Name: Desthiobiotin-estreptavidina-afinidad mediada por purificación de proteínas de interacción con RNA en células de mesotelioma (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-04-25T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 11 s
Description: Aprende a capturar proteínas citosólicas que se unen a secuencias específicas de ARN en células de mesotelioma mediante el uso de ARN marcado con destiobiotina. Este método permite identificar proteínas de unión al ARN y estudiar la estabilidad del ARNm.

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Este trabajo fue apoyado por la concesión de la Sinergia de la Fundación de ciencia nacional suizo CRSII3 147697, la Stiftung für Angewandte Krebsforschung y Zürich Krebsliga.

1. preparación de la fracción de proteínas citosólicas y nucleares
<ol><li>Placa 4 x 106 ACC-MESO-4 células en un frasco de cultivo celular T150 cultivadas en RPMI - 1640 medio suplementado con 10% FBS, 1 x penicilina/estreptomicina (100 x) y 2 mM L-glutamina (200 mM). Cuando las células alcanzan una confluencia del 80-90% (~5-5.5 x 106 células), proceder a la extracción de proteínas de la fracción nuclear y citosólica. Nota: Línea de celular de ACC-MESO-4 se obtuvo de la RIKEN BioResource centro11.</li>
	<li>Aspire medio, lave las células añadiendo 15 mL de PBS 1 x, incline la placa suavemente unas cuantas veces y aspirar el PBS 1 x. Añadir 3 mL de 0.25% tripsina-EDTA e Incube el frasco de cultivo a 37 ° C durante 3 minutos. Nota: Observar las células bajo el microscopio para la separación; Si todavía toma el frasco contra la palma de la mano 3 veces.</li>
	<li>Agregar 7 mL de Medio RPMI-1640 suplementado con 10% FBS, penicilina/estreptomicina de 1 x (100 x) y 2 mM L-glutamina (200 mM), recoger las células en un tubo de 15 mL y desactivación a 200 x g durante 5 minutos.</li>
	<li>Medio de aspirar y resuspender el pellet celular con 1,5 mL de 1 x PBS, luego transferir las células a un tubo de microcentrífuga de 1,5 mL. Desactivación a 500 x g y 4 ° C por 5 min, descartar el sobrenadante. Nota: De este paso adelante, realice todos los pasos de centrifugación a 4 ° C y mantener todos los reactivos en el hielo.</li>
	<li>Resuspender el precipitado de células con helado 1,5 mL de 1 x PBS y rotación de las células a 500 x g y 4 ° C por 3 minutos descarte el sobrenadante. Nota: Las cantidades necesarias de CER I, II CER y NER reactivos son 10, 0.55 y 5 volúmenes de pellets Estimado celular lleno de volumen, respectivamente; el siguiente protocolo asume un volumen de 20 μl. Recomendamos preparar únicamente la cantidad necesaria de reactivo CER yo.</li>
	<li>Añadir 200 μL de reactivo de extracción citoplásmico helada (CER I) suplementado con 2 μl de 1 x inhibidor de la proteinasa, por ejemplo, diluir 1 tableta de inhibidor de la proteasa (EDTA-libre) en 500 μl de agua para obtener 100 acciones de x. Esta cantidad de reactivo CER basta para lyse 20 μl de un volumen el sedimento celulares.<ol>
<li>Para estimar el volumen de pellets embalado célula, comparar el tubo que contiene el precipitado de células con un tubo de 1,5 mL con 10, 20, 50 o 100 μl de PBS 1 x.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Resuspender el precipitado de células por Vortex vigorosamente el tubo por 15 s e incubar el tubo en hielo por 10 minutos Añadir 11 μl del reactivo de extracción citoplásmico helada II (CER II) al tubo, vortex vigorosamente durante 5 s e incubar 1 minuto en el hielo.</li>
