Un ecdisona basada en Receptor Singular gen interruptor para deliberada expresión del transgén con robustez, reversibilidad y filtración insignificante

El objetivo general de este experimento es modular la expresión de transgenes mediante la administración del inductor químico tebufenozida. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la biología celular y molecular, como cuando se necesita estimular la expresión de un gen de interés en un momento deseado con una intensidad deseada. La principal ventaja de esta técnica es que al combinar todos los elementos necesarios para la expresión de transgenes dentro de un solo vector, la expresión de transgenes puede estimularse mediante la administración del inductor químico tebufenozida.

Después de subclonar el EGFP o los transgenes ANKRD13A de acuerdo con el protocolo de texto, prepare cuatro placas de cultivo celular que contengan células HEK 293 recién pasadas en cinco mililitros de DMEM suplementado con 5 a 10% de FBS y antibióticos, que en lo sucesivo se denominará medio de cultivo. Mantenga las celdas a 37 grados centígrados. Cuando las células alcancen una densidad del 50 al 60%, agregue tres microlitros de reactivo de transfección a 200 microlitros de diluyente que contenga el ADN.

Después de incubar la reacción a temperatura ambiente durante 30 minutos, agregue la mezcla a las celdas HEK 293. Use dos platos para la transfección y deje los otros dos sin tratar como controles. Incubar las células a 37 grados centígrados durante 12 a 24 horas.

Después de la incubación, añadir Teb a una de las muestras transfectadas y a uno de los testigos testigos no transfectados. Deje las otras dos muestras sin tratar como controles experimentales. Incubar las placas durante 12 a 48 horas.

Si utiliza el inserto de EGFP, analice la expresión de EGFP bajo un microscopio fluorescente. De lo contrario, para recolectar las células para la inmunotransferencia, use PBS helado para enjuagar las células dos veces. Luego, use un raspador de celdas para sacarlos de la placa y transfiéralos a un tubo cónico de 15 mililitros.

A continuación, gire los tubos a 21.000 veces g y de 18 a 25 grados centígrados durante dos minutos. Luego, después de desechar el PBS, agregue 0,5 mililitros de reactivo de extracción de proteínas de mamíferos helado, o M-PER, e inhibidor de proteasa al pellet. Vuelva a suspender las células con varias rondas de pipeteo.

Luego, incube la suspensión celular a 18 a 25 grados centígrados y temperatura ambiente durante 15 minutos. Centrifugar el lisado celular a 21.000 veces g y cuatro grados centígrados durante 10 minutos. A continuación, transfiera el sobrenadante acuoso a un tubo de microcentrífuga nuevo de 1,5 mililitros y analícelo mediante inmunotransferencia con los anticuerpos adecuados.

Para apagar los estímulos de Teb, retire el medio de cultivo que contiene Teb de las células y use PBS precalentado para enjuagar las células dos veces. A continuación, añade un mililitro de tripsina/EDTA al 0,25% e incuba las células a 37 grados centígrados durante un minuto. Agregue 10 mililitros de medio de cultivo precalentado y sin Teb a las células y use un raspador de células para cosecharlas.

Transfiera las células a un tubo cónico de 15 mililitros. A continuación, haz girar las células a 21.000 veces g y de 18 a 25 grados centígrados durante dos minutos. Vuelva a suspender las células en 50 mililitros de medio de cultivo precalentado y sin Teb, y transfiera cinco mililitros de las células a tres placas de cultivo de células frescas de 60 milímetros.

Incubar las células a 37 grados centígrados durante 24, 48 y 72 horas, respectivamente. Finalmente, recoja las células en diferentes puntos de tiempo y mida los niveles de expresión del transgén mediante inmunotransferencia. En este experimento que evaluó la actividad y la permeabilidad de pEUI-plus-EGFP, los transfectantes vectoriales simulados no mostraron señal fluorescente independientemente del tratamiento con Teb.

Sin embargo, los transfectantes de pEUI-plus-EGFP se sensibilizaron progresivamente a la creciente cantidad de Teb. Y lo que es más importante, los transfectantes pEUI-plus-EGFP no tratados con Teb no provocaron ninguna señal de EGFP detectable. Se utilizó ANKRD13A etiquetado con FLAG para validar aún más la capacidad de respuesta de pEUI-plus a Teb.

Como se muestra en este Western blot con anticuerpos anti-FLAG, las células HEK 293 transfectadas mostraron una fuerte expresión de ANKRD13A después de un tratamiento de 24 horas con Teb. Además, la depleción de Teb demostró la reversibilidad del cambio del gen pEUI-plus, ya ANKRD13A ya no era detectable en células cultivadas sin Teb. Una vez dominada, esta técnica se puede realizar en una hora si se realiza correctamente.

Al intentar este procedimiento, es importante recordar que debe realizar casi todo el experimento en condiciones libres de gérmenes. Siguiendo este procedimiento, se pueden aplicar otros métodos, como el sistema Tet-On o Tet-Off, para expresar diferencialmente dos transgenes distintos. Tras su desarrollo, esta técnica allanó el camino para que los investigadores en el campo de la biología celular exploraran la fisiología molecular a nivel celular.

Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo usar el vector de cambio de gen pEUI-plus con el fin de inducir la expresión de transgenes en el momento deseado con la intensidad deseada. No olvide que trabajar con tebufenozida puede ser peligroso y siempre se deben tomar precauciones, como usar una bata de laboratorio, mientras se realiza este procedimiento.