Name: Detección de eventos raros usando ADN Error corregido y secuenciación de ARN (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-08-03T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 36 s
Description: Aprende secuenciación corregida de errores para detectar mutaciones raras usando identificadores moleculares únicos y química Illumina. Este método permite identificar variantes clonales con alta sensibilidad en investigación genómica y oncología.

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Agradecemos a los participantes en el estudio de los niños Oncología grupo AAML1531 y de salud estudio las enfermeras por sus contribuciones en la forma de las muestras del paciente. Este trabajo fue financiado por los institutos nacionales de salud (CA186107 UM1, CA49449 to1 y CA149445 to1), Discovery Institute de Washington University infantil de St. Louis los niños Hospital (MC-II-2015-461) y Eli Seth Matthews leucemia Fundación.

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<li>O'Roak, B. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sporadic+autism+exomes+reveal+a+highly+interconnected+protein+network+of+de+novo+mutations%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Sporadic autism exomes reveal a highly interconnected protein network of de novo mutations.</a> Nature. 485, 246-250 (2012).</li>
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<li>Luthra, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Next-generation+sequencing-based+multigene+mutational+screening+for+acute+myeloid+leukemia+using+MiSeq%3A+applicability+for+diagnostics+and+disease+monitoring%5BTitle%5D)+AND+%22Haematologica%22%5BJournal%5D)">Next-generation sequencing-based multigene mutational screening for acute myeloid leukemia using MiSeq: applicability for diagnostics and disease monitoring.</a> Haematologica. 99, 465-473 (2014).</li>
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<li>Schmitt, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+ultra-rare+mutations+by+next-generation+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+USA%22%5BJournal%5D)">Detection of ultra-rare mutations by next-generation sequencing.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 109 (36), 14508-14513 (2012).</li>
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<li>Shugay, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MAGERI%3A+Computational+pipeline+for+molecular-barcoded+targeted+resequencing%5BTitle%5D)+AND+%22PLOSComputationalBiology%22%5BJournal%5D)">MAGERI: Computational pipeline for molecular-barcoded targeted resequencing.</a> PLOSComputationalBiology. 13 (5), e1005480(2017).</li>
<li>Wong, T. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+TP53+mutations+in+the+origin+and+evolution+of+therapy-related+acute+myeloid+leukaemia%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Role of TP53 mutations in the origin and evolution of therapy-related acute myeloid leukaemia.</a> Nature. 518, 552-555 (2014).</li>
<li>Krimmel, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultra-deep+sequencing+detects+ovarian+cancer+cells+in+peritoneal+fluid+and+reveals+somatic+TP53+mutations+in+noncancerous+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+USA%22%5BJournal%5D)">Ultra-deep sequencing detects ovarian cancer cells in peritoneal fluid and reveals somatic TP53 mutations in noncancerous tissues.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 113 (21), 6005-6010 (2016).</li>
<li>Phallen, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+detection+of+early-stage+cancers+using+circulating+tumor+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22ScienceTranslationalMedicine%22%5BJournal%5D)">Direct detection of early-stage cancers using circulating tumor DNA.</a> ScienceTranslationalMedicine. 9, eaan2415(2017).</li>
<li>Egorov, E. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+profiling+of+immune+repertoires+for+minor+lymphocyte+counts+using+unique+molecular+identifiers%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Quantitative profiling of immune repertoires for minor lymphocyte counts using unique molecular identifiers.</a> The Journal of Immunology. 194 (12), 6155-6163 (2015).</li>
</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