	<li>Vortex vigorosamente durante 5 s y centrifugar el tubo a 16.000 x g y 4 ° C por 5 min transferir el sobrenadante a limpiado tubo previamente enfriado en hielo. El sobrenadante es la fracción citoplasmática que es más utilizado en el experimento de RNA-telecine.</li>
	<li>Resuspender el precipitado quedado en 100 μl de reactivo de extracción nuclear helada (NER) suplementado con 1 μl de inhibidor de la proteinasa (100 x) y vigorosamente en vortex por 15 s. Recomendamos preparar únicamente la cantidad necesaria de reactivo NER suplementado con los inhibidores de la proteasa.</li>
	<li>Incubar la muestra en hielo durante 40 minutos con Vortex ocasional por 15 seg (cada 10 min).</li>
	<li>Centrifugar el tubo a 16.000 x g durante 10 min. traslado el sobrenadante (esto es la fracción de proteína nuclear) a un tubo limpio previamente enfriado.</li>
	<li>Inmediatamente se procederá a medir la concentración de proteínas utilizando el método de bicinchoninic (BCA) (véase Tabla de materiales). Para el control de pureza de proteínas de cada fracción, realizar immunoblotting (figura 1) contra α-tubulina (detección positiva sólo en la fracción citosólica) y de la poli ADP-ribosa polimerasa - PARP (detección positiva sólo en la fracción nuclear). Para la visualización de proteínas, consulte la sección 4.</li>
	<li>Para mantener la actividad de la proteína y su estado natal, preparar 25 μl de alícuotas de extractos citosólicas y nucleares. Rápido-congele estas alícuotas colocándolos en nitrógeno líquido durante 5 s y tienda directamente a-80 ° C.</li>
</ol>2. etiquetado de ARN con Desthiobiotin
<ol><li>Sondas de RNA sintetizado comercialmente y HPLC purificada. Resuspender con agua libre de nucleasas en 10 μm. Nota: Las secuencias sonda se enumeran en la tabla 1.</li>
	<li>Uso 50 pmol de RNA por reacción RNA-telecine. Descongelar y mantener todos los reactivos en el hielo excepto para clavija 30%, utilizado para la etiqueta 3' terminal del RNA oligo.</li>
	<li>5 μl de 10 μm RNA puntas de prueba, etiquetado como CALB2 3' UTR (son) la transferencia, CALB2 3' UTR (mtARE) y ARN-Unrelated (IRE), en 0.5 mL pared delgada microcentrífuga los tubos e incubar en una máquina PCR a 85 ° C por 5 minutos colocar los tubos inmediatamente en hielo. Nota: Este paso es importante, ya que fomenta la relajación y la accesibilidad de la sonda de RNA para el etiquetado.</li>
	<li>Para una sola reacción de 30 μL, añada al tubo que contiene el RNA la siguientes 10 μl mezclar: 3 μl de agua libre de nucleasa, 3 μl de 10 x Buffer de reacción RNA ligasa, 1 μl de inhibidor de la Rnasa (40 U/μL), 1 μl de Desthiobiotinylated citidina bifosfato (1 mM) y 2 μl de ligasa de T4 RNA (20 U/μL). Nota: Para preparar mezcla principal A 3 muestras en exceso (3.2), la mezcla 9,6 μl de nucleasa agua libre, 9,6 μl de 10 x Buffer de reacción RNA ligasa, 3,2 μl de inhibidor de la Rnasa (40 U/μL), 3,2 μl de Desthiobiotinylated citidina bifosfato (1 mM) y 6.4 μL de ligasa de T4 RNA (20 U/μL).</li>
	<li>Agregar cuidadosamente 15 μl de PEG 30% a la reacción. Use otro Consejo para mezclar la reacción. Incubar la reacción durante la noche a 16 ° C.</li>
	<li>Al día siguiente, preparar los siguientes: 5 M de NaCl (fresh nucleasa-libre), cloroformo: alcohol isoamílico en proporción 24:1 (por ejemplo, por reacción - 96 de μl de cloroformo y 4 μL de alcohol isoamílico), helada 100% de etanol y etanol al 70% helada.</li>
	<li>Añadir 70 μl de agua libre de nucleasa en los tubos de la reacción RNA-etiquetado. Añada 100 μl de cloroformo: isoamílico alcohol y agitar brevemente. La desaceleración a 13.000 x g por 3 minutos cuidadosamente quitar sólo la fase superior y la transferencia a un nuevo tubo libre de nucleasa 1.5 mL; Evite tocar la fase inferior.</li>
