Name: Microinyección de Western gusano de raíz del maíz, Diabrotica virgifera virgifera, embriones para transformación de línea germinal, o edición del genoma CRISPR/Cas9 (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-04-27T14:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 42 s
Description: Aprende la microinyección en embriones de Diabrotica virgifera virgifera para transformación de línea germinal y edición genómica CRISPR/Cas9. Este protocolo permite estudios funcionales en este importante insecto plaga del maíz.

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Este trabajo fue financiado por una beca del programa de investigación de Monsanto maíz Rootworm conocimiento, conceder fondos de puesta en marcha y número AG/1005 (para MDL y YC) a MDL de NCSU. FC fue apoyado por becas del programa de investigación de Monsanto maíz Rootworm conocimiento (AG/1005) y la National Science Foundation, grant número MCB-1244772 (para MDL). Los autores declaran a no hay intereses contrapuestos. FC y MDL concibieron y diseñado los experimentos; FC, PW y SP realizan los experimentos; MDL y analizaron los resultados; y FC, NG y MDL escribieron el manuscrito. Agradecemos a Teresa O'Leary, William Klobasa y Stephanie Gorski por su ayuda experto en investigación de la región del gran Caribe. También agradecemos a Dr. Wade French (USDA-ARS, Laboratorio Central de investigación agrícola del norte, Brookings, SD) para los envíos de huevos para establecer colonias de laboratorio y proporcionar protocolos de cría.