Aquí, demostramos una suite de protocolos de corrección de error de la secuencia que pueden ser fácilmente implementadas para estudiar las mutaciones con baja VAFs en diferentes enfermedades. El factor más importante es la incorporación de UMIs con cada molécula antes de la secuencia ya que permiten la corrección de errores de lecturas raws. Los métodos aquí descritos permiten a los investigadores incorporar UMIs personalizados paneles de genes disponibles en el mercado y diseñado oligos específicos del gene.
Protocolo estándar de NGS impide la detección de mutaciones con VAF por debajo del 2% debido a la tasa de error de la secuencia, y esto limita la aplicación de NGS en estudios donde es crucial la detección de variantes raras. Por eludir la tasa de error estándar de NGS, ECS permite la detección sensible de estas variantes crudas. Por ejemplo, la detección de las mutaciones patógenas cuando estas mutaciones surgen en primer lugar (por lo tanto con baja VAF) es imprescindible para informar a la intervención temprana de la enfermedad14,15. En la investigación de la leucemia, la detección de residual mínima enfermedad (células leucémicas residuales después del tratamiento) informa a estratificación de riesgo y podría ser utilizada para informar las opciones de tratamiento de manera que las evaluaciones de citometría de flujo binario no se pueden. Además, la ECS es aplicable para detectar circulación de ácido nucleico tumor y para evaluar el potencial metastático en pacientes con tumores sólidos mediante la evaluación de la presencia/ausencia, así como la carga variable de ciertas mutaciones que son características de la primaria tumor de16.
Como se muestra en la tabla 1, el poder de usar modelo de error de posición específica basada en la distribución binomial para llamar variantes depende en gran medida el número de secuenciadas bibliotecas así como la profundidad de la secuencia utilizada para construir el modelo de error. La robustez del modelo de error aumenta con la mayor cantidad de muestras y más profundidad de la secuencia. Se recomienda utilizar al menos 10 muestras secuenciadas con un promedio de cobertura Lea-corregido error de x 3000 por ejemplo para construir un perfil de error para cada muestra. El enfoque de la posición específica es similar a MAGERI, pero en lugar de utilizar una tasa de error global para todo tipo de sustitución diferente seis (A > C/T > G, A > G/T > C, A > T/T > A, C > A/G > T, C > G/G > C C > T/G > A)13, modelo de cada sustitución independientemente en cada posición. Por ejemplo, una tasa de error de C > T en una determinada posición genómica es diferente a otra posición. Nuestro enfoque también toma en cuenta un efecto de la secuencia por lotes, como la tasa de substitución baja observada en una secuencia de la carrera podría ser diferente de otra carrera. Por lo tanto, es importante modelar cada posición para todo tipo de sustitución especialmente cuando las muestras de pistas de secuencia diferentes se combinaron para construir el modelo.
Una consideración importante al diseñar un experimento ECS es el umbral de detección deseada. La belleza de los estudios NGS es que pueden escalar fácilmente en términos de genes/objetivos de interés, umbral de detección (dictado por la profundidad de la secuencia) y número de personas consultadas. Por ejemplo, si los investigadores están interesados en encontrar mutaciones raras en dos amplicones con un umbral de detección de 0.0001, piscina máximo 75 muestras en una sola secuencia ejecutar utilizando química MiSeq V2 que lee hasta 15 millones (2 amplicons * 10.000 moléculas * 10 Lee para corrección de errores * 75 muestras = 15 millones de la secuencia de lecturas). Los investigadores pueden variar el número de moléculas en la secuencia o el número de muestras agrupadas en una sola secuencia para ajustar el umbral de detección. En nuestros estudios, decidimos encontrar mutaciones con un umbral de detección de VAF 0.0001 (1:10, 000) utilizando el panel de genes Illumina. Rutinariamente utilizamos 250 ng de a partir de ADN para asegurar que suficientes moléculas son capturadas para alcanzar el umbral de detección ya mencionado. Los investigadores pueden optar por iniciar con la menor cantidad de ADN (50 ng recomienda) si el límite de detección deseado es > 0.001 VAF.
Como se añaden las UMIs en los índices de i5, ajustes de la secuencia deben modificarse en consecuencia. Por ejemplo, utilizamos UMIs N 16, y la configuración de la secuencia final pares 2 x 144 lecturas, 8 ciclos de índice 1 y 16 ciclos de índice 2 a diferencia de los habituales 8 ciclos de índice 2. El aumento en el índice 2 ciclo es compensado por una disminución en el número total de ciclos a la Lee. Si los investigadores optan por utilizar 12N UMIs10,17, debe cambiarse la configuración a 12 ciclos de índice 2.
Este método de secuenciación basada en UMI está optimizado para corregir errores de secuenciación. Sigue siendo subóptima en el trato con jackpotting PCR, que es un tema para todo método basado en amplificación. Se realizaron rondas de la secuencia y validación post-bioinformática usando ddPCR, y apenas detectamos cualquier falsos positivos debido a jackpotting PCR. No obstante, se recomienda que los investigadores llevar a cabo los experimentos con polimerasa de alta fidelidad para garantizar errores de amplificación baja.