	<li>Añadir 10 μl de NaCl 5 M, 1 μl de glucógeno y 300 μL de etanol al 100% helado. Coloque el tubo a-20 ° C por 2 h. Nota: En este paso, el experimento puede continuarse al día siguiente.</li>
	<li>Centrifugar a 13.000 x g y 4 ° C durante 15 minutos eliminar cuidadosamente el sobrenadante sin perturbar el pellet. Añadir 300 μL de helada etanol al 70% y centrifugar a 13.000 x g y 4 ° C durante 5 minutos.</li>
	<li>Descartar completamente el sobrenadante y secar el pellet (15 min). Resuspender el precipitado en 20 μl de agua libre de nucleasa. Nota: Proceda con RNA-desplegable en el mismo día.</li>
	<li>Incubar el RNA a 90 ° C por 2 min y coloque en hielo. Coloque el RNA marcado en hielo durante el siguiente paso de prelavado de las bolas magnéticas de estreptavidina. Nota: Un tiempo de incubación más largo puede dañar la sonda de RNA.</li>
</ol>3. ARN-proteína telecine
<ol><li>
Pre-lavado de granos magnéticos de estreptavidina e incubación con desthiobiotin-RNA
	<ol>
<li>Utilizar 50 μl de granos magnéticos estreptavidina por 50 pmol de RNA. Sin embargo, esto debe ser optimizado dependiendo el experimento.</li>
		<li>Vórtice el tubo con granos estreptavidina-magnéticos para 15 s y rápidamente eliminar 200 μl (mezcla principal; suficiente para reacciones de 3 + 1) en un tubos safe-lock de 1,5 mL limpia usando corta puntas de pipeta. Coloque el tubo sobre un soporte magnético para que los granos de recogen en el lado del tubo y esperan 1 minuto, retire el líquido de resuspensión.</li>
		<li>Lavar los granos, quitar el tubo del soporte magnético, añadir 400 μL de 0,1 M NaOH 0.05 M de NaCl solución y suavemente pipeta arriba y abajo varias veces. Coloque el tubo en el soporte magnético. Esperar 1 minuto y recoger el sobrenadante. Repita este paso otra vez.</li>
		<li>Lavar los granos con 200 μL de 100 mM de NaCl. Eliminar el sobrenadante.</li>
		<li>Añadir 200 μL de 20 mM Tris (pH 7.5), suspender cuentas mediante pipeteo, coloque el tubo en el soporte magnético, espere 1 minuto y eliminar el sobrenadante. Repita el paso.</li>
		<li>Retire el tubo del soporte magnético, añadir 200 μL de 1 x de buffer de captura RNA y resuspender granos magnéticos estreptavidina por Vortex brevemente. Quitar 50 μl de granos magnéticos estreptavidina y añada a cada tubo marcado-RNA utilizando una pipeta de corte. Incubar los tubos durante 30 min a temperatura ambiente en un rodillo.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Atascamiento de la proteína al RNA
	<ol>
<li>Colocar los tubos en un soporte magnético, esperar 1 minuto y eliminar el sobrenadante.</li>
		<li>Añadir 50 μl de 20 mM Tris (pH 7.5) a los granos y resuspender mediante pipeteo. Colocar los tubos en un soporte magnético, esperar 1 minuto y eliminar el sobrenadante. Repita este paso.</li>
		<li>Añadir 100 μl de 1 x de tampón de Unión proteína-ARN a las cuentas y resuspender mediante pipeteo.</li>
		<li>Mientras tanto, prepare la siguiente mezcla: 10 μl de 10 x tampón de Unión proteína-RNA, 30 μl de glicerol 50%, 50 μg de proteínas citoplasmáticas y libre de nucleasas hasta 100 μl de agua. Nota: Preparar mezcla master B de 3 muestras en exceso (3.3) como sigue: 33 μl de 10 x tampón de Unión proteína-RNA, 99 μl 50% glicerol, 165 μg de proteínas citoplásmicas y agua libre de nucleasas hasta 330 μl. Mantenga el tubo de mezcla master B en el hielo.</li>