1. nivel de la colonia de cría de adultos de la región del gran Caribe
<ol><li>Obtener una cantidad suficiente de los adultos de la región del gran Caribe (500-1.000) de un laboratorio de investigación o empresa confiable (véase Tabla de materiales por ejemplo) y colocar en una jaula de 30 cm3 . Nota: Se recomienda uso de una cepa no diapausa.</li>
	<li>Preparar la dieta artificial WCR siguiendo el protocolo del fabricante y vierta una 1 cm de espesor capa en un recipiente de 38 oz (véase Tabla de materiales). Después de mezclar, guarde dieta sin usar a 4 ° C hasta por 2 meses.</li>
	<li>Poner un plato de Petri (100 x 15 mm) con dieta adultos (10-15 g) en una jaula de 30 cm3 . Añadir más dieta cuando la comida sea baja o seca.</li>
	<li>Coloque un matraz (300 mL) con agua, cubierto con una bola de algodón, que se utiliza para mantener en su lugar un trozo de algodón (6 "x 3/8"), para servir como una fuente de agua. Cambie el agua cuando está baja.</li>
	<li>Mantener la región del gran Caribe a 26 ° C con una humedad de 60% y un 14:10 luz del ciclo de un insecto que se cría la incubadora.</li>
</ol>2. alineación y la colección embrionaria
<ol><li>Hacer una cámara de recogida del huevo utilizando agar al 1% en agua estéril de 100 x 15 mm2 caja de Petri. Almacenar a 4 ° C después de que el agar se solidifica.</li>
	<li>Para recoger los huevos recién puestos, coloque una sola capa de papel de filtro, seguido por 4 capas de Gasa (cada corte a tamaño) en la superficie del agar (figura 1A). Nota: Estopilla se puede reutilizar, después de ser lavado en lejía y esterilizado, pero no es necesario hacer esto para el primer uso. Papel de filtro no debe ser reutilizado y no necesita ser esterilizado.</li>
	<li>Coloque la placa de colección de huevo en jaula de la región del gran Caribe como tarde en el día como sea posible (final de la jornada de trabajo) y cubrir con una carpa de papel de estaño. Dejar durante la noche. Nota: Tener las luces encendidas de 10:00 a la ponedora de retrasos de 12 de la mañana (14 h), facilitando así la recolección de huevos más jóvenes para microinyección sin necesidad de personal de laboratorio colocar cámara de recogida en jaula por la noche.</li>
	<li>Retire la cámara de colección de huevo alrededor de 8 o 9:00</li>
	<li>Use pinzas para recoger 1 capa de estopilla en tiempo y lugar en un vaso de precipitados (500 mL) de agua. Lavar huevos de estopilla agitando suavemente (figura 1B y 1C).</li>
	<li>Use una pipeta de bulbo para transferir huevos otro vaso de precipitados (500 mL) de agua. Repetir 2-3 x para limpiar los huevos.</li>
	<li>Utilizar la pipeta de bulbo para transferir huevos en papel de filtro (figura 1) y reducir al mínimo la cantidad de remanente de agua.</li>
	<li>Cortar papel filtro negro tiras tan amplia como una diapositiva de cristal y cinta firmemente al portaobjetos para asegurarse de que el libro pone plana (figura 2A). Nota: Papel filtro negro ayuda a mejorar la visibilidad en el microscopio al reducir la cantidad de luz reflejada.</li>
	<li>Aplicar pegamento no tóxico (véase Tabla de materiales por ejemplo) para el papel de filtro en las líneas finas (figura 2B). Mantener las líneas de cola más delgada que el diámetro de un huevo para evitar que los huevos con pegamento.</li>
	<li>Utilizar un pincel fino para mover suavemente huevos WCR uno por uno desde su papel de filtro a la línea de pegamento. Trate de poner los huevos sobre el pegamento antes de se seca y mantener la distancia de por lo menos un huevo entre cada huevo.</li>
	<li>Maximizar la eficiencia de la inyección mediante la colocación de múltiples líneas de huevos en la diapositiva de un papel de filtro (figura 3).</li>
	<li>Después de todos los huevos se ponen hacia fuera en el papel de filtro, espere hasta que el pegamento se seque antes de microinyección. Nota: Para la transformación de la línea germinal y para la edición genómica CRISPR/Cas9-mediada, inyectar todos los embriones al mediodía (12:00) para que el embrión más viejo es viejo no más de 19 h. Sin embargo, para RNAi, hay ninguna limitación de tiempo porque en RGC, dsRNA puede moverse entre células. De hecho, para RNAi, embriones envejecimiento podrían resultar en mejores tasas de supervivencia.</li>
</ol>3. preparación de plásmido DNAs y agujas de inyección
<ol><li>Preparación de ADN plasmídico superenrollado de alta calidad mediante un comercial libre de endotoxina kit (véase Tabla de materiales por ejemplo).</li>
	<li>Para preparar la solución de la inyección, Compruebe la concentración de cada plásmido y luego combinar plásmido helper (concentración final de 250 ng/μL), plásmido donante (concentración final de 750 ng/μL) y buffer de rojo de fenol (concentración final de 20%). Mezclar la solución brevemente y centrifugar durante 3 minutos en velocidad máxima para precipitar partículas que podrían obstruir la aguja.</li>
	<li>Tire las agujas de vidrio borosilicato (O.D. 1 mm I.D. 0,58 mm, longitud 10 cm) usando un extractor de micropipeta tipo llamas/marrón. Para el almacenamiento, asegurar agujas tiradas sobre la cinta adhesiva de doble cara en una placa de Petri u otro recipiente transparente. Nota: Para el sistema de tirador de la micropipeta, los valores utilizados fueron: calor = 335, FIL = 4, VEL = 40, DEL = 200, PUL = 100.</li>
	<li>Relleno la aguja de inyección utilizando un cargador de micro punta (véase Tabla de materiales) de pipetear 0,5 - 1,0 μL abajo dentro de la aguja, cerca de la punta cónica. Elimine las burbujas de la punta de la aguja si se produce alguna.</li>
	<li>Inserte la aguja en el portaagujas.</li>
	<li>Abra la punta de la aguja rompiendo suavemente con un buen par de pinzas, o tocar/arrastrando suavemente la punta sobre el portaobjetos cubreobjetos o vidrio. Nota: La meta es que la abertura más pequeña que permite la mezcla de inyección volver a salir (las aberturas más pequeñas generalmente requieren mayor presión de inyección). Agujas biseladas no requieren este paso puesto que ya están abiertas.</li>
</ol>4. microinyección y el cuidado después de la inyección
<ol><li>Con un pincel fino, humedezca la superficie de 1-3 huevos con agua estéril con cuidado Inserte la aguja e inyectar la solución. Inyectar cada huevo antes de que se seque la superficie. Busque la aparición una pequeña cantidad de color rojo dentro de huevos durante la inyección para indicar que la exitosa microinyección. Aplastar o eliminar los huevos que parecen dañados, vacío, o de lo contrario no inyectar. Nota: Aunque la presión de la inyección varía dependiendo de tamaño de alesaje de la aguja, 10-13 psi es un buen punto de partida.</li>
	<li>Después se inyectan todos los huevos, quitar el papel de filtro de lo portaobjetos de vidrio.</li>
	<li>Coloque el papel de filtro sobre la superficie de un plato de agar al 1% (ver arriba).</li>
	<li>Use película de parafina plástico para sellar el plato y poner en un insecto de 26 ° C la incubadora de cría durante 12 días. Nota: La película de parafina le ayudará a evitar la contaminación del molde entre platos. Sin embargo, cualquier otro tratamiento para prevenir el crecimiento de bacterias y moho podría reducir la supervivencia de los embriones inyectados.</li>
</ol>5. cultivo e incubación de embriones
<ol><li>Iniciar control de embriones 12 días después de la inyección para las larvas recién nacidas y continuar diariamente durante 2 semanas.</li>
	<li>Transferencia de larvas, utilizando un pincel fino, a una caja de cría con germinado de maíz y el suelo. Nota: Molde podría crecer en el plato de agar, pero las larvas eclosionan aún en la mayoría de los casos. Busque larvas cuidadosamente en el molde para cogerlos todos. Algunas larvas pueden pasar a la tapa del plato y pueden atascarse en la condensación.</li>
	<li>Posterior de las larvas a 26 ° C siguiendo el estándar WCR cría métodos25.</li>
</ol>

