Name: Un ecdisona basada en Receptor Singular gen interruptor para deliberada expresión del transgén con robustez, reversibilidad y filtración insignificante (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-05-07T14:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 21 s
Description: Aprende a modular la expresión de transgenes usando el interruptor génico pEUI(+) y tebufenozida en células HEK 293. Este método permite controlar la activación génica con precisión temporal y reversibilidad.

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Los autores agradecen S Y Choi (Universidad Nacional de Chonnam) valiosos comentarios y la lectura cuidadosa de nuestro manuscrito. Este trabajo fue financiado por un fondo de investigación de la Universidad Nacional de Chungnam.

1. transgén Subcloning
<ol><li>Elija un sitio de reconocimiento de la enzima de restricción apropiada (o sitios) en el MCS de pEUI(+) y subclone el gen de interés en la dirección deseada (figura 1). Nota: La EGFP o bandera del epítopo tagged ankyrin repite dominio 13A transgén (ANKRD13A) fue subcloned en el sitio de EcoRI del vector pEUI(+) con polimerasa de la DNA de T4 en una secuencia de ligadura independientes y clonación método19.</li>
	<li>Alinear el pEUI(+) con EcoRI para 1 h a 37 ° C. Mezcle 50 ng/μl de lineal pEUI(+) con 40 ng/μl de PCR amplificado EGFP o ANKRD13A y reaccionan con polimerasa de la DNA de T4 (1 U) durante 1 min a temperatura ambiente (RT) antes de la incubación en hielo durante 10 minutos agregar 10 μl de la mezcla de reacción directamente a 100 μl de DH10B células competentes para la transformación siguiente experimentan. Nota: Aunque varios sitios de reconocimiento de enzimas de restricción fueron agregados a los MCS de pEUI(+) (figura 1B), le recomendamos subcloning el gene de la blanco en el sitio de EcoRI, independiente de la ligadura clonación tecnología19,20.</li>
	<li>Verificar la inserción por la secuencia y luego purificar el ADN utilizando un kit de purificación de DNA que es conveniente para la transfección.</li>
</ol>2. transitorios de la transfección y Teb tratamiento
<ol><li>Preparar cuatro platos de la cultura celular (60 mm de diámetro) que contienen los recién HEK293 las células en 5 mL de medio de Eagle modificado de Dulbecco (DMEM) suplidas con 5-10% suero bovino fetal (FBS) y antibióticos (100 U/mL de penicilina, estreptomicina 100 de μg/mL). En adelante, el "medio de cultivo celular" o "medio de cultivo" representa el DMEM suplementado con SBF y antibióticos. Mantener las células HEK293 a 37 ° C.</li>
	<li>Transfectar 1 μg de DNA purificado en las células HEK293 a densidad de 50-60% con 3 μl de reactivo de transfección. Añadir el reactivo de transfección a 200 μL de diluyente (DMEM sin FBS y antibióticos) que contiene el ADN. Después de la incubación de la mezcla de reacción durante 30 minutos a temperatura ambiente, agregar la mezcla a las células HEK-293 en el plato de cultura. Dos platos para transfección y dejar los otros dos no se tratan como controles.</li>
	<li>Después de 12-24 h de la transfección, agregue Teb (concentraciones finales, 0.2 - 10 μmol) a una de las muestras transfected y uno de los controles no transfectadas. Deje las otras dos muestras que no se tratan como controles experimentales. Nota: Se puede diluir la solución madre de Teb (50 mM disuelto en dimetil sulfóxido) en medio de cultivo celular, DMEM o solución salina con tampón fosfato (PBS) en una concentración adecuada antes de agregar a las células cultivadas según los parámetros experimentales. Sin embargo, debido a la baja solubilidad del Teb en solución acuosa, evitar la preparación de una mezcla de maestro con una alta concentración de Teb en medio; en su lugar, sustituir el medio de cultivo de célula completa con medio fresco que contiene Teb a la concentración deseada.</li>