		<li>Colocar los tubos en soporte magnético, espere 1 minuto y recoger el sobrenadante. Añada 100 μl de la mezcla principal B, suspender transfiriendo suavemente hacia arriba y hacia abajo y no crear burbujas. Incubar los tubos de reacción de 60 minutos a 4 ° C en un rodillo.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Lavado y elución
	<ol>
<li>Colocar los tubos en un soporte magnético, recoger el sobrenadante (que es el flujo a través de - FT) y transferir a un tubo nuevo. Nota: Mantener esta FT en hielo para su posterior análisis.</li>
		<li>Pipetear 100 μl de 1 x de tampón de lavado en las cuentas, resuspender suavemente, vuelva a colocar en el soporte magnético, esperar 1 min y descarte el sobrenadante. Repetir este paso 2 veces.</li>
		<li>Agregar 40 μl de tampón de elución a las bolas magnéticas y mezclar mediante pipeteo arriba y abajo, incubar a 37 ° C en un agitador de tubos (950 rpm) durante 30 minutos.</li>
		<li>Colocar los tubos en un soporte magnético, esperar 1 min y recoger muestras eluídas (que es el eluido - E). Coloque en hielo y utilizar para posteriores análisis. Nota: En este paso, cada prueba RNA sonda consiste en un paso (FT) y la muestra de efluente (E).</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. poliacrilamida electroforesis y Western Blot análisis
Nota: Consulte la tabla 2 para las recetas de los buffers utilizados en esta sección. Realizar un Western blot según el método de Laemmli12.
<ol><li>Handcast 12% geles de SDS-PAGE (10-pozos, separador de 1,5 mm, 66 μL). Preparar una mezcla de gel de corriente: 4 mL de solución stock de 30% acrilamida-bisacrilamida, 2,4 mL de Tris inferior del almacenador intermediario, 3,2 mL de dH2O, 9,6 μl de TEMED, 96 μl de solución de persulfato de amonio 10% (APS). Preparar la mezcla de gel de apilamiento: 3,25 mL de dH2O 0,5 mL de 30% acrilamida - bisacrilamida solución, 1,3 mL de tampón Tris superior, 10 μl de TEMED, 20 μl de 10% APS.</li>
	<li>Añadir a 16.6 μl de tampón de x Laemmli 6 (p. ej., 14 mL de pH 6.8 de Tris/HCl/SDS (tampón de Tris superior), 2 g de SDS, 1,86 g de la TDT, 6 mL de glicerol y 0.012% bromofenol azul; almacenar a-20 ° C) en la muestra FT y 6,6 μl de tampón de x Laemmli 6 en muestra de E. Incubar las muestras durante 5 min a 95 ° C.</li>
	<li>Las muestras (20 μl del FT y eluir ~ 40 μL) de la carga y correr durante 30 min a 60 V, continuando con 20 V durante la noche.</li>
	<li>Utiliza un sistema de electroblotting semiseco, transferencia de proteínas a una membrana PVDF para 80 min a 15 V. Nota: La membrana PVDF debe ser activada antes de realizar la transferencia de la proteína. Incubar la membrana en metanol al 100% por 1 min, seguido de una incubación de 2 minutos en agua ultrapura.</li>
	<li>Después de la transferencia de la proteína, incubar el gel SDS-PAGE con la solución de Coomassie para 3 h, seguido de tres pasos de lavado con agua ultrapura, cada 30 minutos.</li>
	<li>Al final de la transferencia de la proteína, deje que la membrana PVDF seque por 1 h. reactivar la membrana como se indica en el paso 4.5. Bloquear la membrana 1 h con 5% de BSA en 1 x TTBS.</li>
	<li>Incubar la membrana con el primer anticuerpo: HuR o mesothelin, tanto diluyeron 1: 1000 en 5% de BSA en 1 x TTBS de 4 h a temperatura ambiente o durante la noche a 4 ° C.</li>
	<li>Lavar la membrana tres veces por 7 min en 1 x TTBS e incubar con la peroxidasa conejo anti-ratón (HRP)-anticuerpo secundario conjugado diluido 1: 10,000 en 5% BSA, 1 x TTBS.</li>
	<li>Visualizar las proteínas mediante quimioluminiscencia mejorada y un reproductor de imágenes digital.</li>
</ol>