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</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

Aunque microinyección de WCR con dsRNAs para RNAi ha reportado9, este es el primer protocolo para establecer las mejores prácticas para microinjecting precellular embriones de la región del gran Caribe, un proceso crítico para llevar a cabo la transformación del germline o CRISPR/Cas9 genoma de esta especie. Exitosa microinyección de embriones WCR es dependiente en muchos factores, como es la eficiencia de transformación. A continuación algunos de los principales problemas afectan el resultado de ...

Rootworm occidental del maíz (RGC), Diabrotica virgifera virgifera, es una plaga importante del maíz1. Curiosamente, WCR parece superar el control de las medidas más rápidamente que las plagas agrícolas más ya que ellos no sólo adaptan fisiológicamente sino también su comportamiento2,3,4,5, 6. en la última década, ARN de interferencia (RNAi), una poderosa herramienta genómica funcional, ha sido investigada como un posible método de control RCM7,8y también se ha utilizado como un medio para el estudio de la función del gen9. Sin embargo, mientras que el ARNi es realizada con frecuencia por microinyección de ARN bicatenario (dsRNA) en otras especies, ARNi basada en inyección es raro en RGC. De hecho, hay solamente algunos informes de RNAi vía microinyección de dsARN en RGC9. La razón es que RCM puede alcanzar niveles altos de gene precipitación a través de la ingestión de dsARN7,10, permitiendo incluso el estudio de efectos embrionarios de dsRNA de alimentación a la madre11. Mientras que este método hace WCR un excelente tema para análisis genómico funcional mediante RNAi, ha ralentizado el progreso en el desarrollo de metodologías para la microinyección embrionario en esta especie.
A pesar del poder de RNAi, existen algunas desventajas. Por ejemplo, no todos los genes responden igualmente a ARNi. Esta variabilidad puede hacer interpretación de los resultados de un análisis de genómica funcional más difícil. Además, ARNi es transitoria y no genera mutaciones heredables. Por otro lado, la transformación del germline, otra herramienta genómica funcional, puede generar mutaciones heredables mediante inserción de un elemento marcado transponibles en el genoma12,13. Esto hace del germline transformación una excelente herramienta para la creación de estirpes mutantes para el uso en los estudios genéticos a largo plazo. Transformación puede utilizarse también para rescatar una mutación mediante la entrega de una copia funcional del gen a un genoma mutante14. Por otra parte, la transformación del germline es la piedra angular de una gran variedad de técnicas de genética molecular. Además de noquear o rescatar la función del gene, transformación de la línea germinal puede utilizarse para potenciador captura15, gen captura16, Gal4-basado de la expresión ectópica17y genoma mutagénesis18.
Más recientemente, han desarrollado herramientas que permiten la edición del genoma sofisticado. Estas herramientas incluyen la transcripción Activator-Like efectoras nucleasas (jugadores) y el sistema CRISPR/Cas9-nucleasa19,20. La ventaja de estas nuevas herramientas es que ofrecen a los investigadores la capacidad para inducir una rotura de ADN de doble hebra en casi cualquier ubicación a casi cualquier genoma. Una vez inducida, estas roturas pueden repararse a través de ambos extremos no homóloga unirse a, que pueden introducir supresiones o inserciones en el gen específica, o reparación dirigida por homología, que en presencia de una construcción de ingeniería, puede catalizar la reemplazo de genes enteros o regiones genéticas21,22. Sin embargo, estos métodos requieren microinyección de DNA, RNA o proteínas en embriones muy jóvenes.
Lo importante, a diferencia de los dsARNs utilizados para RNAi, ácidos nucleicos y proteínas utilizadas para germline transformación y la edición del genoma no pueden fácilmente cruzar las membranas celulares. Por lo tanto, microinyección de ADN plásmido, mRNAs y proteínas debe ocurrir durante la etapa del blastoderm sincitial (es decir, antes de que el embrión insecto cellularizes). Esto hace que la sincronización de las inyecciones de un factor crítico. Por ejemplo, en Drosophila melanogaster, embriones deban ser inyectado dentro de dos horas después de huevo ponga12. Por lo tanto, el desarrollo de un protocolo exitoso microinjection embrionario para RGC debe tener en cuenta las mejores condiciones para la colocación del óvulo, así como el mejor método para la recolección de suficientes cantidades de embriones precellular.
Un esfuerzo para traer una amplia gama de herramientas genéticas moleculares en biología de la región del gran Caribe requiere desarrollar métodos para la recogida y microinjecting precellular embriones de RGC. Aquí proporcionamos instrucciones detalladas, junto con consejos y sugerencias, para ayudar a otros a utilizar técnicas basadas en la transformación en la investigación de la región del gran Caribe. Además de extender Tecnologías transgénicas a RGC para su uso en estudios de genómica funcional, estas técnicas también permiten potentes nuevas estrategias de control de plagas como gen unidad23,24 a probarse en esta importancia económica plaga.