	<li>Cultivar las células Teb-tratadas y no tratadas durante 12-48 h a 37 ° C.</li>
	<li>Si se usa la EGFP Inserte, analizar la expresión de EGFP bajo un microscopio de fluorescencia ( figura 2). De lo contrario, la cosecha las células para un ensayo de inmunotransferencia.<ol>
<li>Para el análisis de immunoblotting, enjuague las células dos veces con PBS helado y luego los raspar hacia fuera usando un raspador celular.</li>
		<li>Para las células de la viruta, desactivación de las cosechas en un tubo cónico de 15 mL a 21.000 x g durante 2 min a 18-25 ° C (RT).</li>
		<li>Después de descartar el PBS completamente, Añadir 0,5 mL del reactivo de extracción de proteína mamífera helada (M-por), junto con inhibidor de la proteasa (5 μl de 100 x inhibidor de la proteasa cóctel), a la pelotilla si las células se cultivan en un plato de 60 mm.</li>
		<li>Resuspender las células con varias rondas de pipeteo y luego incubar las células suspendidas durante 15 min a 18-25 ° C (RT).</li>
		<li>Girar la celda lisada a 21.000 x g por 10 min a 4 ° C.</li>
		<li>Transferir el sobrenadante acuoso en un tubo de microcentrífuga de 1,5 mL fresco.</li>
		<li>Analizar el sobrenadante por immunoblotting, siguientes protocolos estándar con los anticuerpos adecuados.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. generación de líneas de células HEK293 estable con integración genómica de la pEUI(+) Gene Switch
<ol><li>Transfectar 5-10 μg de la pEUI(+) purificada con el transgén en las células HEK293 que son confluentes de 50-60% en una placa de cultivo celular del diámetro 90 mm, con 15-30 μl de reactivo de transfección. Añadir el reactivo de transfección a 500 μl del diluyente (DMEM sin FBS y antibióticos) que contiene el ADN. Después de la incubación de la mezcla de reacción durante 30 minutos a temperatura ambiente, agregar la mezcla a las células HEK-293 en el plato de cultura.</li>
	<li>Después de la transfección, deje los transfectants crecer y expresar los productos de gen de resistencia a puromicina en medio de cultivo no selectivo (sin puromicina) durante 24-48 h a 37 ° C.</li>
	<li>Disociar las células de los platos de la cultura por tripsinización. Después de descartar el medio de cultivo, enjuagar transfectants con PBS precalentado (37 ° C), agregar 1 mL de ácido de 0.25% tripsina/etilendiaminotetracético (EDTA) e Incube por 1 min a 37 ° C. Después de apagar el tripsina/EDTA agregando con medio de cultivo (10 mL, 37 ° C), cosechar las células usando un raspador celular, seguido por centrifugación en un tubo cónico de 15 mL a 21.000 x g durante 2 min a 18-25 ° C.</li>
	<li>Vuelva a suspender los transfectants en 50 mL de medio de cultivo precalentado (37 ° C) y 10 mL de las células de transferencia en platos de cultivo celular fresco 90 mm. La cultura de las células a 37 ° C hasta confluencia de 50-60% antes del tratamiento de puromicina (en general, esto toma aproximadamente 24-48 h).</li>
	<li>Cultivar los transfectants a 37 ° C en medio de cultivo celular complementado con 3 puromicina μg/mL durante 3-4 semanas. Durante el período de selección, cambiar el medio de cultivo celular que contenga puromicina (3 μg/mL) cada 2-3 días para mantener la presión de selección. Cuando las células se vuelven completamente confluentes, divididos los mismos procedimientos en pasos 3.3-3.4, con medio de cultivo que contiene la puromicina. Deseche las células restantes en el medio de cultivo, si no es necesario. Nota: Las condiciones de selección de puromicina deben establecerse experimentalmente para tipos específicos de la célula. Utilizamos 3 μg/mL de puromicina en el medio de cultivo celular; Esto fue suficiente para inducir la muerte celular en HEK293 transfectadas no.</li>
