Detección de eventos raros usando ADN Error corregido y secuenciación de ARN
August 3rd, 2018
Secuenciación de próxima generación (NGS) es una poderosa herramienta para la caracterización genómica que está limitada por la tasa alta de error de la plataforma (~0.5–2.0%). Describimos nuestros métodos de corrección de error de la secuencia que nos permiten obviar la tasa de error NGS y detectar mutaciones en fracciones de alelo variante tan raros como 0.0001.
Este método puede ayudar a responder algunas preguntas clave en varios campos de investigación, como la detección de clones precancerosos, la evaluación pronóstica de los pacientes con leucemia después del tratamiento y la identificación de mutaciones potencialmente patógenas en donantes de médula ósea. Demostrando este procedimiento conmigo estará Spencer, él es un técnico en el laboratorio. Este video describe cómo combinar el protocolo de secuenciación corregida por errores con la química de Illumina y los paneles de genes disponibles comercialmente para detectar variantes clonales de un solo nucleótido y pequeños indels con una sensibilidad de uno en 10,000.
Para incorporar los identificadores moleculares únicos requeridos, los adaptadores 16N i5 e i7 personalizados utilizan PCR. En primer lugar, prepare la mezcla maestra Q5, que utiliza una polimerasa con mayor fidelidad que la alternativa disponible en el mercado. A continuación, para cada reacción, combine 37,5 microlitros de Q5 Master Mix, seis microlitros de cinco adaptadores 16N i5 micromolares, que son los identificadores moleculares únicos, y seis microlitros de adaptadores i7.
Si el objetivo es la multiplexación, utilice diferentes adaptadores i7 en muestras separadas. Ahora, ejecute la PCR utilizando los siguientes parámetros: treinta segundos a 98 grados Celsius, seguidos de cuatro a seis ciclos de diez segundos a 98 grados Celsius, treinta segundos a 66 grados Celsius y treinta segundos a 72 grados Celsius. Termine la reacción con una extensión de dos minutos a 72 grados Celsius y manténgala a cuatro grados Celsius.
Luego, lo más probable es que los dos ciclos de PCR que debe hacer en ellos dependan del tamaño del panel de genes que utilice, según nuestra experiencia, una PCR de cuatro ciclos es suficiente si el panel de genes tiene alrededor de 1500 rutas diferentes de oligonucleótidos específicos de genes, mientras que un panel con aproximadamente cinco a 600 pares de oligonucleótidos requiere aproximadamente seis ciclos de PCR. A continuación, limpie las reacciones de PCR con perlas magnéticas, agregue 56,25 microlitros de solución de perlas magnéticas en cada producto de PCR de 75 microlitros, luego transfiera cada reacción a un tubo de baja unión de 1,5 mililitros separado, mezclado pipeteando hacia arriba y hacia abajo al menos diez veces, y espere cinco minutos. A continuación, transfiera las mezclas a un soporte magnético y deje que los sobrenadantes se aclaren durante dos minutos.
Luego, retire y deseche los sobrenadantes. A continuación, agregue 200 microlitros de etanol al 70%, espere treinta segundos y luego retire el etanol. Repita este paso de lavado con etanol una vez y luego deje que las perlas se sequen al aire durante cinco minutos.
Finalmente, eluir las bibliotecas modificadas de las perlas en veinte microlitros de agua bidestilada. A continuación, coloque los tubos en una rejilla magnética para separar las perlas magnéticas del eluyente. En primer lugar, realice diluciones en serie de diez veces de las bibliotecas de ECS desde el paso anterior, hasta una parte por 1.000 en tiras de PCR.
A continuación, prepara una Master Mix en un tubo de 1,5 mililitros. Para cada reacción, combine 10 microlitros de ddPCR EvaGreen Mix, 0,2 microlitros de cebador P5, 0,2 microlitros de cebador P7 y 4,6 microlitros de agua destilada doble. A continuación, pipetea 15 microlitros de EvaGreen Master Mix en un nuevo juego de tubos, y finalmente añade cinco microlitros de uno a 1.000 ECS de producto limpio a la Master Mix.
A continuación, haga gotas de PCR con el generador de gotas. Primero, cargue el casete, pipetee 70 microlitros de aceite de generación de gotas en el pocillo del casete, aceite etiquetado y pipetee 20 microlitros de la mezcla de reacción ddPCR en la muestra etiquetada con el pocillo. Luego, cubra el casete con una junta de goma y cárguelo en el generador de gotas y proceda con toda la generación de gotas.
Ahora, utilizando una pipeta multicanal, lentamente, durante cinco segundos, cargue 45 microlitros de gotas tomadas de cada pocillo de casete, en una nueva placa de PCR. A continuación, selle la placa PCR con un papel de aluminio. Ahora, amplifique la señal en las gotas utilizando las siguientes condiciones: cinco minutos a 95 grados Celsius, seguidos de 40 ciclos de treinta segundos a 95 grados Celsius, y un minuto a 63 grados Celsius, luego, enfríe la reacción a cuatro grados Celsius durante cinco minutos antes de elevarla a 90 grados Celsius durante cinco minutos, y luego se mantiene a cuatro grados centígrados.