<table><tbody><tr><td>Papel de filtro cualitativo (negro)</td><td>Ahlstrom</td><td>8613-0900</td><td>Para microinyección de huevos</td></tr><tr><td>1 oz Contenedores&nbsp;</td><td>Vajilla de plástico Anny's</td><td>ASET101</td><td>contenedor de huevos</td></tr><tr><td>Drosophila Agar Tipo II</td><td>Apex</td><td>66-103</td><td>Sustrato para plato de puesta de huevos WCR</td></tr><tr><td>Pinzas de peso pluma&nbsp;</td><td>Bioquip</td><td>4748</td><td>Manejo de larvas y pupas&nbsp;</td></tr><tr><td>Clorox Regular-Bleach1</td><td>Clorox</td><td>44600-30770</td><td>Lavar el maíz y los platos</td></tr><tr><td>El favorito del camionero Yellow</td><td>Coor Farm Supply</td><td>502</td><td>Maíz para alimentación Sistema</td></tr> de <tr><td>microinyección WCR (Hecho en casa)</td><td>NA</td><td>Piezas e instrucciones disponibles a pedido Controla</td> la <td>presión de inyección (0-20 psi)</td></tr><tr><td>Elmer's Pegamento no tóxico Elmer's Products</td><td>, Inc.</td><td>E304</td><td>Pegar huevos en papel de filtro</td></tr><tr><td>epTIPS Puntas de microcargador</td><td>Eppendorf</td><td>C2554691</td><td>Relleno Aguja de carga Platos</td></tr><tr>de<td>cultivo de tejidos Falcon</td><td></td><td>Falcon 25383-103</td><td>Maíz germinado /150 x 25 mm</td></tr><tr><td>Fisherbrand&nbsp; Círculos de papel de filtro de grado cuantitativo Fisher</td><td>Scientific</td><td>S47576C</td><td>Hacer plato de agar para puesta de huevos/9cm</td></tr><tr><td>Sparkleen</td><td>Fisher Scientific</td><td>04-320-4</td><td>Lavar platos</td></tr><tr><td>Portaobjetos de microscopio simple</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-549-3</td><td>Sujetar papel de filtro y huevos para microinyección</td></tr><tr><td>Gusano de la raíz del maíz occidental sin sustituto del polen</td><td>Ciencias Agrícolas de Frontera&nbsp;</td><td>F9766B</td><td>WCR Adulto</td></tr><tr><td>Dieta Artificial Bolas de Algodón,</td><td>Grandes Genesee Scientific 51-101</td><td></td><td>Cerrar el matraz</td></tr><tr><td>Globe Scientific 3.0 mL Pipetas de Transferencia de Bulbo Pequeño</td><td>Globe Scientific 137035</td><td></td><td>Recolectar y transferir huevos</td></tr><tr><td>Leica M165 FC Microscopio estereoscópico de fluorescencia&nbsp;</td><td>Leica</td><td>M165 FC&nbsp;</td><td>Proyección de WCR</td></tr><tr><td>Juego de filtros DsRed para microscopio estereoscópico de fluorescencia</td><td>Leica</td><td>DSR</td><td>Filtro de excitación: 510-560 nm, filtro de emisión: 590-650 nm</td></tr><tr><td>Filtro EGFP</td><td>Leica</td><td>GFP2</td><td>Filtro de excitación: 440&ndash; 520 nm, filtro de emisión: 510 nm</td></tr><tr><td>BugDorm</td><td>MegaView Science</td><td>DP1000_5P</td><td>Jaula para colonia adulta</td></tr><tr><td>Pincel miniatura</td><td>MyArtscape</td><td>MAS-102-MINI</td><td>Liner 2/0&nbsp;</td></tr><tr><td>Joystick Micromanipulador</td><td>Narishige</td><td>MN-151</td><td>Micromanipulador y portaagujas</td></tr><tr><td>Microscopio XY</td><td>Stage Olympus</td><td>265515</td><td>Platina de microscopio (adaptado para su uso con estereoscopio)</td></tr><tr><td>Grado 90 Estopilla</td><td>Tienda Online de Telas</td><td>CHEE90</td><td>Para la puesta de huevos</td></tr><tr><td>Película de parafina de plástico&nbsp;</td><td>Empaque de plástico Pechiney</td><td>PM-996</td><td>Sellar la placa de agar después de la microinyección/Tamaño del rollo 4 pulgadas x 125 pies</td></tr><tr><td>Incubadora Percival</td><td>Percival&nbsp;</td><td>I41VLH3C8</td><td>Cámara de cultivo WCR (incubadora de cría de insectos)</td></tr><tr><td>Matraces Erlenmeyer de boca estrecha</td><td>VWR</td><td>4980-300-PK</td><td>Contenedor de agua para colonia de adultos&nbsp;</td></tr><tr><td>Vasos de precipitados Griffin Low Form</td><td>VWR</td><td>1000-600-PK</td><td>Para huevo batido</td></tr><tr><td>Rollos de algodón trenzado</td><td>Richmond Dental Cotton Co.</td><td>605-3599</td><td>Uso en el suministro de agua para colonias adultas&nbsp;</td></tr><tr><td>Placas de Petri (35x10mm)</td><td>SIGMA</td><td>CLS430588-500EA</td><td>Para placas dietéticas</td></tr><tr><td>Phenol Red</td><td>Sigma</td><td>143-78-8</td><td>Tampón de microinyección</td></tr><tr><td>Extractor de micropipiette basado en láser Instrumento</td><td>Sutter P-2000/G Tirador de</td><td>aguja/Calor = 335, FIL = 4, VEL = 40, DEL = 200, PUL = 100</td><td></td></tr><tr><td>Capa superior de tierra superior</td><td>The Scotts Company 71130758</td><td></td><td>Suelo para el cultivo</td></tr> <tr><td>de cronReloc Zippit 2 Mil Bolsas con Cremallera</td><td>United States Plastic Corporation</td><td>48342</td><td>Bolsa Placa de agar después de la microinyección/5x7</td></tr><tr><td>Placas de Petri (100x15m)</td><td>VWR</td><td>89038-968</td><td>Fabricación de placa de agar para puesta de huevos/ 100 x 15 mm</td></tr><tr><td>Contenedores de 6 oz</td><td>Webstaurantstore</td><td>128E506</td><td>WCR cámara de acoplamiento de un solo par&nbsp;</td></tr><tr><td>Contenedores de 38 oz</td><td>Webstaurantstore</td><td>128NC888</td><td>Caja de cría de larvas/38 oz</td></tr><tr><td>ChoiceHD 16 oz. Contenedor de plástico translúcido para microondas</td><td>Webstaurantstore</td><td>128HRD16</td><td>Caja de cría de larvas/16 oz</td></tr><tr><td>Alcance de microinyección&nbsp;</td>Endoscopio de microinyección <td>Wild Heerbrugg</td><td>WILD-M8</td><td>equipado con una etapa XY</td></tr><tr><td>Capilares de vidrio estándar</td> World <td>Precision Instruments</td><td>1B100F-4</td><td>Agujas de microinyección</td></tr><tr><td>Gusanos de la raíz del maíz occidental adulto Laboratorio de</td><td>investigación aqricultural central del norte</td><td>Cepa sin diapasa</td><td>Solicitud del laboratorio del Dr. Bryan Wade French</td></tr><tr><td>ADN plasmídico Midi Kit</td><td>Qiagen</td><td>12143</td><td>Purificación de ADN plásmido listo para inyección</td></tr></tbody></table>

