecnología ampliamente aplicable para el estudio de la regeneración en sistemas biológicos. El protocolo presentado describe el uso de un microscopio confocal de escaneo láser estándar para la ablación láser y la posterior imagen de lapso de tiempo de las células interneuromas regeneradoras en la línea lateral del pez cebra.

Ensayo de regeneración y ablación láser basado en microscopio confocal en células interneuromas de peces cebra

Aquí, presentamos un protocolo para realizar imágenes de calcio de dos fotones en el prosencéfalo dorsal de pez cebra adulto.

Imágenes de calcio de dos fotones de la actividad del prosencéfalo en peces cebra adultos que se comportan

Este protocolo describe un enfoque de ablación con láser de dos fotones llevado a cabo en larvas de pez cebra, que sirve como modelo para estudiar la regeneración ósea y los efectos de la respuesta inmune a la ablación.

Ablación de osteoblastos mediada por láser de dos fotones en larvas de pez cebra en desarrollo

Aquí, presentamos un protocolo detallado para examinar la actividad neuronal en regiones cerebrales de pez cebra transgénico que expresan indicadores de calcio GCaMP utilizando microscopía confocal.

In vivo Imágenes de fluorescencia confocal de la actividad neuronal inducida por estimulación sensorial en larvas de pez cebra parcialmente restringidas

Aprende a ablar neuronas pretectales específicas en larvas de pez cebra utilizando un láser de dos fotones. Este método permite evaluar la actividad del circuito neuronal y el comportamiento de captura de presas mediante imagen de calcio.

Ablación de una población Neuronal utilizando un láser de dos fotones y su evaluación mediante grabación comportamiento y proyección de imagen de calcio en las larvas de pez cebra (Video) | JoVE Journal

Ablación de una población Neuronal utilizando un láser de dos fotones y su evaluación mediante grabación comportamiento y proyección de imagen de calcio en las larvas de pez cebra

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