	<li>Cosechar las células de colonias individuales, utilizando un cilindro de clonación y siga las instrucciones del fabricante.<ol>
<li>Descartar el medio de cultivo celular. Lavar la placa dos veces con precalentado (37 ° C) PBS para eliminar las células flotantes.</li>
		<li>Utilizando pinzas estériles, coloque el cilindro de clonación sobre las colonias individuales.</li>
		<li>Añadir 0,2 mL de 0.35% tripsina/EDTA a cada cilindro.</li>
		<li>Incubar la placa a 37 ° C por 1 min hasta que las células son separadas y luego añadir unas gotas de medio de cultivo de precalentado (37 ° C) a los cilindros.</li>
		<li>Transferencia de las células de cada cilindro a pozos individuales de una placa de 6 pozos, con 2 mL de medio de cultivo y 1 μg/mL de puromicina en cada pozo. Nota: Cuando las células se vuelven confluentes, ampliar la cultura. Ahora se puede establecer clone(s).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Mantener clones individuales en medio de cultivo celular 1 μg/ml de puromicina.</li>
	<li>Validar las colonias individuales por prueba de su sensibilidad al tratamiento Teb (concentración final, 10 μm) por 24 h. prueba de la capacidad de respuesta de los clones en el Teb analizando el nivel de expresión del transgen con el immunoblotting. Seleccione un deseado clon (o clones). Cultivar una Teb-tratados y una muestra sin tratar en medio de cultivo durante 12-48 h a 37 ° C antes de analizar el nivel de inducción del transgén. El nivel de expresión del transgen puede medirse mediante immunoblotting, siguiendo los procedimientos en pasos 2.5.1 - 2.5.7.</li>
</ol>4. agotamiento de Teb
<ol><li>Saciar los estímulos Teb sustituyendo Teb conteniendo medio de cultivo celular con medio libre de Teb. Nota: Se recomienda reemplazar los medios de crecimiento sin primera resiembra las células en un nuevo plato de cultura. Teb residual parece aferrarse al plato plástico y elicite una expresión sólida formación del transgén. Antes de volver a sembrar las células en una placa de cultivo nuevo, enjuagar las células cosechadas varias veces con medio de cultivo o PBS.<ol>
<li>Disociar las células de los platos de la cultura por tripsinización. Después de descartar el Teb conteniendo medio de cultivo, enjuagar el Teb-estimulado las células dos veces con PBS precalentado (37 ° C), agregar 1 mL de 0.25% tripsina/EDTA e incubar 1 minuto a 37 ° C. Después de apagar el tripsina/EDTA por agregar a precalentado Teb-libre medio de cultivo (10 mL, 37 ° C), cosechar las células usando un raspador celular, seguido por centrifugación en un tubo cónico de 15 mL a 21.000 x g durante 2 min a 18-25 ° C.</li>
		<li>Resuspenda las células en 50 mL de Teb-libre con medio de cultivo (37 ° C) y 5 mL de las células de transferencia en tres platos para cultivo celular fresco 60 mm. La cultura las células a 37 ° C durante 24, 48 y 72 h respectivamente.</li>
		<li>Las células en diferentes momentos de la cosecha y medir el nivel de expresión del transgen mediante el uso de immunoblotting. Nota: Bajo estas condiciones experimentales, la expresión del transgen se convirtió indetectable aproximadamente 3 días después la cultura de las células en el medio cultural libre de Teb (figura 3). El nivel de expresión del transgen puede medirse por immunoblotting, según pasos 2.5.1 - 2.5.7.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