Como edad, exposición a mutágenos y errores estocásticos durante División de célula resultado de la acumulación de las aberraciones somáticas en el genoma y esto es la base de la patogenia fundamental de transformación maligna, enfermedades neuro-desarrollo, pediatría trastornos del envejecimiento normal y1,2. Mutaciones somáticas con potencial de manejo de la enfermedad son importantes biomarcadores diagnósticos y pronósticos de la detección temprana y gestión de riesgo3,4,5. Para entender mejor la clonogenesis fisiológica, que informar a la clínica y de investigación las decisiones, la exacta cuantificación y caracterización de estas mutaciones es de primordial importancia. Secuenciación de próxima generación (NGS) se utiliza actualmente para el estudio de mutaciones clonales en heterogéneas muestras de ADN; sin embargo, se limita a la identificación de mutaciones en NGS > 0.02 fracción alelo variante (VAF), debido a la inherente-tasa de error de 0.5-2.0% de la secuencia plataformas6,7,8. Como resultado, seguimiento diagnóstico y pronóstico significativas variantes somáticas en VAF más bajo no se puede lograr usando NGS estándar.
Recientemente, se han desarrollado varios métodos para eludir la tasa de error de NGS8,9,10,11. Estos métodos utilizan etiquetado molecular, que permite la corrección de errores después de la secuencia. Cada molécula o fragmento genomic de la biblioteca de la secuencia es etiquetado con un aleatorio único Molecular identificador (UMI) que es específico de esa molécula. Se construyen las UMIs permutaciones de una cadena de nucleótidos al azar (N 8 – 16). Un segundo código de barras específico de muestra también se integra en el flujo de trabajo que permite la multiplexación de múltiples muestras en la misma secuencia de NGS ejecutar. Amplificación por PCR se realiza en la biblioteca etiquetada molecularmente, y posteriormente se envía a la biblioteca por secuenciación. Durante la preparación de la biblioteca, se espera que errores se introducirán al azar en el fragmento genomic durante la amplificación por PCR y secuenciación8. Para eliminar errores de secuenciación al azar, lee la secuencia cruda se agrupa según la UMI. Artefactos de la secuencia no se espera que esté presente en todas las lecturas con la UMI mismo en la misma posición genómica debido a la naturaleza estocástica de introducción, mientras que una verdadera variante será amplificada y secuenciada en todas las lecturas que comparten el mismo UMI fielmente. Los artefactos son bioinformatically quitado. Aquí, Describimos tres métodos de corrección de Error de secuencia (ECS) optimizado en el laboratorio de ADN identificar variantes de un solo nucleótido (SNVs) y pequeña inserción-deleciones (Indels) y de ARN para facilitar la cuantificación de la expresión génica a continuación la Umbral de error NGS.
El primer método describe una forma de buscarse un acontecimiento somático raro usando las cartillas específicas gen diseñados por los investigadores. Antes de la preparación de la biblioteca, los investigadores deben diseñar cartillas a los fragmentos de interés. Utilizamos el Primer3 web-app (http://bioinfo.ut.ee/primer3-0.4.0/). Amplicones de 200 – 250 bp son ideales para la reacción en cadena de polimerasa (PCR) como estos, una vez que se han incorporado UMIs, genere superposición final emparejado Lee 150 lecturas de extremo apareado de bp. Las condiciones de diseño de primer óptimo a utilizar son: tamaño mínimo del primer = 19; Tamaño cartilla óptimo = 25; Tamaño cartilla máxima = 30; Mínimo Tm = 64 ° C; Óptima Tm = 70 ° C; Máxima Tm = 74 ° C; Máxima diferencia de Tm = 5 ° C; Mínimo contenido de GC = 45; Contenido de GC máximo = 80; Número para enviar = 20; Máximo de 3' final de estabilidad = 100.
En el método 2, se describe un método que combina el protocolo de ECS-ADN con Illumina química encuesta SNVs clonales y pequeño Indels tan raros como 0.0001 VAF usando paneles de gene comercialmente disponibles que incluyen cientos de amplicones. Hemos utilizado el TruSight mieloide secuenciación Panel (Illumina) para nuestro experimento y diseñado un panel ampliado para incluir genes adicionales de interés para enfermedades pediátricas mieloides. Estos paneles no han ofrecido identificadores moleculares únicos (UMIs) que faciliten la corrección de errores, así que hemos añadido nuestra propia estrategia de adaptador para estos paneles. ECS debería funcionar igualmente bien con cualquiera de otros paneles diseñados para enriquecer de genes asociados a diferentes enfermedades. Después de extracción de ADN y posterior cuantificación del tejido o muestra de interés, se recomienda tener al menos 500 ng de stock ADN por muestra. Habitualmente hacemos una biblioteca única secuenciación utilizando 250 ng de ADN para capturar aguas abajo como mucho único fragmento genómico como sea posible para Lee la deduplicación y el cálculo de la VAF. Una biblioteca de secuenciación replicar opcional puede hacerse con los restantes 250 ng de ADN. Siempre hacemos dos bibliotecas réplicas por muestra, y consideramos sólo los eventos detectados independientemente en dos repeticiones como verdaderos positivos. También implementamos un modelo de error binomial de genomic posición específica para aumentar la precisión de la variante llamada4,13.
Por último, se describe un método de acoplamiento ECS a secuencia de RNA para la cuantificación de la transcripción mediante paneles QIAseq RNA objetivo estándares (Qiagen). Las UMIs requieren para la desduplicación de corrección de errores se han incorporado en los kits y los investigadores pueden hacer bibliotecas siguiendo las recomendaciones del fabricante. Bioinformatically, los investigadores pueden seguir la tubería para ECS-DNA, que se explica en detalle en la sección de protocolo.