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Microinjection of Western Corn Rootworm, Diabrotica virgifera virgifera, Embryos for Germline Transformation, or CRISPR/Cas9 Genome Editing

El rootworm occidental del maíz (RGC) es una plaga importante del maíz y es bien conocido por su capacidad para adaptarse rápidamente a estrategias de manejo de plagas. Aunque el ARN de interferencia (ARNi) ha demostrado para ser una poderosa herramienta para estudiar la biología de la región del gran Caribe, tiene sus limitaciones. Específicamente, ARNi sí mismo es transitorio (es decir, no resulta en la herencia mendeliana a largo plazo del fenotipo asociado), y requiere conocer la secuencia de ADN del gen objetivo. Este último puede ser limitante si el fenotipo de interés está controlado por genes mal conservados, o incluso novela, porque sería difícil identificar objetivos útiles, si no imposible. Por lo tanto, debería ampliarse el número de herramientas de herramientas genómicas de RGC por el desarrollo de métodos que podrían utilizarse para crear cepas mutantes estables y activar encuestas independientes de la secuencia del genoma del RGC. En este documento, se detallan los métodos utilizados para recoger y microinject precellular embriones WCR con ácidos nucleicos. Mientras que los protocolos descritos tienen como objetivo la creación de transgénico WCR, CRISPR Cas9-genoma edición podría también realizarse utilizando los mismos protocolos, con la única diferencia es la composición de la solución inyectada en los embriones.

