Microinyección de Western gusano de raíz del maíz, Diabrotica virgifera virgifera, embriones para transformación de línea germinal, o edición del genoma CRISPR/Cas9

Presentamos aquí protocolos de recogida y microinjecting maíz occidental precellular embriones de gusano de la raíz con el fin de realizar análisis funcional genómica como transformación del germline CRISPR Cas9-genoma de edición.

El objetivo general de este protocolo de microinyección es modificar el genoma del gusano de la raíz del maíz occidental. Este método puede ayudar a responder preguntas clave sobre la biología del gusano de la raíz del maíz occidental y su capacidad para superar rápidamente los métodos de control de plagas como la toxina BT y el RANI. Además de los gusanos occidentales de la raíz del maíz, este método también se puede aplicar a especies similares, como los gusanos de la raíz del sur y del norte.

La primera vez que tuve la idea de este método fue cuando me pidieron que ayudara con la inyección de RANI en el gusano de la raíz del maíz occidental en los años 90. Por lo general, las personas nuevas en este método tendrán dificultades. Porque la cría de gusanos occidentales de la raíz del maíz en el laboratorio requiere mucha mano de obra.

Y las tasas de supervivencia siguen siendo bajas con la tecnología actual. Obtenga entre 500 y 1.000 adultos de gusano de la raíz no diaponizantes de una empresa o laboratorio de investigación confiable. Y alojarlos en jaulas de 30 centímetros cúbicos.

Almacene la dieta artificial estándar para gusanos de la raíz en recipientes de almacenamiento de alimentos de aproximadamente un centímetro de profundidad. La dieta no utilizada se puede almacenar a cuatro grados centígrados durante un máximo de dos meses. Para alimentar al gusano de la raíz, cargue placas de Petri de 100 centímetros con 10 a 15 gramos de dieta.

Cargue un plato de comida en cada jaula de gusanos de la raíz. Y reponerlo cuando el suministro se agote o la dieta se seque. También mantenga un depósito de agua de 300 mililitros, cubierto por una bola de algodón, en cada jaula para que sirva como fuente de agua.

Cambie el agua cuando se esté agotando. Mantenga el gusano de la raíz en jaula a 26 grados centígrados con un 60% de humedad y un ciclo de luz de 14/10 en una incubadora de cría de insectos. Ajuste la hora de apagar las luces más tarde en el día, como a la medianoche, para que los huevos se pongan antes de las horas de trabajo de la mañana.

Primero, recoge los embriones. Para una superficie de recolección de huevos, cargue una placa de Petri de 100 milímetros con 30 mililitros de agar al 1% y agua. A continuación, coloque una sola capa de papel de filtro sobre el agar, seguida de cuatro capas de gasa.

Cada capa debe cortarse a medida. A continuación, lo más tarde posible en el día, coloque la placa de recolección de huevos en la jaula del gusano de la raíz y cúbrala con una carpa de papel de aluminio. Luego, a la mañana siguiente, retire la cámara de recolección de huevos.

Use pinzas para recoger una capa de gasa a la vez y colóquela en un vaso de precipitados de 500 mililitros cargado con agua. Lave los huevos de la gasa revolviéndolos en el agua. Luego, use una pipeta de bulbo para transferir los huevos a otro vaso de precipitados con agua como paso de lavado.

Realice dos o tres lavados de esta manera. A continuación, deposita los huevos limpios sobre papel de filtro con la menor cantidad de agua posible. A continuación, prepare una diapositiva pegando un trozo de papel de filtro negro a la diapositiva para mejorar el contraste.

Luego, rocía líneas finas de pegamento no tóxico sobre el papel que se usará para asegurar los huevos. Mantén el pegamento por debajo de la circunferencia de un huevo. Mientras el pegamento está húmedo, usa un pincel fino para colocar los huevos en la línea de pegamento.

Mantenga al menos un huevo de distancia entre cada huevo. Prepare varias líneas de huevos por portaobjetos. Los óvulos ahora deben inyectarse dentro de los 30 minutos.

Ahora, combine el plásmido auxiliar, el plásmido donante y el tampón rojo de fenol. Utilice plásmidos súper enrollados de alta calidad hechos con un kit comercial libre de endotoxinas. Fortex brevemente para mezclar.

Y luego haga girar las partículas durante tres minutos a máxima velocidad. A continuación, rellene las agujas de vidrio de borosilicato extraídas con 0,5 a 1 microlitros de solución inyectable. Si se forman burbujas, asegúrese de eliminarlas.

A continuación, conecte la aguja de inyección al micromanipulador. Ahora, si es necesario, bajo el microscopio, rompa suavemente la punta de la aguja sellada con un par de pinzas finas o tocando suavemente la punta contra una barrera de vidrio. Trate de hacer la abertura más pequeña posible para liberar la solución inyectable.

Antes de inyectar los huevos del gusano de la raíz, use un pincel fino para humedecer cuidadosamente la superficie de uno a tres huevos preparados con agua estéril. A continuación, inyecta los embriones mojados. Inserte suavemente la aguja en el centro del embrión e inyecte un pequeño volumen de solución.

Comience usando de 10 a 13 psi de presión y ajuste la presión según sea necesario. Los embriones secos tienen una forma redonda distintiva, al humedecer previamente cada embrión con agua, cambiará su forma y ablandará la cáscara del huevo, lo que permitirá que la aguja penetre fácilmente. Un embrión inyectado con éxito tendrá una pequeña cantidad de color rojo.

Si un huevo está dañado, tiene un aspecto peculiar o no se puede inyectar, tritúralo o retíralo del portaobjetos. Después de inyectar todos los huevos, mueva el papel de filtro con los huevos a un plato de agar al 1%. Luego, selle el plato con una película de parafina e incube a 26 grados centígrados hasta que eclosionen las larvas.

12 días después de la inyección, comience a buscar larvas todos los días durante las próximas dos semanas. Transfiera las larvas con un cepillo fino a una caja de cría con maíz germinado y tierra para criarlas en condiciones estándar. La transformación de la línea germinal del gusano de la raíz se intentó mediante la coinyección de un plásmido portador de transposasa con un plásmido portador de transposones en embriones precelulares.

En los 26 supervivientes, cada expresión de EFP se utilizó para detectar la inserción de elementos del donante. Aunque se identificó la progenie toraz, el cribado de embriones de gusano de la raíz con la fuente de luz intensa resultó ser letal. La siguiente ronda de transformación de la línea germinal utilizó un gen de proteína fluorescente roja impulsado por un promotor constitutivamente activo de Drosophila melanogaster.

Las tasas de supervivencia mejoraron, pero solo se registró una larva DS roja positiva. A continuación, los embriones se microinyectaron con tampón solo o con plásmidos de ADN de donantes ayudantes y marcados con orescente. Una proporción similar de embriones eclosionados cuando se inyectaron solo plásmidos o tampón.

Y curiosamente, solo la mitad de los embriones no inyectados eclosionaron. Esto hizo que la letalidad de manipular los embriones para la inyección fuera tan alta como la de realizar la inyección. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo microinyectar embriones de Western Corn Rootwall.

Una vez dominados, se pueden inyectar de doscientos a trescientos embriones por hora mediante esta técnica. Este método es deudor de las técnicas desarrolladas para la transformación de la línea germinal de Drosophila melanogaster, que sirven como plantillas aplicables a muchas otras especies. Siguiendo este procedimiento, se pueden realizar otros métodos, como la edición del genoma basada en CRISPR/Cas9, para crear mutaciones específicas en el genoma de Western Corn Rootwall.

Con el fin de responder a preguntas específicas sobre la función del genoma.