Gene-dirigido mutagénesis al azar para seleccionar a mutantes de proteasoma desestabilizadoras de la heterocromatina en la levadura de fisión

El objetivo general de esta mutagénesis aleatoria es detectar mutaciones que desestabilizan la heterocromatina. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la heterocromatina, como los factores que regulan la formación y el mantenimiento de la heterocromatina. La principal ventaja de esta técnica es que puede dirigirse específicamente a un gen deseado para la mutagénesis, incluso si el gen es esencial.

Para empezar, prepare extracto de levadura con suplementos, o SÍ, sin adenina, Pombe Glutamato Medium, o PMG, y PMG sin adenina, mezclando los componentes como se muestra en esta tabla. Después de esterilizar en autoclave y agregar G418 si es necesario, revuelva el medio durante otros cinco a diez minutos. Luego, alícuota de los medios en placas de Petri de 90 mililitros y almacene las placas a cuatro grados centígrados.

Utilizando el rpt4 positivo clonado, con sus cinco UTR primos y tres primos y mutación silenciosa, así como los cebadores p5 y p6 y una polimerasa especial, diseñada para generar una alta tasa de error, se realizan PCR propensas a errores en un volumen total de 50 microlitros. Después de generar un constructo de transformación-fusión, de acuerdo con el protocolo de texto, inocule diez mililitros de medio YES con levadura e incube durante más de 16 horas hasta la saturación. Utilice 200 mililitros de medio YES para diluir las células a un OD600 de 0,2, e incubar el cultivo a 30 grados centígrados agitando durante cinco o seis horas hasta un OD600 de 0,6 a 0,8.

Calcule el volumen de celdas que suman OD600 de 30. Luego, dispense las células en cuatro tubos cónicos de 50 mililitros y enfríelos en hielo durante 10 minutos. Recolectar las células por centrifugación a 1050 G y cuatro grados centígrados durante tres minutos.

A continuación, coloque los tubos de microfuga con ADN de casete y 10 electro cubetas en hielo. Mientras aún está en hielo, deseche el sobrenadante y agregue 15 mililitros de sorbitol 1.2 molar, agite suavemente los tubos para volver a suspender las células, luego centrifugue las células a 1050 G y cuatro grados Celsius durante tres minutos. Deseche el sobrenadante y realice un segundo lavado con sorbitol.

Después de la centrifugación, deseche el sobrenadante. Luego, vuelva a suspender las células y recójalas todas en un tubo cónico de 15 mililitros. A continuación, añade sorbitol 1,2 molar hasta 2,4 mililitros.

Mantenga el tubo de células en hielo. A continuación, añada 200 microlitros de células suspendidas con sorbitol a un tubo que contenga la construcción de PCR de fusión, mezcle bien y transfiera la muestra a una electrocubeta. Es importante no utilizar una cantidad excesiva de casete de PCR, ya que dará errores de descarga.

Electroporar las celdas usando las siguientes opciones:agregue 600 microlitros de sorbitol 1.2 molar a cada electrocubeta para un volumen total de 800 microlitros. Luego, extienda las células en cuatro placas SÍ. Incubar las placas a 30 grados centígrados durante 24 horas.

A continuación, realice la réplica de la siembra en YES plus G418 antes de incubar las placas durante tres días más. Para cada placa YES plus G418, realice una réplica del recubrimiento a YES sin adenina y PMG sin placas de adenina. Incubar las placas réplica a 30 grados centígrados durante uno o dos días hasta que algunas de las colonias de las placas YES sin adenina muestren una coloración blanca.

Compare SÍ sin adenina y PMG sin placas de adenina y seleccione células que muestren rosa o blanco en la placa SÍ sin adenina, y también crezcan en la PMG sin placa de adenina. No seleccione colonias sin crecimiento en PMG sin adenina, ya que son falsos positivos. Elija cada colonia y agréguela a 10 microlitros de solución SPZ que contiene 2,5 miligramos por mililitro de zimolyase 100T.

Luego, incuba las colonias a 37 grados centígrados durante al menos 30 minutos. Después de la incubación, utilice un microlitro de esta solución como plantilla de partida para la PCR de colonias. Después de digerir las colonias seleccionadas y realizar la electroforesis en gel de acuerdo con el protocolo de texto, marque las colonias cuyos productos de PCR fueron cortados por XHO1 y conéctelas a las placas YES plus G418.

Tras el aislamiento del ADNg de las células de levadura de fisión y la secuenciación de los productos de PCR de acuerdo con el protocolo de texto, se compara la secuencia obtenida con la secuencia de tipo salvaje para identificar las mutaciones. Una vez que las mutaciones se reintroducen en las células de tipo salvaje, utilice el manchado para confirmar el fenotipo en las células mutantes recién creadas. Los mutantes rpt4 generados utilizando el protocolo demostrado en este video se pueden analizar evaluando los colores de las colonias.

Como se muestra en esta figura, las colonias se detectaron en las placas correspondientes en una disminución del número de células. El reportero de adenina insertado en la región de heterocromatina se silencia en las células de tipo salvaje y produce colonias rojas en YES sin placas de adenina. Una vez que la heterocromatina se desestabiliza y se expresa el reportero de adenina, se pueden observar colonias blancas en el YES sin placas de adenina como se ve con el mutante clr4-delta.

Los mutantes rpt4 cribados son los que se muestran, con el mutante rpt4-1 exhibiendo la desestabilización de heterocromatina más grave. Una vez dominada, esta técnica se puede realizar en dos semanas para obtener los mutantes deseados. Al intentar este procedimiento, es importante eliminar los falsos positivos, ya que son más frecuentes de lo esperado.

Siguiendo este procedimiento, se pueden realizar otros métodos como la purificación de proteínas y las pruebas de actividad enzimática para responder preguntas adicionales, como la naturaleza de las proteínas. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo generar mutantes en un gen objetivo con el fenotipo deseado.