Una consideración importante en el desarrollo de este protocolo fue la etapa del desarrollo embrionario en el momento de microinyección. Transformación del germline requiere específicamente, microinyección de ADN antes de la cellularization embrionaria. Esto es porque el ADN no puede cruzar fácilmente las membranas celulares. Para visualizar las etapas del desarrollo embrionario de la región del gran Caribe mediante una tinción nuclear las tentativas eran fracasadas porque dechorionation ...

Presentamos aquí protocolos de recogida y microinjecting maíz occidental precellular embriones de gusano de la raíz con el fin de realizar análisis funcional genómica como transformación del germline CRISPR Cas9-genoma de edición.

Microinyección de Western gusano de raíz del maíz, Diabrotica virgifera virgifera, embriones para transformación de línea germinal, o edición del genoma CRISPR/Cas9

The western corn rootworm (WCR) is an important pest of corn and is well known for its ability to rapidly adapt to pest management strategies. Although ...

El objetivo general de este protocolo de microinyección es modificar el genoma del gusano de la raíz del maíz occidental. Este método puede ayudar a responder preguntas clave sobre la biología del gusano de la raíz del maíz occidental y su capacidad para superar rápidamente los métodos de control de plagas como la toxina BT y el RANI. Además de los gusanos occidentales de la raíz del maíz, este método también se puede aplicar a especies similares, como los gusanos de la raíz del sur y del norte.La primera vez que tuve la idea de este método fue cuando me pidieron que ayudara con la inyección de RANI en el gusano de la raíz del maíz occidental en los años 90. Por lo general, las personas nuevas en este método tendrán dificultades. Porque la cría de gusanos occidentales de la raíz del maíz en el laboratorio requiere mucha mano de obra.Y las tasas de supervivencia siguen siendo bajas con la tecnología actual. Obtenga entre 500 y 1.000 adultos de gusano de la raíz no diaponizantes de una empresa o laboratorio de investigación confiable. Y alojarlos en jaulas de 30 centímetros cúbicos.Almacene la dieta artificial estándar para gusanos de la raíz en recipientes de almacenamiento de alimentos de aproximadamente un centímetro de profundidad. La dieta no utilizada se puede almacenar a cuatro grados centígrados durante un máximo de dos meses. Para alimentar al gusano de la raíz, cargue placas de Petri de 100 centímetros con 10 a 15 gramos de dieta.Cargue un plato de comida en cada jaula de gusanos de la raíz. Y reponerlo cuando el suministro se agote o la dieta se seque. También mantenga un depósito de agua de 300 mililitros, cubierto por una bola de algodón, en cada jaula para que sirva como fuente de agua.Cambie el agua cuando se esté agotando. Mantenga el gusano de la raíz en jaula a 26 grados centígrados con un 60% de humedad y un ciclo de luz de 14/10 en una incubadora de cría de insectos. Ajuste la hora de apagar las luces más tarde en el día, como a la medianoche, para que los huevos se pongan antes de las horas de trabajo de la mañana.Primero, recoge los embriones. Para una superficie de recolección de huevos, cargue una placa de Petri de 100 milímetros con 30 mililitros de agar al 1% y agua. A continuación, coloque una sola capa de papel de filtro sobre el agar, seguida de cuatro capas de gasa.Cada capa debe cortarse a medida. A continuación, lo más tarde posible en el día, coloque la placa de recolección de huevos en la jaula del gusano de la raíz y cúbrala con una carpa de papel de aluminio. Luego, a la mañana siguiente, retire la cámara de recolección de huevos.Use pinzas para recoger una capa de gasa a la vez y colóquela en un vaso de precipitados de 500 mililitros cargado con agua. Lave los huevos de la gasa revolviéndolos en el agua. Luego, use una pipeta de bulbo para transferir los huevos a otro vaso de precipitados con agua como paso de lavado.Realice dos o tres lavados de esta manera. A continuación, deposita los huevos limpios sobre papel de filtro con la menor cantidad de agua posible. A continuación, prepare una diapositiva pegando un trozo de papel de filtro negro a la diapositiva para mejorar el contraste.Luego, rocía líneas finas de pegamento no tóxico sobre el papel que se usará para asegurar los huevos. Mantén el pegamento por debajo de la circunferencia de un huevo. Mientras el pegamento está húmedo, usa un pincel fino para colocar los huevos en la línea de pegamento.Mantenga al menos un huevo de distancia entre cada huevo. Prepare varias líneas de huevos por portaobjetos. Los óvulos ahora deben inyectarse dentro de los 30 minutos.Ahora, combine el