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No tenemos conflictos de interés relacionados con este informe.

El principal inconveniente de la utilización de un interruptor de expresión del gen binario es la necesidad de ofrecer simultáneamente dos plásmidos separados (controlador y generador de efectos) en la célula diana. Esto puede conducir a una distribución desigual de plásmidos y resultar en una respuesta incoherente del interruptor para los inductores1,2,3. Otra deficiencia del sistema de dos vectores es que un mínimo de dos rond...

Varios genes diferentes interruptores han sido explorados por su capacidad para regular precisamente expresión de transgenes en los cultivos celulares y modelos animales, con diversos grados de éxito1,2,3. Sistemas de interruptor de genes potenciales deben cumplir varios criterios estrictos, incluyendo: precisa expresión direccional del transgen, capacidad de respuesta de dosis y tiempo dependiente inductores, insignificante filtración del promotor, reversibilidad del transgén activación a través de la eliminación del inductor, inductor de la toxicidad niveles y tolerable para líneas celulares y animales de laboratorio1,2,3. Han explotado varios inductores de molécula pequeña, como tetraciclina4,5, rapamicina6,7,8, mifepristona9,10, y ecdisona11,12,13,14. En general, estos sistemas requieren al menos dos plásmidos que contienen dos o tres unidades de expresión discreta, uno o dos de los cuales componen un elemento regulador (plásmido inductor) que se une un inductor de molécula pequeña para obtener actividad transcripcional; y otro plásmido (plásmido efectoras) que contiene el transgén bajo el control de una región reguladora de ADN que permite el acceso del elemento inductor-limite reglamentario. El principal inconveniente del sistema binario es que requiere la introducción concomitante de dos vectores (inductor y efectoras) en la célula diana. En experimentos de expresión transitoria del transgén, la transfección simultánea de dos plásmidos inevitablemente produce una población de células individualmente transfectadas con el inductor o generador de efectos, o co transfected desigual. Además, el sistema binario requiere al menos dos rondas de selección antibiótica para establecer líneas celulares estables, que es lento y laborioso. Así, combinando todos los componentes necesarios para la expresión del transgen y regulación en un único vector sería lo ideal para garantizar la expresión concomitante de todos los elementos necesarios en una sola célula y permiten la regulación de la expresión del transgén mediante el tratamiento con inductores de molécula pequeña.
Para superar las deficiencias de los interruptores binarios gen, recientemente desarrollamos un interruptor gen singular, utilizando a Drosophila melanogaster de sistema inducible gene basadas en REC. p.15. Ecdisona media expresión génica cuando se une al heterodímero REC/ultraspiracle (USP), que a su vez induce la Unión de la EcR a ADN elementos reguladores3,11. El receptor de vertebrados retinoide X (RXR), un ortólogo de insecto USP, recluta a REC para formar un activador transcripcional activa16. Así, para la expresión específica de un transgén en las células de vertebrados o tejido, el EcR y RXR deben ser co expresado simultáneamente antes de ser estimulado por la ecdisona o sus agonistas. Puesto que la característica heterodiméricos del interruptor gen REC-basado puede ser influenciada por el endógeno RXR nivel, Padidam et al. reemplazado los dominios Rec. p. ADN y activación con heteróloga GAL4 DNA-que atan, Vmw65 del proteína del virus del herpes simple (VP16) dominios de activación fusionada en el dominio ligand-obligatorio de EcR, que luego se convirtió en insensible a RXR endógeno y formados de un homodímero para obtener actividad transcripcional17. El interruptor de genes basados en EcR fue mejorado mediante la construcción de una proteína quimérica de un mínimo dominio de activación VP16 combinado con GvEcR, que forma un homodímero y localizada en el citosol en ausencia de los agonistas de la ecdisona, Teb16, 18. Atando a Teb, la GvEcR cambió su localización subcelular desde el citosol al núcleo para reconocer un promotor híbrido de pez cebra E1b promotor mínimo combinado con un tándem diez repite secuencias de activación ascendente (UASs) para iniciar la transcripción del gen objetivo16.
Para simplificar el gen previamente divulgado basados en EcR interruptores16,18, combinamos las características binarias del sistema en un solo vector equipado con todos los elementos necesarios para la expresión de transgenes estimulante y luego designado el vector recién generado, pEUI(+) (número de GenBank: KP123436, figura 1A)15. El efector respondiendo al conductor GvEcR (en adelante el conductor) está formada por diez tándem UAS repite junto a un promotor mínimo de E1b, seguido por un sitio múltiple de clonado (MCS) con EcoRI PmlI, NheI, Piling, AfeI y AflII secuencias de reconocimiento (figura 1B). Además facilitar la selección de transfected las células, un puromicina impulsado por el promotor SV40 N-acetil-gen de la transferasa (PAC) se colocó entre las regiones controlador y generador de efectos para mantener líneas de células estables (figura 1).
Se describe un protocolo detallado para la modulación transitoria y estable de la expresión del transgen mediante pEUI(+). Además, proporcionamos instrucciones detalladas para el uso exitoso de Teb como un agonista de la ecdisona.