<table><tbody><tr><td>Q5 Mezcla maestra de arranque en caliente de alta fidelidad</td><td>Nueva Inglaterra BioLabs</td><td>M0492S</td><td></td></tr><tr><td>Agencourt AMPure XP</td><td>Beckman Coulter</td><td>A63880</td><td></td></tr><tr><td>Qubit dsDNA HS Kit de ensayo</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Q32854</td><td></td></tr><tr><td>SYBR Safe DNA Gel</td><td>Stain Thermo Fisher Scientific</td><td>S33102</td><td></td></tr><tr><td>Truseq Custom Amplicon Index Kit</td><td>Illumina</td><td>FC-130-1003</td><td></td></tr><tr><td>Secuencias de adaptador UMI i5 Integrated</td><td>DNA</td> Technologies-NEBNext <td></td><td></td></tr><tr><td>Ultra End Repair/dA-Tailing Module</td><td>New England BioLabs</td><td>E7442S</td><td></td></tr><tr><td>NEBNext Ultra II Módulo de ligadura</td><td>New England BioLabs</td><td>E7595S</td><td></td></tr><tr><td>QX200 ddPCR EvaGreen Supermix</td><td>Bio-Rad 1864034</td><td></td><td></td></tr><tr><td>QX200 Aceite de generación de gotas para EvaGreen</td><td>Bio-Rad</td><td>1864005</td><td></td></tr><tr><td>QX200 Sistema de PCR digital de gotas</td><td>Bio-Rad</td><td>1864001</td><td></td></tr><tr><td>ddPCR Placas de 96 pocillos</td><td>Bio-Rad</td><td>12001925</td><td></td></tr><tr><td>DG8 Cartuchos para generador de gotas QX200/QX100</td><td>Juntas Bio-Rad</td><td>1864008</td><td></td></tr><tr><td>DG8 para generador de gotas QX200/QX100</td><td></td><td>Bio-Rad</td> 1863009 <td></td></tr><tr><td>Bioanalyzer</td><td>Agilent Genomics</td><td>G2939BA</td><td></td></tr><tr><td>TapeStation</td><td>Agilent Genomics</td><td>G2991AA</td><td></td></tr><tr><td>TruSight Panel de secuenciación mieloide</td><td>Illumina</td><td>FC-130-1010</td><td></td></tr><tr><td>Bowtie 2</td> Panel <td>de</td> ARN dirigido QIAseq personalizado de <td></td>la <td>Universidad Johns Hopkins</td></tr> <tr><td>Qiagen-Rneasy</td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>Plus Mini Kit (50)</td><td>Qiagen</td><td>74134</td><td></td></tr></tbody></table>