plásmido auxiliar, el plásmido donante y el tampón rojo de fenol. Utilice plásmidos súper enrollados de alta calidad hechos con un kit comercial libre de endotoxinas. Fortex brevemente para mezclar.Y luego haga girar las partículas durante tres minutos a máxima velocidad. A continuación, rellene las agujas de vidrio de borosilicato extraídas con 0,5 a 1 microlitros de solución inyectable. Si se forman burbujas, asegúrese de eliminarlas.A continuación, conecte la aguja de inyección al micromanipulador. Ahora, si es necesario, bajo el microscopio, rompa suavemente la punta de la aguja sellada con un par de pinzas finas o tocando suavemente la punta contra una barrera de vidrio. Trate de hacer la abertura más pequeña posible para liberar la solución inyectable.Antes de inyectar los huevos del gusano de la raíz, use un pincel fino para humedecer cuidadosamente la superficie de uno a tres huevos preparados con agua estéril. A continuación, inyecta los embriones mojados. Inserte suavemente la aguja en el centro del embrión e inyecte un pequeño volumen de solución.Comience usando de 10 a 13 psi de presión y ajuste la presión según sea necesario. Los embriones secos tienen una forma redonda distintiva, al humedecer previamente cada embrión con agua, cambiará su forma y ablandará la cáscara del huevo, lo que permitirá que la aguja penetre fácilmente. Un embrión inyectado con éxito tendrá una pequeña cantidad de color rojo.Si un huevo está dañado, tiene un aspecto peculiar o no se puede inyectar, tritúralo o retíralo del portaobjetos. Después de inyectar todos los huevos, mueva el papel de filtro con los huevos a un plato de agar al 1%. Luego, selle el plato con una película de parafina e incube a 26 grados centígrados hasta que eclosionen las larvas.12 días después de la inyección, comience a buscar larvas todos los días durante las próximas dos semanas. Transfiera las larvas con un cepillo fino a una caja de cría con maíz germinado y tierra para criarlas en condiciones estándar. La transformación de la línea germinal del gusano de la raíz se intentó mediante la coinyección de un plásmido portador de transposasa con un plásmido portador de transposones en embriones precelulares.En los 26 supervivientes, cada expresión de EFP se utilizó para detectar la inserción de elementos del donante. Aunque se identificó la progenie toraz, el cribado de embriones de gusano de la raíz con la fuente de luz intensa resultó ser letal. La siguiente ronda de transformación de la línea germinal utilizó un gen de proteína fluorescente roja impulsado por un promotor constitutivamente activo de Drosophila melanogaster.Las tasas de supervivencia mejoraron, pero solo se registró una larva DS roja positiva. A continuación, los embriones se microinyectaron con tampón solo o con plásmidos de ADN de donantes ayudantes y marcados con orescente. Una proporción similar de embriones eclosionados cuando se inyectaron solo plásmidos o tampón.Y curiosamente, solo la mitad de los embriones no inyectados eclosionaron. Esto hizo que la letalidad de manipular los embriones para la inyección fuera tan alta como la de realizar la inyección. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo microinyectar embriones de Western Corn Rootwall.Una vez dominados, se pueden inyectar de doscientos a trescientos embriones por hora mediante esta técnica. Este método es deudor de las técnicas desarrolladas para la transformación de la línea germinal de Drosophila melanogaster, que sirven como plantillas aplicables a muchas otras especies. Siguiendo este procedimiento, se pueden realizar otros métodos, como la edición del genoma basada en CRISPR/Cas9, para crear mutaciones específicas en el genoma de Western Corn Rootwall.Con el fin de responder a preguntas específicas sobre la función del genoma.

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Este video describe la microinyección, un método común para crear cepas transgénicas de C. elegans. En el ejemplo, veremos el uso de la microinyección para introducir un complejo de ribonucleoproteína (RNP) para la edición de genes con bases CRISPR.

Microinyección de gónadas: un método de administración de compuestos directamente en la línea germinal de C. elegans

La mosca mediterránea de la fruta (mosca del mediterráneo) Ceratitis capitata (Diptera: Tephritidae) es una plaga mundial de la agricultura. Una comprensión más profunda de su biología es clave para controlar las poblaciones de moscamed y, por lo tanto, reducir el impacto económico. La microinyección embrionaria es una herramienta fundamental que permite tanto la transformación de la línea germinal como los estudios de genética inversa en esta especie.