<ol><li>Glisovic, T., Bachorik, J. L., Yong, J., Dreyfuss, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA-binding+proteins+and+post-transcriptional+gene+regulation%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Letters%22%5BJournal%5D)">RNA-binding proteins and post-transcriptional gene regulation.</a> FEBS Letters. 582 (14), 1977-1986 (2008).</li>
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</ol>

Los autores declaran que no tienen intereses financieros que compiten.

3' UTRs pertenecen al genoma no codificante3, y todos los RNAs no codificantes pueden interactuar con proteínas para ejercer su función7. Cuando el genoma mamífero fue encontrado para ser transcrito lo impregna y produjeron una porción significativa de larga noncoding RNAs16, nuevas evidencias demostraron que estos larga noncoding RNAs función en la regulación de expresión génica al interactuar con remodelación de cromatina complejos<sup class="xref"...

Expresión génica y el nivel final del producto del gene pueden ser reguladas fuertemente afectando la estabilidad del ARNm y ARNm traducción tarifa1. Estos mecanismos de regulación postranscripcional se ejercen a través de las interacciones de no codificante del RNA y RNA-que ata las proteínas (restrictivas) con el mRNA específicos. Generalmente es el 3' región sin traducir de mRNA (3' UTR - pertenecientes a la parte no codificante del genoma2) que contiene específico cis-elementos reguladores (CRE), que son reconocidos por trans-actúan factores como miRNA o restrictivas 3. el mejor estudio cis-elemento dentro de los 3' UTR, es el adorno de elementos ricos en adenina (son), que es reconocido por proteínas específicas AU (AUBP) y, a su vez, induce o mRNA degradación/deadenylation (mediada son decaimiento) o mRNA estabilización4.
El tamaño de los 3' UTR del calretinin mRNA (CALB2) es 573 bp largo y contiene una supuesta AUUUA pentámero, como AREsite2, una herramienta bioinformática del5. Consistente con la presencia de un supuesto motivo son, el análisis de vector-reportero de pmirGLO había demostrado un papel de estabilización de este elemento dentro de mRNA CALB26. Por último, el en vitro RNA-telecine se utilizó para identificar la AUBP que estabiliza calretinin mRNA mediante el adorno son.
Pues todo no-codificación RNAs interactúan con proteínas7, el en vitro RNA-telecine es una buena forma y análisis de primera de elección para la identificación de RNA-interactianos a ayudar a descifrar los mecanismos moleculares. En este método de RNA-telecine, comercialmente sintetizadas sondas de RNA, que fueron etiquetadas con una forma modificada de la biotina (desthiobiotin) en la terminal 3' de la hebra de RNA, fueron utilizadas. El RNA-desthiobiotin se inmoviliza mediante la interacción con estreptavidina en granos magnéticos, que se utilizan para tirar abajo proteínas que interaccionan específicamente con el limite-RNA de interés. Proteínas no desnaturalizadas y activas de la fracción citosólica de las células del mesotelioma se utilizan como fuente de proteínas. Tales proteínas RNA-bound se eluyen de las bolas magnéticas, a través de un gel de SDS-PAGE de 12%, transferidos a una membrana y sondeado con los diferentes anticuerpos.
En el procedimiento de purificación de afinidad estándar de estreptavidina-biotina, desnaturalización dura condiciones se requieren interrumpir el vínculo fuerte biotina-estreptavidina irreversible para eluir las proteínas límite8, que podría conducir a la disociación de complejos de la proteína. A diferencia de la biotina, desthiobiotin se une a estreptavidina reversible y se desplaza competitivamente con una solución de biotina, lo que permite la elución suave de proteínas y evitar el aislamiento de naturalmente biotinilado moléculas9 lo que sugiere que la técnica es ideal para el aislamiento de complejos de proteína nativa en condiciones nativas.
In vitro condiciones obligatorias y rigor, que están determinadas por la concentración de sales, agentes reductores y porcentaje de detergente, deben estar cerca de los presentes en el contexto celular con el fin de identificar interacciones de verdad en vivo . Las condiciones vinculantes en este documento han sido previamente demostradas según corresponda para la identificación de lo HuR como una AU-que atan la proteína10. Este enfoque podría ahorrar tiempo, ya que la optimización de las condiciones de enlace adecuada puede ser difícil y desperdiciador de tiempo. Además, este método podría utilizarse como un protocolo inicial para cualquier experimento de RNA-desplegable y puede optimizarse gradualmente cambiando la concentración de sales y detergentes, cambiando el porcentaje de glicerol y adición de otras sales. Por otra parte, hemos demostrado que incluso una corto 25-nucleótido RNA sonda albergando un pentámero son motivo podía utilizarse para demostrar la interacción con una AUBP específico.