<table><tbody><tr><td>pEUI(+)</td><td>TransLab</td><td></td><td>La licencia de la patente fue transferida a TransLab Inc.&nbsp;</td></tr><tr><td>Reactivo de transfección Gene-Fect</td><td>TransLab</td><td>TLC-001</td><td></td></tr><tr><td>HEK293</td><td>ATCC</td><td>CRL-1573</td><td></td></tr><tr><td>Tebufenozide</td><td>Fluka</td><td>31652</td><td></td></tr><tr><td>Cilindro de clonación</td><td>Sigma</td><td>CLS31668</td><td></td></tr><tr><td>Puromicina</td><td>Corning</td><td>58-58-2</td><td></td></tr><tr><td>Antibióticos</td><td>Gibco</td><td>15240-062</td><td></td></tr><tr><td>Tripsina-EDTA</td><td>Welgene</td><td>LS015-01</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Welgene</td><td>LM001-05</td><td></td></tr><tr><td>Suero fetal bovino</td><td>Welgene</td><td>S001-01</td><td></td></tr><tr><td>Placa de cultivo celular</td><td>SPL ciencias de la vida</td><td>11090</td><td></td></tr><tr><td>ratón FLAG M2</td><td>Sigma</td><td>F3165</td><td></td></tr><tr><td>anticuerpo anti-alfa tubulina</td><td>Calbiochem</td><td>CP06</td><td></td></tr><tr><td>Cilindro de clonación</td><td>Sigma</td><td>CLS31668</td><td></td></tr><tr><td>NucleoBond Xtra Midi</td><td>Macherey-Nagel</td><td>740410.1</td><td></td></tr><tr><td>M-PER Reactivo de extracción de proteínas de mamíferos </td><td>Thermo Fisher</td><td>78505</td><td></td></tr><tr><td>100X Inhibidor de la proteasa Cock. III</td><td>T& I</td><td>BPI-9200</td><td></td></tr></tbody></table>

un ecdisona basada en receptor singular gen interruptor para deliberada expresión del transgén con robustez, reversibilidad y filtración insignificante

An Ecdysone Receptor-based Singular Gene Switch for Deliberate Expression of Transgene with Robustness, Reversibility, and Negligible Leakiness

Control preciso de la expresión del transgén es deseable en estudios biológicos y clínicos. Sin embargo, debido a la función binaria de interruptores Gen actualmente empleada requiere a la transferencia de dos unidades de expresión terapéutica al mismo tiempo en una sola celda, la aplicación práctica del sistema de terapia génica es limitada. Para simplificar el sistema de expresión del transgen, hemos generado un interruptor gen designado como pEUI(+) que abarca un conjunto completo de módulos de expresión del transgen en un solo vector. Que comprende el dominio de unión al ADN de GAL4 y modificado EcR (GvEcR), un mínimo dominio de activación VP16 fusionado con un dominio de unión al ADN de GAL4, así como un receptor de ecdisona Drosophila modificado (EcR), el interruptor nuevo gene singular es altamente respuesta a la administración de un inductor químico en una forma dependiente de dosis y tiempo. El vector de pEUI(+) es una herramienta potencialmente poderosa para mejorar el control de la expresión del transgen en investigación biológica y estudios pre-clínicos. Aquí, presentamos un protocolo detallado para la modulación de una expresión transitoria y estable del transgén pEUI(+) vector mediante el tratamiento de tebufenozide (Teb). Además, compartimos importantes directrices para el uso de Teb como un inductor químico.