detección de eventos raros usando adn error corregido y secuenciación de arn

Rare Event Detection Using Error-corrected DNA and RNA Sequencing

Técnicas de secuenciación de próxima generación convencional (NGS) han permitido para la caracterización genómica inmenso para más de una década. Específicamente, NGS se ha utilizado para analizar el espectro de mutaciones clonales de malignidad. Aunque mucho más eficiente que los métodos tradicionales de Sanger, NGS luchas con la identificación de mutaciones clonales y subclonal raras debido a su tasa alta de error de ~0.5–2.0%. Por lo tanto, NGS estándar tiene un límite de detección para las mutaciones que son > 0.02 fracción alelo variante (VAF). Mientras que la significación clínica de las mutaciones de este raras en pacientes sin enfermedad conocida sigue siendo confusa, pacientes tratados por leucemia han mejorado significativamente los resultados cuando la enfermedad residual es < 0.0001 por citometría de flujo. Para mitigar este fondo artefactual de NGS, numerosos métodos han sido desarrollados. Aquí se describe un método para corregir Error ADN y ARN secuencia (ECS), que implica la selección de moléculas individuales con un índice aleatorio de 16 bp para corrección de errores y un índice de específico para cada paciente 8 bp multiplexación. Nuestro método puede detectar y rastrear mutaciones clonales en el alelo variante fracciones (VAFs) dos órdenes de magnitud menores que el límite de detección de NGS y tan raras como VAF 0.0001.