Entrega de ácidos nucleicos mediante microinyección de embriones en el Mundial de la Agricultura de plagas de insectos,<em&gt; Ceratitis capitata</em

Microinyección de embriones de Nasonia vitripennis es un método esencial para la generación de modificaciones heredables del genoma. Se describe aquí es un procedimiento detallado para la microinyección y el trasplante de embriones de Nasonia vitripennis , que facilitará grandemente la manipulación del genoma futuro en este organismo.

Microinyección de embriones y la técnica de trasplante para la manipulación del genoma de Nasonia vitripennis

Este protocolo describe procedimientos de microinyección para embriones de Culex quinquefasciatus que están optimizados para trabajar con herramientas de edición de genes CRISPR/Cas9. Esta técnica puede generar de manera eficiente mutaciones de la línea germinal heredables y específicas del sitio que se pueden usar para construir tecnologías genéticas en este vector de enfermedad poco estudiado.

Técnicas de microinyección embrionaria para una mutagénesis eficiente site-specific en Culex quinquefasciatus

Proporcionamos un protocolo detallado para la cría, microinjección de huevos y para el apareamiento eficiente del firebrat Thermobia domestica para generar y mantener cepas mutantes después de la edición del genoma.

Microinyección de óvulos y apareamiento eficiente para la edición del genoma en la thermobia doméstica de firebrat

Aquí, se describen los métodos para las inyecciones pupales y adultos eficientes en Nasonia vitripennis como alternativas accesibles a la microinyección embrionaria, lo que permite el análisis funcional de los genes de interés utilizando ya sea arn-silenciamiento a través de la interferencia de ARN (RNAi) o knockout gen a través de CRISPR / Cas9 edición del genoma.

Inyecciones pupales y para adultos para RNAi y edición de genes CRISPR en Nasonia vitripennis

Este protocolo detalla los pasos de crispr/cas9 mutagénesis dirigida en moscas de arena: recolección de embriones, inyección, cría de insectos e identificación, así como selección de mutaciones de interés.

Mosca de arena (Phlebotomus papatasi) Microinjeción embrionaria para CRISPR/Cas9 Mutagenesis

Muchas características de la eusocialidad de los insectos se basan en la comunicación dentro de la colonia y la división del trabajo. La manipulación genética de genes reguladores clave en embriones de hormigas a través de microinyección y mutagénesis mediada por CRISPR proporciona información sobre la naturaleza del comportamiento altruista en insectos eusociales.

Inyecciones de embriones para la mutagénesis mediada por CRISPR en el saltador de la hormiga Harpegnathos

Aquí se presenta un protocolo de microinyección embrionaria de Helicoverpa armigera (Hübner) e identificación de mutantes knockout creado por la edición del genoma CRISPR / Cas9. Los insectos mutantes permiten una mayor investigación de la función génica y la interacción entre diferentes genes in vivo.

Microinyección embrionaria e identificación de mutantes knockout de Helicoverpa armigera editada por el genoma CRISPR/Cas9 (Hübner)

Aquí hay protocolos para recolectar y microinyectar embriones precelulares de saltamontes de maíz con el fin de modificar su genoma a través de la edición del genoma basada en CRISPR / Cas9 o para la adición de elementos transponibles marcados a través de la transformación de la línea germinal.

Microinyección de saltamontes de maíz, Peregrinus maidis, embriones para la edición del genoma CRISPR/Cas9

Este artículo demuestra la ingeniería genómica mediada por CRISPR-Cas9 en Steinernema hermaphroditum, un nematodo entomopatógeno (EPN: insectoparasito) y un modelo genético emergente. La tecnología descrita es útil para crear mutantes, permitiendo la elucidación de funciones génicas en la biología de los nematodos relevantes para la simbiosis mutualista y parasitaria.

Mutagénesis basada en CRISPR-Cas9 en el nematodo entomopatógeno Steinernema hermaphroditum y el mantenimiento de líneas mutantes

Aprende la microinyección en embriones de Diabrotica virgifera virgifera para transformación de línea germinal y edición genómica CRISPR/Cas9. Este protocolo permite estudios funcionales en este importante insecto plaga del maíz.

Microinyección de Western gusano de raíz del maíz, Diabrotica virgifera virgifera, embriones para transformación de línea germinal, o edición del genoma CRISPR/Cas9 (Video) | JoVE Journal

Microinyección de Western gusano de raíz del maíz, Diabrotica virgifera virgifera, embriones para transformación de línea germinal, o edición del genoma CRISPR/Cas9

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