El interruptor gen singular basado en el GvEcR se muestra en la figura 1A. El vector de pEUI(+) fue optimizado para la expresión del transgen regulados por el tratamiento con Teb. La región efectora de pEUI(+) consta de un 10xUAS y un promotor mínimo seguido de un MCS que contienen sitios de reconocimiento de enzimas de restricción EcoRI, PmlI, NheI, Piling, AfeI y AflII de E1b. Una señal de poly(A) de SV40 fue agregada detrás de MCS (fig...

Aquí, presentamos un protocolo para la modulación de la expresión transgénica mediante interruptor gen singular de pEUI(+) tratamiento de tebufenozide.

Un ecdisona basada en Receptor Singular gen interruptor para deliberada expresión del transgén con robustez, reversibilidad y filtración insignificante

Precise control of transgene expression is desirable in biological and clinical studies. However, because the binary feature of currently employed gene ...

El objetivo general de este experimento es modular la expresión de transgenes mediante la administración del inductor químico tebufenozida. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la biología celular y molecular, como cuando se necesita estimular la expresión de un gen de interés en un momento deseado con una intensidad deseada. La principal ventaja de esta técnica es que al combinar todos los elementos necesarios para la expresión de transgenes dentro de un solo vector, la expresión de transgenes puede estimularse mediante la administración del inductor químico tebufenozida.Después de subclonar el EGFP o los transgenes ANKRD13A de acuerdo con el protocolo de texto, prepare cuatro placas de cultivo celular que contengan células HEK 293 recién pasadas en cinco mililitros de DMEM suplementado con 5 a 10% de FBS y antibióticos, que en lo sucesivo se denominará medio de cultivo. Mantenga las celdas a 37 grados centígrados. Cuando las células alcancen una densidad del 50 al 60%, agregue tres microlitros de reactivo de transfección a 200 microlitros de diluyente que contenga el ADN.Después de incubar la reacción a temperatura ambiente durante 30 minutos, agregue la mezcla a las celdas HEK 293. Use dos platos para la transfección y deje los otros dos sin tratar como controles. Incubar las células a 37 grados centígrados durante 12 a 24 horas.Después de la incubación, añadir Teb a una de las muestras transfectadas y a uno de los testigos testigos no transfectados. Deje las otras dos muestras sin tratar como controles experimentales. Incubar las placas durante 12 a 48 horas.Si utiliza el inserto de EGFP, analice la expresión de EGFP bajo un microscopio fluorescente. De lo contrario, para recolectar las células para la inmunotransferencia, use PBS helado para enjuagar las células dos veces. Luego, use un raspador de celdas para sacarlos de la placa y transfiéralos a un tubo cónico de 15 mililitros.A continuación, gire los tubos a 21.000 veces g y de 18 a 25 grados centígrados durante dos minutos. Luego, después de desechar el PBS, agregue 0,5 mililitros de reactivo de extracción de proteínas de mamíferos helado, o M-PER, e inhibidor de proteasa al pellet. Vuelva a suspender las células con varias rondas de pipeteo.Luego, incube la suspensión celular a 18 a 25 grados centígrados y temperatura ambiente durante 15 minutos. Centrifugar el lisado celular a 21.000 veces g y cuatro grados centígrados durante 10 minutos. A continuación, transfiera el sobrenadante acuoso a un tubo de microcentrífuga nuevo de 1,5 mililitros y analícelo mediante inmunotransferencia con los anticuerpos adecuados.Para apagar los estímulos de Teb, retire el medio de cultivo que contiene Teb de las células y use PBS precalentado para enjuagar las células dos veces. A continuación, añade un mililitro de tripsina/EDTA al 0,25% e incuba las células a 37 grados centígrados durante un minuto. Agregue 10 mililitros de medio de cultivo precalentado y sin Teb a las células y use un