A continuación, prepare la máquina lectora de gotas de plantilla ddPCR. Seleccione los parámetros para la cuantificación absoluta y el uso de la QX200 ddPCR EvaGreen Supermix. A continuación, pase las reacciones por el lector de gotas.
Una vez finalizado el análisis de ddPCR, aplique los mismos umbrales de división a cada muestra. A continuación, normalice cada biblioteca al número deseado de moléculas. Comience haciendo reacciones de 50 microlitros, que consisten en 25 microlitros de Q5 Master Mix, dos microlitros de un cebador P5 micromolar, dos microlitros de un cebador P7 micromolar y 21 microlitros de biblioteca de ADN normalizada.
A continuación, ejecute la PCR utilizando los siguientes parámetros: 30 segundos a 98 grados Celsius, seguidos de 16 ciclos de 10 segundos a 98 grados Celsius, treinta segundos a 66 grados Celsius y treinta segundos a 72 grados Celsius, luego dos minutos a 72 grados Celsius y manténgalo a cuatro grados Celsius. A continuación, cuantifique la concentración de ADN en las bibliotecas y agrupe las bibliotecas en cantidades molares iguales para la secuenciación, apunte aproximadamente a cuatro nanomolares. Ahora, secuencie la biblioteca ECS agrupada utilizando la plataforma de secuenciación Illumina, con los siguientes ajustes de secuenciación: dos veces 144 lecturas de extremos emparejados, ocho ciclos de índice uno y 16 ciclos de índice dos.
El ADN de un paciente con una mutación en GATA1 se diluyó en ADN genómico comercial con el VAF original de 0,19. Utilizando el protocolo descrito, el SEC demostró ser cuantitativo a un nivel de uno a 10.000 para la variante de un solo nucleótido. A continuación, se analizaron muestras de pelaje leucocitario de veinte individuos sanos utilizando un panel de secuenciación comercial que consta de 568 amplicones.
En resumen, se seleccionaron 109 mutaciones somáticas clonales en ambas réplicas de al menos un punto de tiempo de recolección con fracciones alélicas variantes que oscilaron entre 0,0003 y 0,1451.21 de las mutaciones con representaciones cósmicas conocidas y cada una se validó mediante PCR digital en gotas. Para demostrar el nivel de expresión corregido por errores del protocolo, se utilizó un panel de genes personalizado que consta de 415 genes que se sabe que están asociados con varios tipos de cáncer, para producir una biblioteca construida a partir del exón más comúnmente expresado de cada gen. El nivel de expresión de la transcripción de baja abundancia fue altamente reproducible entre las réplicas.
A continuación, se utilizó la PCR digital en gotas para validar seis genes seleccionados con expresión variable. Una comparación muestra que el nivel de expresión de los genes fue capturado correctamente por el protocolo ECS, sin necesidad de normalización. Una vez que hayas dominado la técnica, esta técnica se puede realizar cómodamente en un día y medio.
La mayor parte del tiempo será la incubación, y la manipulación manual ocupa alrededor del 30-40% del tiempo total requerido, dependiendo de la cantidad de muestras que los investigadores estén procesando al mismo tiempo. Al intentar este procedimiento, es muy importante tener una biblioteca de secuenciación replicada para la misma muestra. Esto le dará más confianza de que una mutación de baja frecuencia es verdadera positiva si la mutación en sí misma es central de forma independiente en ambas réplicas.
Siguiendo este procedimiento, se podrían realizar otros asuntos, como el ARN del ECS, para responder a preguntas como la detección de transcripciones de baja abundancia o la transcripción de fusión. Después de su desarrollo, esta técnica allanó el camino para los investigadores, principalmente en el campo de las neoplasias malignas hematológicas, y utilizamos esta técnica para explorar clones preleucémicos en individuos sanos, así como para detectar enfermedad residual mínima en pacientes con leucemia que están en remisión.
Descripción general
Este artículo discute un método para secuenciación con corrección de errores que mejora la precisión de la secuenciación de próxima generación (NGS) al reducir su tasa de error. La técnica permite la detección de mutaciones en fracciones de alelos variantes muy bajas, lo que la hace valiosa para varias aplicaciones de investigación.
Componentes clave del estudio
Área de la ciencia
- Genómica
- Tecnologías de secuenciación
- Detección de mutaciones
Antecedentes
- La secuenciación de próxima generación (NGS) tiene una alta tasa de error de aproximadamente 0.5–2.0%.
- Los métodos de secuenciación con corrección de errores pueden mitigar esta tasa de error.
- Detectar mutaciones raras es crucial en campos como la oncología y la genética.
- Los identificadores moleculares únicos son esenciales para una detección precisa de mutaciones.
Propósito del estudio
- Presentar un protocolo para secuenciación con corrección de errores usando química Illumina.
- Demostrar la sensibilidad del método en la detección de variantes clonales de un solo nucleótido.
- Validar la efectividad del protocolo en varios contextos de investigación.