Con Targeted Error-Corrected de secuenciación de ADN, hemos realizado una prueba del experimento principio diluir a paciente mutante ADN en ADN genómico comercial. El paciente tenía una mutación de GATA1 (chrX:48650264, C &gt; G) con VAF original de 0,19. Se demuestra en la figura 1 que el ECS es cuantitativo a un nivel de 1: 10,000 para la variante de un solo nucleótido.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57509/57509fig1.jpg"> Figura 1: serie de diluciones de GATA1 SNV demostrando que el ECS es cuantitativa el nivel de 1: 10,000. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57509/57509fig1large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
También mostramos que el ECS-ADN detecta confiablemente raras mutaciones clonales en genes de forma recurrente en adultos leucemia mieloide aguda (AML) en individuos ancianos sanos4. Se obtuvieron muestras de la capa anteada de 20 individuos sanos en salud estudio de la enfermera bancarizados aproximadamente ~ 10 años de diferencia. Se aplicó el protocolo de grupo ECS-DNA en estas muestras. Para este experimento, adaptado el Illumina TruSight mieloide secuenciación Panel que consta de 568 amplicones (más información en lista de gene https://www.illumina.com/products/by-type/clinical-research-products/trusight-myeloid.html) y secuenciado 80 bibliotecas de 20 individuos (2 colecciones en diferentes puntos temporales, 2 repeticiones por individuo por tiempo punto) utilizando la plataforma Illumina NextSeq, que generó un promedio de 47,7 millones de extremo apareado de Lee y un promedio de 3,4 millones corregido error secuencias de consenso por biblioteca4. La cobertura promedio de nucleótidos por biblioteca era aproximadamente 6.000 x (3.4 millones divididos por 568). Para cada muestra, se construyó un perfil de error de posición específica utilizando bibliotecas de secuenciadas que no son de la misma muestra. Se encontraron 109 mutaciones somáticas clonales que estaban presentes en ambos réplicas de momento al menos una colección. Estas mutaciones tienen desde 0.0003 – 0.1451 VAF. Se seleccionaron 21 mutaciones con representaciones cósmicas conocidas y validadas todas 21 mutaciones en uno o dos puntos de tiempo colección usando ddPCR (n = 34, figura 2, adaptado de joven et al 20164).
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57509/57509fig2.jpg"> Figura 2: mutaciones identificadas por ECS fueron verificadas a través de ddPCR con VAFs altamente concordantes. (n = 34, modificado de joven et al 20164). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57509/57509fig2large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
Con respecto al nivel de expresión corregida de error utilizando el protocolo de ECS-RNA, hemos modificado para requisitos particulares un panel de genes utilizando química QIAseq que consta de 416 genes sabidos para ser asociado con varios tipos de cáncer (adaptados del transcriptoma de cáncer humano QIAseq panel) y amplificación del exón más comúnmente expresado de un gen determinado (lista de gen 1 Material complementario). Ordenamos las bibliotecas usando plataforma Illumina MiSeq en formato final emparejado que dio un promedio de 8,3 millones de lecturas por biblioteca, y logramos captar un promedio de secuencias consenso corregido error 0,417 millones. Demostramos que la expresión a nivel de transcripción de baja abundancia (&lt; transcripción 1.000 cuenta en 50 ng de ARN total) es altamente reproducible entre repeticiones (punto de datos n = 300, figura 3). Validación de ddPCR (seis genes seleccionados de diversos grados de expresión) demostró que el nivel de expresión de los genes había sido capturado correctamente por el protocolo ECS sin la necesidad de normalización.
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57509/57509fig3.jpg"> Figura 3: alto, correlación de transcripción cuenta por ECS-ARN entre repeticiones de la misma muestra (n = 300). Fondo, transcripción de cuenta identificado por ECS fueron verificado por ddPCR (n = 6). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57509/57509fig3large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>

Secuenciación de próxima generación (NGS) es una poderosa herramienta para la caracterización genómica que está limitada por la tasa alta de error de la plataforma (~0.5–2.0%). Describimos nuestros métodos de corrección de error de la secuencia que nos permiten obviar la tasa de error NGS y detectar mutaciones en fracciones de alelo variante tan raros como 0.0001.

Detección de eventos raros usando ADN Error corregido y secuenciación de ARN

Conventional next-generation sequencing techniques (NGS) have allowed for immense genomic characterization for over a decade. Specifically, NGS has been ...