<table><tbody><tr><td>NE-PER Kit de extracción nuclear y citoplasmática</td><td>Thermo Fisher Scientific&nbsp;</td><td>78833</td><td></td></tr><tr><td>Pierce Tabletas inhibidoras de la proteasa, sin EDTA</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A32965</td><td></td></tr><tr><td>Pierce BCA Protein Assay Kit</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>23225</td><td></td></tr><tr><td>Pierce Magnetic RNA-protein Pull-Down Kit&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>20164</td><td>Incluye perlas magnéticas y, por lo tanto, el kit debe almacenarse a 4 & grados; </td></tr><tr><td>C Pierce ARN 3' Kit de destiobiotinilación &nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>20163</td><td>El kit forma parte del "Pierce Magnetic RNA-protein Pull-Down Kit" y debe almacenarse a -20 °C; C, a diferencia del kit desplegable (4 &deg; C).</td></tr><tr><td>DynaMag-2,&nbsp; soporte magnético</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>12321D</td><td></td></tr><tr><td>Anticuerpo monoclonal Anti - HuR (MOUSE)</td><td>Thermo Fisher</td> <td>Scientific-El</td> <td>anticuerpo está incluido en el Pierce Magnetic RNA-protein Pull-Down Kit&nbsp; - 1:1000 en 5% BSA 1x TTBS - anticuerpo secundario anti-ratón de conejo 1:10.000 en 5% BSA 1x TTBS</td></tr><tr><td>Anti - &alfa; - tubulina (MOUSE) anticuerpo monoclonal</td><td>Santa Cruz</td><td>8035</td><td>1:1000 en 5% BSA 1x TTBS - anticuerpo secundario anti-ratón conejo 1:10.000 en 5% BSA 1x TTBS</td></tr><tr><td>Anti - PARP (CONEJO) Anticuerpo policlonal</td><td>Cell Signaling</td><td>9542</td><td>1:1000 en 5% BSA 1x TTBS - anticuerpo secundario anti-conejo de cabra 1:10.000 en 5% BSA 1x TTBS</td></tr><tr><td>Anti - Mesothelin (MOUSE) Anticuerpo Monoclonal &nbsp;</td><td>Rockland</td><td>200-301-A87</td><td></td></tr><tr><td>Anticuerpo secundario anti-conejo de cabra</td><td>Cell Signaling</td><td>7074</td><td></td></tr><tr><td>Anticuerpo secundario anti-ratón de conejo</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A-9044</td><td></td></tr><tr><td>RPMI - 1640 medio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R8758</td><td></td></tr><tr><td>FBS - Suero bovino filtrado</td><td>Pan Biotech&nbsp;</td><td>P40-37500</td><td></td></tr><tr><td>Penicilina - estreptomicina (100x)</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td>P4333</td><td></td></tr><tr><td>Solución de L-Glutamina (200 mM)</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td>G7513</td><td></td></tr><tr><td>0.25% Tripsina-EDTA (1x)</td><td>Gibco de Life technologies&nbsp;</td><td>25200-056</td><td></td></tr><tr><td>Mini-PROTEAN 3 celdas</td><td>Bio-Rad</td><td>1653301</td><td></td></tr><tr><td>Mini Placas de vidrio del sistema Protean&nbsp;</td>Placas espaciadoras <td>Bio-Rad</td><td>1653308</td><td></td></tr><tr><td>Mini-PROTEAN con espaciador integrado de 1,5 mm</td><td>Bio-Rad</td><td>1653312</td><td></td></tr><tr><td>Peine Mini-PROTEAN, 10 pocillos, 1,5 mm, 66 y micro; L</td><td>Bio-Rad</td><td>1653365</td><td></td></tr><tr><td>Mini-PROTEAN Módulos de fundición de tetra célula</td><td>Bio-Rad</td><td>1658050</td><td></td></tr><tr><td>Solución de descontaminación de RNasa RNaseZap</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>AM9780</td><td></td></tr><tr><td>Rotiphorese gel 30 - solución madre acuosa de acrilamida y bisacrilamida al 30% a una proporción de 37,5:1</td><td>Roth</td><td>3029</td><td></td></tr><tr><td>20% SDS&nbsp;</td>Membrana de transferencia de PVDF <td>PanReac AppliChem</td><td>A3942</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td>Perkin Elmer</td><td>NEF1002</td><td>Debe activarse incubando en metanol puro durante 1 minuto seguido de lavado en agua durante 2 minutos&nbsp;</td></tr><tr><td>Célula de transferencia semiseca Trans-Blot SD&nbsp;</td><td>Bio-Rad</td><td>1703940</td><td></td></tr><tr><td>Clarity Western ECL Sustrato</td><td>Bio-Rad</td><td>1705061</td><td></td></tr><tr><td>FusionFX&nbsp; Generador de imágenes digital</td><td>Vilber-síntesis</td> <td>de</td><td></td></tr> <tr><td>oligonucleótidos de ARN</td><td>Mycrosynth AG, Suiza:</td><td></td> <td>la escala de síntesis - 0,04 y micro; mol -</td></tr><tr><td>Albúmina sérica bovina</td> purificada por HPLC <td>Sigma-Aldrich</td><td>A7030</td><td></td></tr><tr><td>Ácido clorhídrico (HCl) 6 M</td><td>PanReac AppliChem</td><td>182883.1211</td><td></td></tr><tr><td>Ultra Puro 1 M Tris, pH 7.5&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific 15567027</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Glicerol &nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>17904</td><td>50% de alícuotas estériles para almacenar a -20 grados; C</td></tr><tr><td>Pierce Streptavidin perlas magnéticas&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>88817</td><td>Tenga en cuenta que estas perlas magnéticas tienen un diámetro promedio de 1 y micro; m (rango de 0,5 a 1,5 y micro; m). Además, Dynabeads-M280 Streptavidin, que son perlas de tamaño homogéneo 2.8 y micro; m, también se utilizan en la extracción de ARN, pero tenga en cuenta que esto puede afectar el proceso de purificación.</td></tr><tr><td>TEMED</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T9281</td><td></td></tr><tr><td>Persulfato de amonio&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A3678</td><td></td></tr><tr><td>Coomassie G-250</td><td>Applichem</td><td>A3480</td><td></td></tr><tr><td>Sulfato de aluminio-(14-18)-hidratado;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>368458</td><td></td></tr><tr><td>ácido ortofosfórico&nbsp;</td><td>Pliego</td><td>A0637</td><td></td></tr></tbody></table>