raspador de células para cosecharlas.Transfiera las células a un tubo cónico de 15 mililitros. A continuación, haz girar las células a 21.000 veces g y de 18 a 25 grados centígrados durante dos minutos. Vuelva a suspender las células en 50 mililitros de medio de cultivo precalentado y sin Teb, y transfiera cinco mililitros de las células a tres placas de cultivo de células frescas de 60 milímetros.Incubar las células a 37 grados centígrados durante 24, 48 y 72 horas, respectivamente. Finalmente, recoja las células en diferentes puntos de tiempo y mida los niveles de expresión del transgén mediante inmunotransferencia. En este experimento que evaluó la actividad y la permeabilidad de pEUI-plus-EGFP, los transfectantes vectoriales simulados no mostraron señal fluorescente independientemente del tratamiento con Teb.Sin embargo, los transfectantes de pEUI-plus-EGFP se sensibilizaron progresivamente a la creciente cantidad de Teb. Y lo que es más importante, los transfectantes pEUI-plus-EGFP no tratados con Teb no provocaron ninguna señal de EGFP detectable. Se utilizó ANKRD13A etiquetado con FLAG para validar aún más la capacidad de respuesta de pEUI-plus a Teb.Como se muestra en este Western blot con anticuerpos anti-FLAG, las células HEK 293 transfectadas mostraron una fuerte expresión de ANKRD13A después de un tratamiento de 24 horas con Teb. Además, la depleción de Teb demostró la reversibilidad del cambio del gen pEUI-plus, ya ANKRD13A ya no era detectable en células cultivadas sin Teb. Una vez dominada, esta técnica se puede realizar en una hora si se realiza correctamente.Al intentar este procedimiento, es importante recordar que debe realizar casi todo el experimento en condiciones libres de gérmenes. Siguiendo este procedimiento, se pueden aplicar otros métodos, como el sistema Tet-On o Tet-Off, para expresar diferencialmente dos transgenes distintos. Tras su desarrollo, esta técnica allanó el camino para que los investigadores en el campo de la biología celular exploraran la fisiología molecular a nivel celular.Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo usar el vector de cambio de gen pEUI-plus con el fin de inducir la expresión de transgenes en el momento deseado con la intensidad deseada. No olvide que trabajar con tebufenozida puede ser peligroso y siempre se deben tomar precauciones, como usar una bata de laboratorio, mientras se realiza este procedimiento.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Genetics

Genética

La variación fenotípica de rasgos puede ser consecuencia de mutaciones en cis-elemento regulador (CRE) secuencias de patrones genéticos que controlan la expresión. Métodos derivados de su uso en Drosophila melanogaster cuantitativamente se puede comparar los niveles de la distribución espacial y temporal de la expresión génica mediada por la modificación o naturales variantes CRE.

Comparación cuantitativa de Cis-Elemento regulador (CRE) Las actividades de transgénicos Drosophila melanogaster</em

Fuente: Berens, C. et al. Aplicación de un sistema de expresión inducible para estudiar la interferencia de los factores de virulencia bacteriana con la señalización intracelular. J. Vis. Exp. (2015)Este vídeo demuestra el uso de un sistema de expresión inducible para identificar dónde la proteína efectora bacteriana CaeB interrumpe la cascada apoptótica del huésped. Describe los pasos para transfectar células que expresan CaeB con un sistema sensible a la tetraciclina para inducir la expresión...

Transfección de un sistema de expresión génica inducible en células que expresan una proteína efectora bacteriana

Este video muestra el sistema de expresión génica de tetraciclina, o Tet-On, en un modelo de ratón. En presencia de doxiciclina, un derivado de la tetraciclina, el sistema Tet-On que consiste en una proteína transactivadora controlada por tetraciclina inversa se activa y expresa el gen de interés.