Este método puede ayudar a responder algunas preguntas clave en varios campos de investigación, como la detección de clones precancerosos, la evaluación pronóstica de los pacientes con leucemia después del tratamiento y la identificación de mutaciones potencialmente patógenas en donantes de médula ósea. Demostrando este procedimiento conmigo estará Spencer, él es un técnico en el laboratorio. Este video describe cómo combinar el protocolo de secuenciación corregida por errores con la química de Illumina y los paneles de genes disponibles comercialmente para detectar variantes clonales de un solo nucleótido y pequeños indels con una sensibilidad de uno en 10,000.Para incorporar los identificadores moleculares únicos requeridos, los adaptadores 16N i5 e i7 personalizados utilizan PCR. En primer lugar, prepare la mezcla maestra Q5, que utiliza una polimerasa con mayor fidelidad que la alternativa disponible en el mercado. A continuación, para cada reacción, combine 37,5 microlitros de Q5 Master Mix, seis microlitros de cinco adaptadores 16N i5 micromolares, que son los identificadores moleculares únicos, y seis microlitros de adaptadores i7.Si el objetivo es la multiplexación, utilice diferentes adaptadores i7 en muestras separadas. Ahora, ejecute la PCR utilizando los siguientes parámetros: treinta segundos a 98 grados Celsius, seguidos de cuatro a seis ciclos de diez segundos a 98 grados Celsius, treinta segundos a 66 grados Celsius y treinta segundos a 72 grados Celsius. Termine la reacción con una extensión de dos minutos a 72 grados Celsius y manténgala a cuatro grados Celsius.Luego, lo más probable es que los dos ciclos de PCR que debe hacer en ellos dependan del tamaño del panel de genes que utilice, según nuestra experiencia, una PCR de cuatro ciclos es suficiente si el panel de genes tiene alrededor de 1500 rutas diferentes de oligonucleótidos específicos de genes, mientras que un panel con aproximadamente cinco a 600 pares de oligonucleótidos requiere aproximadamente seis ciclos de PCR. A continuación, limpie las reacciones de PCR con perlas magnéticas, agregue 56,25 microlitros de solución de perlas magnéticas en cada producto de PCR de 75 microlitros, luego transfiera cada reacción a un tubo de baja unión de 1,5 mililitros separado, mezclado pipeteando hacia arriba y hacia abajo al menos diez veces, y espere cinco minutos. A continuación, transfiera las mezclas a un soporte magnético y deje que los sobrenadantes se aclaren durante dos minutos.Luego, retire y deseche los sobrenadantes. A continuación, agregue 200 microlitros de etanol al 70%, espere treinta segundos y luego retire el etanol. Repita este paso de lavado con etanol una vez y luego deje que las perlas se sequen al aire durante cinco minutos.Finalmente, eluir las bibliotecas modificadas de las perlas en veinte microlitros de agua bidestilada. A continuación, coloque los tubos en una rejilla magnética para separar las perlas magnéticas del eluyente. En primer lugar, realice diluciones en serie de diez veces de las bibliotecas de ECS desde el paso anterior, hasta una parte por 1.000 en tiras de PCR.A continuación, prepara una Master Mix en un tubo de 1,5 mililitros. Para cada reacción, combine 10 microlitros de ddPCR EvaGreen Mix, 0,2 microlitros de cebador P5, 0,2 microlitros de cebador P7 y 4,6 microlitros de agua destilada doble. A continuación, pipetea 15 microlitros de EvaGreen Master Mix en un nuevo juego de tubos, y finalmente añade cinco microlitros de uno a 1.000 ECS de producto limpio a la Master Mix.A continuación, haga gotas de PCR con el generador de gotas. Primero, cargue el casete, pipetee 70 microlitros de aceite de generación de gotas en el pocillo del casete, aceite etiquetado y pipetee 20 microlitros de la mezcla de reacción ddPCR en la muestra etiquetada con el pocillo. Luego, cubra el casete con una junta de goma y cárguelo en el generador de gotas y proceda con toda la generación de gotas.Ahora, utilizando una pipeta multicanal, lentamente, durante cinco segundos, cargue 45 microlitros de gotas tomadas de cada pocillo de casete, en una nueva placa de PCR. A continuación, selle la placa PCR con un papel de aluminio. Ahora, amplifique la señal en las gotas utilizando las siguientes condiciones: cinco minutos a 95 grados Celsius, seguidos de 40 ciclos de