Aislamiento y caracterización de las vesículas extracelulares de adultos Schistosoma japonicum

El objetivo general de este procedimiento es aislar vesículas extracelulares del medio de Schistosoma japonicum adulto cultivado in vitro. Este método puede aislar eficientemente EV en un medio de cultivo in vitro de Schistosoma japonicum adulto. La principal ventaja de esta técnica es que es capaz de aislar eficientemente la vesícula extracelular del medio de cultivo in vitro a corto plazo, lo que puede minimizar el estrés que puede resultar en la secreción no fisiológica de EV.

La demostración estará a cargo de Juntao Liu, un técnico de mi laboratorio. Recoja los parásitos en un vaso de precipitados de 500 mililitros y lávelos a fondo pero suavemente tres veces con 200 mililitros de PBS tibio. Mantenga los lavados breves y use la sedimentación por gravedad para separar los parásitos.

A continuación, en platos de 90 milímetros, coloque unos 200 pares de gusanos por plato. En el plato, lave los parásitos dos veces más utilizando la sedimentación por gravedad. Para estos lavados, use medio RPMI tibio complementado con pen-strep.

Reemplace el segundo lavado con 40 mililitros del medio sin antibióticos. Luego, cultive los parásitos a 37 grados Celsius bajo un 5% de dióxido de carbono durante dos horas. Después de dos horas, transfiera los medios de las placas a los tubos de centrífuga y luego agrupe los huevos y los restos de lombrices a 2.000 g durante 30 minutos a cuatro grados centígrados.

Luego, recoja y transfiera el sobrenadante a un tubo nuevo. A continuación, filtre el sobrenadante a través de un filtro de jeringa de 0,22 micras y recoja la solución filtrada en una bolsa de dialización con un corte de peso molecular de 3,5 kilodaltons. Luego, dialice la solución con una solución de PEG8000 al 8% a cuatro grados centígrados durante la noche.

Este paso es importante para aumentar el rendimiento de las vesículas extracelulares. Al día siguiente, transfiera la solución dializada a un tubo nuevo y agregue 0,5 volúmenes del reactivo de aislamiento de exosomas total. Mezcle la solución hasta que esté homogénea e incube a unos cinco grados centígrados durante la noche.

A la mañana siguiente, centrifugar la mezcla a 15.000 g durante una hora a unos cinco grados centígrados. A continuación, aspire y deseche el sobrenadante, y vuelva a suspender la bolita de los EV en dos mililitros de PBS. Es probable que el perdigón no sea visible.

Para el análisis de Western blot, primero determine la concentración de proteínas de la muestra, como con el ensayo BCA. A continuación, prepare de 10 a 20 microgramos de EV en 22,5 microlitros de tampón RIPA. A continuación, añade 7,5 microlitros de tampón de carga 4X y calienta la mezcla a 95 grados centígrados durante cinco minutos.

Después del tratamiento térmico, separar las proteínas de las vesículas extracelulares en un gel 12%SDS-PAGE. Después de hacer funcionar el gel, las proteínas se transfieren a la membrana de PVDF. Pruebe la membrana con anticuerpos anti-CD63 en una dilución de uno a 1.000.

A continuación, tratar la membrana con IgG-HRP anti-conejo en una dilución de uno a 5.000. Ahora, use un reactivo de detección ECL para desarrollar la membrana y siga con el análisis en un sistema de imágenes de quimioluminiscencia. Comience transfiriendo cinco microgramos de muestra a un tubo de ultracentrífuga de polipropileno y ajuste el volumen a 12 mililitros con medio RPMI-1640.

A continuación, centrifugar la muestra a 110.000 g durante 90 minutos a cuatro grados centígrados. Después de la centrifugación, aspire con cuidado y deseche el sobrenadante. A continuación, prepare una suspensión de vesícula extracelular 2X añadiendo un mililitro de diluyente C al pellet.

Vuelva a suspender el pellet con un pipeteo suave. Ahora, prepare una nueva solución de tinte 2X. Agregue dos microlitros del colorante etanólico PKH67 a un mililitro de diluyente C en un tubo de microfuga y mezcle bien.

A continuación, tiñe la muestra mezclando las dos soluciones e incubando la mezcla a temperatura ambiente durante cuatro minutos. A continuación, detenga la mancha agregando cuatro mililitros de FBS y espere un minuto más. Luego, agregue el medio RPMI-1640 para ajustar el volumen a 12 mililitros y gire la suspensión para aislar las vesículas teñidas.

Retire y deseche el sobrenadante. A continuación, vuelva a suspender los EV peletizados con la etiqueta PKH67 en 12 mililitros de medio RPMI-1640. A continuación, repita la centrifugación, pero esta vez recoja las vesículas en un mililitro de PBS.

Para el ensayo de absorción, prepare cultivos nocturnos de células de mamíferos en placas de seis pocillos. A la mañana siguiente, agregue cinco microgramos de vesículas marcadas con PKH67 a cada pocillo y continúe el cultivo durante dos a cuatro horas. Después de la incubación, retire el medio y lave las células con PBS dos veces.

Luego, fije las células durante 15 minutos, lávelas dos veces con PBS y tíñelas con DAPI antes de obtener imágenes. Los esquistosomas en la etapa hepática se recolectaron de conejos 28 días después de la infección. A continuación, se recogieron vesículas extracelulares de los gusanos esquistosomas y se analizaron.

Su tamaño de partícula, determinado por el análisis de nanopartículas de Malvern, oscilaba entre 100 y 400 nanómetros, con la mayor parte de la población cerca de los 220 nanómetros. La microscopía electrónica de transmisión reveló que las vesículas extracelulares eran redondas y tenían entre 100 y 200 nanómetros de diámetro. El análisis de Western blot indicó que las vesículas extracelulares aisladas se reconocieron mediante anticuerpos CD63, que es un marcador típico de vesículas extracelulares.

La microscopía de fluorescencia de vesículas extracelulares marcadas con PKH67 internalizadas por las células del clon 1469 de NCTC mostró que las vesículas extracelulares se distribuían principalmente en el citoplasma de las células receptoras. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo aislar EV en un medio de cultivo in vitro de Schistosoma japonicum adulto.