Un modelo de piel Organotypic Melanoma 3D esferoide

El objetivo general de este modelo de piel esferoide de melanoma organotípico en 3D es recapitular tanto la arquitectura como la complejidad multicelular de un órgano o tumor in vivo, al tiempo que se da cabida a una intervención experimental sistemática. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la investigación del melanoma, como la interacción tumor-huésped y la intervención terapéutica. La principal ventaja de esta técnica es que podemos imitar la arquitectura 3D de las metástasis no vascularizadas in vivo.

Las implicaciones de esta técnica se extienden a la terapia del melanoma ya que refleja la heterogeneidad del tumor. En general, las personas nuevas en este método pueden tener dificultades porque la calidad de las células primarias es decisiva y no se utilizan antibióticos durante el proceso celular. Las implicaciones de esta técnica se extienden a la terapia del melanoma porque refleja la heterogeneidad del tumor.

La demostración visual de este método es fundamental porque el manejo adecuado del modelo de piel de melanoma en 3D es muy importante. Para empezar, se cultivaron células de melanoma 451LU utilizando un medio RPMI que contuviera un 10% de FCS, de acuerdo con los protocolos generales de cultivo celular. Para generar esferoides de melanoma, lave las células de melanoma cultivadas en PBS.

A continuación, agregue cinco mililitros de tripsina EDTA en PBS. Incube durante tres a cinco minutos a temperatura ambiente. Añadir cinco mililitros de RPMI que contengan un 10%FCS para neutralizar la tripsina.

A continuación, transfiera la suspensión de la célula a un tubo de centrífuga. Centrifugar a 200 veces g durante cinco minutos para recolectar las células. Vuelva a suspender el pellet de celda en RPMI que contenga 10% de FCS.

A continuación, cuente las células y diluya la suspensión celular hasta una concentración final de 10.000 células por mililitro. Utilice una pipeta electrónica múltiple para hacer 40 puntos de 25 microlitros de suspensión celular en la superficie interna de la tapa de una placa de cultivo celular estéril y no adhesiva de 10 centímetros. A continuación, dé la vuelta a la tapa con un movimiento rápido y suave y colóquela en la placa de cultivo celular que contiene cinco mililitros de PBS.

Cultive los platos colgantes a 37 grados centígrados en dióxido de carbono al 5% durante 10 a 14 días. Cinco días después de la detección inicial de gotas, use un dispensador electrónico para agregar 10 microlitros de RPMI que contengan 10% de FCS a cada gota. Después de 10 a 15 días, coseche los esferoides enjuagándolos suavemente de la tapa con PBS.

Recoja los esferoides en una placa de cultivo celular nueva y no adhesiva. Para generar la contraparte dérmica de las reconstrucciones de la piel, coloque inserciones de membrana de ocho micrómetros del tamaño de los poros en una placa de cultivo celular de 24 pocillos. Para cada inserto, vuelva a suspender 100.000 fibroblastos en una solución de neutralización en gel.

A continuación, mezcle rápidamente la suspensión de fibroblastos con colágeno tipo uno en una proporción de uno a tres en un volumen final de 500 microlitros sin formar burbujas. A continuación, utilice una pipeta para añadir la suspensión a cada inserto. Dentro de una campana estéril, coloque los insertos a temperatura ambiente sin medio durante 30 minutos para permitir que los geles dérmicos se asienten.

A continuación, cubra los geles con el DMEM e incube durante la noche a 37 grados centígrados. Después de la incubación durante la noche, retire el DMEM de los geles dérmicos y desequilibre con EGM durante dos horas a 37 grados centígrados para generar la contraparte epidérmica de las reconstruyes de la piel. A continuación, utilice una pipeta para eliminar el EGM de los geles.

A continuación, siembre cuidadosamente 100.000 queratinocitos, resuspendidos en 100 microlitros de EGM encima de cada gel. Incubar las reconstrucciones durante una hora y media a 37 grados centígrados para permitir que los queratinocitos se adhieran al gel dérmico. Con la punta de una pipeta, retire con cuidado el gel residual de la pared del inserto.

A continuación, cubra cada reconstrucción con 800 microlitros de EGM y cultive durante siete días a 37 grados centígrados en dióxido de carbono al 5%. Retire con cuidado el gel residual de la pared interior con una punta de pipeta pequeña y ancha. En el octavo día, coloque los insertos en pozos separados de una placa de seis pocillos.

A continuación, agregue de 1,2 a 1,4 de medio de melanoma metastásico a cada pocillo para cubrir solo la base de la reconstrucción de la piel. Luego, incubar durante 10 a 17 días a 37 grados centígrados en 5% de dióxido de carbono. Agregue solo de 1.2 a 1.4 mL de medio para melanoma metastásico a cada pocillo para que la reconstrucción de la piel reciba medio desde el fondo del pocillo, pero no se cubra con medio.

Para integrar los esferoides de melanoma en la contraparte dérmica de las reconstrucciones completas de la piel, use PBS para enjuagar cuidadosamente los esferoides de la tapa de una placa de cultivo de células colgantes. Para cada reconstrucción completa de la piel, recoja de 10 a 20 esferoides en una placa de cultivo celular estéril y no adhesiva. Utilice una pipeta Pasteur para eliminar con cuidado el exceso de PBS.

A continuación, aspire los esferoides en un volumen mínimo de EGM. A continuación, transfiéralos al volumen requerido de solución de neutralización en gel, que contiene 100.000 fibroblastos. Para cada inserto, mezcle la suspensión de esferoide con colágeno tipo uno en una proporción de uno a tres en un volumen final de 500 microlitros.

Finalmente, genere reconstrucciones organotípicas de piel completa como se describe en el protocolo descrito anteriormente. La piel humana normal se compara con la reconstrucción de piel para validar la reconstrucción organotípica de la piel en 3D. La tinción con hematoxilina eosina de las secciones de parafina muestra que la dermis y la epidermis de la reconstrucción cutánea son comparables a las de la piel normal.

La piel humana normal y la reconstrucción cutánea se analizan inmunohistoquímicamente para comparar la diferenciación epidérmica. La inmunotinción contra los marcadores de estratificación epidérmica, a saber, queratina 14, queratina 10 e involucrina y filagrina, indica niveles similares de diferenciación de queratina-aparte entre la piel reconstruida y la piel normal. La inmunotinción contra la laminina cinco indica que la lámina basal se forma para conectar fisiológicamente las contrapartes epidérmicas y dérmicas de las reconstrucciones cutáneas, de forma similar a la piel normal.

La tinción con eosina de hematoxilina de la sección de parafina de la reconstrucción cutánea del melanoma esferoide indica que la distribución celular de los esferoides del melanoma es similar a la de las metástasis cutáneas del melanoma humano no vascularizadas in vivo. El examen histológico revela la presencia de una subpoblación proliferante periférica y una subpoblación necrótica central de las células de melanoma. Una vez dominada, esta técnica podría realizarse en unos 40 días, si se realiza correctamente.

Al intentar este procedimiento, es importante utilizar células primarias de la mejor calidad. Después de su desarrollo, esta técnica allanó el camino para que los investigadores del melanoma exploraran la capacidad de respuesta in vitro en un entorno de imitación in vivo. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo generar un modelo de piel de melanoma organotípico humano en 3D.