desthiobiotin-estreptavidina-afinidad mediada por purificación de proteínas de interacción con rna en células de mesotelioma

Desthiobiotin-Streptavidin-Affinity Mediated Purification of RNA-Interacting Proteins in Mesothelioma Cells

El en vitro RNA-telecine se utiliza todavía en gran parte en los primeros pasos de protocolos dirigidos a identificar proteínas de unión de ARN que reconocen determinados motivos y estructuras de ARN. En este protocolo de RNA-telecine, comercialmente sintetizadas sondas de RNA están marcadas con una forma modificada de la biotina, desthiobiotin, en el 3' terminal del filamento del RNA, que se une reversiblemente a estreptavidina y permite así la elución de proteínas bajo más fisiológica condiciones. El RNA-desthiobiotin se inmoviliza mediante la interacción con estreptavidina en granos magnéticos, que se utilizan para tirar abajo proteínas que interaccionan específicamente con el RNA de interés. Proteínas no desnaturalizadas y activas de la fracción citosólica de las células del mesotelioma se utilizan como fuente de proteínas. El método aquí descrito puede aplicarse para detectar la interacción entre proteínas RNA conocidas y una sonda de RNA largo (nt) de 25 nucleótidos que contiene una secuencia de interés. Esto es útil para completar la caracterización funcional de estabilizar o desestabilizar elementos presentes en las moléculas de ARN alcanzadas usando un análisis de vectores de reportero.