treinta segundos a 95 grados Celsius, y un minuto a 63 grados Celsius, luego, enfríe la reacción a cuatro grados Celsius durante cinco minutos antes de elevarla a 90 grados Celsius durante cinco minutos, y luego se mantiene a cuatro grados centígrados.A continuación, prepare la máquina lectora de gotas de plantilla ddPCR. Seleccione los parámetros para la cuantificación absoluta y el uso de la QX200 ddPCR EvaGreen Supermix. A continuación, pase las reacciones por el lector de gotas.Una vez finalizado el análisis de ddPCR, aplique los mismos umbrales de división a cada muestra. A continuación, normalice cada biblioteca al número deseado de moléculas. Comience haciendo reacciones de 50 microlitros, que consisten en 25 microlitros de Q5 Master Mix, dos microlitros de un cebador P5 micromolar, dos microlitros de un cebador P7 micromolar y 21 microlitros de biblioteca de ADN normalizada.A continuación, ejecute la PCR utilizando los siguientes parámetros: 30 segundos a 98 grados Celsius, seguidos de 16 ciclos de 10 segundos a 98 grados Celsius, treinta segundos a 66 grados Celsius y treinta segundos a 72 grados Celsius, luego dos minutos a 72 grados Celsius y manténgalo a cuatro grados Celsius. A continuación, cuantifique la concentración de ADN en las bibliotecas y agrupe las bibliotecas en cantidades molares iguales para la secuenciación, apunte aproximadamente a cuatro nanomolares. Ahora, secuencie la biblioteca ECS agrupada utilizando la plataforma de secuenciación Illumina, con los siguientes ajustes de secuenciación: dos veces 144 lecturas de extremos emparejados, ocho ciclos de índice uno y 16 ciclos de índice dos.El ADN de un paciente con una mutación en GATA1 se diluyó en ADN genómico comercial con el VAF original de 0,19. Utilizando el protocolo descrito, el SEC demostró ser cuantitativo a un nivel de uno a 10.000 para la variante de un solo nucleótido. A continuación, se analizaron muestras de pelaje leucocitario de veinte individuos sanos utilizando un panel de secuenciación comercial que consta de 568 amplicones.En resumen, se seleccionaron 109 mutaciones somáticas clonales en ambas réplicas de al menos un punto de tiempo de recolección con fracciones alélicas variantes que oscilaron entre 0,0003 y 0,1451.21 de las mutaciones con representaciones cósmicas conocidas y cada una se validó mediante PCR digital en gotas. Para demostrar el nivel de expresión corregido por errores del protocolo, se utilizó un panel de genes personalizado que consta de 415 genes que se sabe que están asociados con varios tipos de cáncer, para producir una biblioteca construida a partir del exón más comúnmente expresado de cada gen. El nivel de expresión de la transcripción de baja abundancia fue altamente reproducible entre las réplicas.A continuación, se utilizó la PCR digital en gotas para validar seis genes seleccionados con expresión variable. Una comparación muestra que el nivel de expresión de los genes fue capturado correctamente por el protocolo ECS, sin necesidad de normalización. Una vez que hayas dominado la técnica, esta técnica se puede realizar cómodamente en un día y medio.La mayor parte del tiempo será la incubación, y la manipulación manual ocupa alrededor del 30-40% del tiempo total requerido, dependiendo de la cantidad de muestras que los investigadores estén procesando al mismo tiempo. Al intentar este procedimiento, es muy importante tener una biblioteca de secuenciación replicada para la misma muestra. Esto le dará más confianza de que una mutación de baja frecuencia es verdadera positiva si la mutación en sí misma es central de forma independiente en ambas réplicas.Siguiendo este procedimiento, se podrían realizar otros asuntos, como el ARN del ECS, para responder a preguntas como la detección de transcripciones de baja abundancia o la transcripción de fusión. Después de su desarrollo, esta técnica allanó el camino para los investigadores, principalmente en el campo de las neoplasias malignas hematológicas, y utilizamos esta técnica para explorar clones preleucémicos en individuos sanos, así como para detectar enfermedad residual mínima en pacientes con leucemia que están en remisión.

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Investigación

JoVE Journal

Genetics

Genética

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