Expresión génica inducible basada en el sistema regulable por Tet-On in vivo: un sistema de expresión génica inducido por tetraciclina para la activación de la transcripción de genes diana en un modelo de ratón

Este protocolo describe un procedimiento experimental para la construcción rápida de factores de transcripción artificiales (ATFS) con GFP reporteros afines y cuantificación de la capacidad de los ATF para estimular la expresión de GFP mediante citometría de flujo.

Síntesis rápida y Detección de factores de transcripción activados químicamente con los periodistas basados ​​en las buenas prácticas agrarias

El método descrito aquí se utiliza para inducir la cascada de señalización apoptótica en pasos definidos con el fin de diseccionar la actividad de una proteína efectora bacteriana antiapoptótica. Este método también se puede utilizar para la expresión inducible de proteínas proapoptóticas o tóxicas, o para diseccionar la interferencia con otras vías de señalización.

La aplicación de un sistema de expresión inducible para el Estudio de la interferencia de los factores de virulencia bacteriana con Señalización Intracelular

El estudio de los canales iónicos a través de un sistema de expresión de forma heteróloga se ha convertido en una técnica básica en la investigación biomédica. En este manuscrito, se presenta un método eficiente de tiempo para conseguir la expresión del canal iónico fuertemente controlada mediante la realización de la transfección transitoria bajo el control de un promotor inducible.

Expresión Ion Channel controlable a través de la transfección transitoria inducible

Aquí, presentamos un método para generar sistemas de transcripción binario tejidos específicos en Drosophila sustituyendo el primer exón de la codificación de los genes con los conductores de la transcripción. El método basado en el CRISPR/Cas9 coloca una secuencia de transactivator bajo la regulación endógena de un gen sustituyó y en consecuencia facilita la expresión de transctivator exclusivamente en los patrones espacio-temporales de gene-específico.

Una estrategia eficiente para la generación de sistemas de transcripción binario tejidos específicos en Drosophila genoma editando

Aquí presentamos un protocolo para desarrollar un sistema inducible negativo dominante, en el que cualquier proteína puede ser condicional inactivada por overexpressing reversiblemente una versión mutante dominante negativo de él.

Inhibición de la proteína inducible y Reversible dominante negativo (DN)

Este protocolo describe los pasos necesarios para generar un modelo de sistema en que se puede regular la transcripción de un gen endógeno de interés condicional en animales vivos o células con mayor lac represor y tet activador de sistemas.

Aplicación in vivo del sistema de control remoto para la manipulación de genes endógenos

El control fiable de las células de mamíferos sensibles a la luz requiere la estandarización de los métodos optogenéticos. Hacia este objetivo, este estudio describe una línea de construcción de circuitos genéticos, ingeniería celular, operación de equipos optogenéticos y ensayos de verificación para estandarizar el estudio de la expresión génica inducida por la luz utilizando un circuito genético optogenético de retroalimentación negativa como estudio de caso.

Ingeniería confiable y control de circuitos genéticos optogenéticos estables en células de mamíferos

Este estudio describe un método para experimentos de alto rendimiento utilizando una matriz de LED impresa en 3D para optimizar la expresión génica inducible por luz en células HEK293T.

Optimización rápida de un sistema inducible por luz para controlar la expresión génica de mamíferos

Aprende a modular la expresión de transgenes usando el interruptor génico pEUI(+) y tebufenozida en células HEK 293. Este método permite controlar la activación génica con precisión temporal y reversibilidad.

Un ecdisona basada en Receptor Singular gen interruptor para deliberada expresión del transgén con robustez, reversibilidad y filtración insignificante (Video) | JoVE Journal

Un ecdisona basada en Receptor Singular gen interruptor para deliberada expresión del transgén con robustez, reversibilidad y filtración insignificante

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