Métodos utilizados
- Preparación de Q5 Master Mix con polimerasa de alta fidelidad.
- Uso de identificadores moleculares únicos a través de adaptadores personalizados.
- Amplificación por PCR con parámetros de ciclo específicos.
- PCR digital de gota para cuantificación y validación de mutaciones.
Principales resultados
- Detectaron con éxito mutaciones con fracciones de alelos variantes tan bajas como 0.0001.
- Identificaron 109 mutaciones somáticas clonales en varias muestras.
- Validaron mutaciones usando PCR digital de gota.
- Demostraron la precisión cuantitativa del método de secuenciación con corrección de errores.
Conclusiones
- La secuenciación con corrección de errores mejora significativamente la sensibilidad de detección de mutaciones.
- El método es aplicable en entornos clínicos y de investigación para análisis genómicos.
- Estudios adicionales podrían expandir su uso en la detección de variantes genéticas raras.
Preguntas frecuentes
Executive Industry Relevance
Error-corrected sequencing (ECS) addresses a critical limitation in next-generation sequencing by reducing error rates to enable detection of mutations at variant allele fractions as low as 0.0001. This capability supports early detection of pre-leukemic clones and minimal residual disease monitoring in hematological malignancies, directly impacting therapeutic decision-making and patient stratification in oncology drug development. By providing quantitative, reproducible detection of rare clonal variants, ECS enhances predictive confidence in target validation and biomarker discovery pipelines.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by detecting clonal somatic mutations at ultra-low frequencies, supporting biological de-risking of putative cancer targets.
- Operational Value: Provides quantitative variant allele fraction measurements that clarify pathway involvement and functional relevance of genetic alterations in disease models.
- Predictive Value: Improves confidence in target prioritization by distinguishing true low-frequency mutations from sequencing artifacts, reducing false-positive leads in target validation campaigns.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Generates standardized, error-corrected libraries compatible with Illumina sequencing, enabling scalable screening of large gene panels for somatic variant discovery.
- Quantitative Output: Delivers precise variant allele fraction data that supports assay standardization and cross-laboratory reproducibility in mutation detection workflows.
- Platform Reuse: Facilitates multiplexed sample processing via patient-specific indices, increasing throughput and reducing per-sample cost in large-scale genotyping efforts.
Translational & Preclinical Research
- Disease Relevance: Directly applicable to monitoring minimal residual disease in leukemia patients post-treatment, aligning with clinically relevant endpoints in preclinical efficacy studies.
- Translational Continuity: Bridges discovery-phase mutation detection with preclinical validation through quantitative tracking of clonal dynamics over time.
- Risk-Adjusted Advancement: Supports go/no-go decisions by providing sensitive detection of emergent resistant clones during preclinical therapy studies.
Pipeline & Workflow Integration
ECS fits within the discovery continuum from early target hypothesis testing through lead identification and preclinical validation, particularly in hematologic malignancy models where clonal evolution informs therapeutic response.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by enabling sensitive detection of pre-leukemic clones in healthy donor samples, clarifying origins of malignancy.
- Screening: Delivers assay-ready, quantitative sequencing data with high reproducibility, facilitating reliable compound screening in genetically defined models.
- Analytics: Generates precise variant allele fraction measurements and digital droplet PCR-validated outputs that allow accurate comparison of mutant burden across experimental conditions.
- Translational Research: Connects to preclinical continuity through monitoring of minimal residual disease, a key biomarker in leukemia therapeutic development.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable genotyping capability for longitudinal tracking of clonal dynamics across multiple projects and therapeutic areas.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Reduces mechanistic ambiguity in mutation detection, increasing confidence in genetic biomarkers and therapeutic targets.
- Operational Value: Standardizes library preparation with unique molecular identifiers, improving reproducibility and reducing batch effects in sequencing data.
- Strategic Value: Enables earlier, more confident go/no-go decisions by detecting resistance mutations at clinically relevant thresholds, reducing late-stage failure risk.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization of drug candidates based on sensitivity to detect emergent clonal variants in preclinical models.
Implementation Considerations
- Requires expertise in molecular library preparation, PCR optimization, and digital droplet PCR validation for accurate rare variant detection.
- Depends on access to high-fidelity polymerases, magnetic bead purification systems, and droplet generation instrumentation for library processing.
- Necessitates cross-team standardization of index design and PCR cycle numbers based on gene panel complexity to ensure multiplexing compatibility.
- Involves adaptation considerations when applying the method to RNA sequencing or fusion transcript detection beyond DNA-based variant calling.
- Involves practical limitations related to input DNA quality and quantity, as low-yield samples may require increased PCR cycles that could introduce bias.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:04
Title
0:33
Incorporating i5 and i7 Adapters onto Error-corrected Sequencing Libraries
3:36
Quantifying the Libraries with QX200 Digital Droplet PCR (ddPCR)
6:14
Amplifying and Normalizing the Libraries for Sequencing
7:37
Results: Mutation-calling with Error-corrected Sequencing (ECS)
9:14
Conclusion