En este experimento, un fragmento largo 25-nt de calretinin 3' UTR que es motivo (CALB2 3' UTR (son) 25-nt) fue utilizado para probar si se une específicamente a la proteína del antígeno humano R (HuR), un conocido estabilizador de mRNA. Para probar la especificidad del elemento son, un RNA 25 nt sonda CALB2 3' UTR (mtARE) que contiene una mutación son Adorno, que previamente fue demostrada para suprimir el efecto de estabilización del motivo son, fue usado6. El AR...

Desthiobiotin etiquetado de un sintético 25-nucleótido RNA oligo, que contiene un motivo de elementos ricos en adenina (ARE), permite la unión específica de proteína citosólica son.

Desthiobiotin-estreptavidina-afinidad mediada por purificación de proteínas de interacción con RNA en células de mesotelioma

The in vitro RNA-pulldown is still largely used in the first steps of protocols aimed at identifying RNA-binding proteins that recognize specific RNA ...

El objetivo general de este procedimiento es capturar la proteína citosólica que se une a una secuencia específica ubicada en la molécula de ARN en las células de mesotelioma. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la biología del ARN, como si una proteína de unión al ARN predicha puede unirse a la adenosina o a una secuencia rica en orina en una transcripción. La principal ventaja de esta técnica es que complementa la caracterización funcional de los elementos estabilizadores o desestabilizadores evaluados por el ensayo reportero.La Dra. Jelena Kresoja-Rakic, investigadora postdoctoral de mi laboratorio, demostrará esta técnica. Para comenzar el protocolo, obtenga celdas ACC-MESO-4 previamente preparadas con una confluencia del 80 al 90%. Aspire el medio, lave las células con 15 mililitros de solución salina tamponada con fosfato 1X, o PBS, y aspire el PBS.A continuación, agregue tres mililitros de tripsina-EDTA al 0,25% e incube el matraz de cultivo a 37 grados centígrados durante tres minutos. Agregue siete mililitros de medio RPMI-1640 suplementado, recoja las células en un tubo de 15 mililitros y gírelas a 200 veces g durante cinco minutos. A conti

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Research

Investigación

JoVE Journal

Cancer Research

Investigación del cáncer

Un obstáculo importante para los análisis bioquímicos de los ribosomas que contienen naciente peptidil-ARNt ha sido la presencia de los ribosomas otros en las mismas muestras, los ribosomas no participan en la traducción de la secuencia del ARNm específico que se analiza. Hemos desarrollado una metodología sencilla para purificar, exclusivamente, los ribosomas que contiene la naciente peptidil-tRNA de interés.

El aislamiento de los ribosomas traducir contienen peptidil-ARNt para el Análisis Funcional y Estructural

Este video muestra un ensayo de extracción de ARN in vitro para identificar proteínas de unión a ARN (RBP), que interactúan con las secuencias de elementos ricos en adenilato-uridilato (ARE) en el ARNm. Las RBP diana de un lisado celular se mezclan con una sonda de ARN para formar complejos de ARN-proteína. Los complejos se aíslan mediante purificación por afinidad utilizando la afinidad de la marca de destiobiotina de la sonda de ARN a una perla magnética marcada con estreptavidina.

Ensayo de arn-proteína para aislar proteínas de unión a ARN mediante extracción por afinidad

Las interacciones ARN-proteína se encuentran en el corazón de muchos procesos celulares. Aquí, describimos un método in vivo para aislar ARN específico e identificar nuevas proteínas que están asociadas con él. Esto podría arrojar nueva luz sobre cómo se regulan los ARN en la célula.

Nuevas proteínas de unión a ARN aislamiento por la Metodología RaPID

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Purificación de proteínas de superficie celular biotiniladas de<em&gt; Rhipicephalus microplus</em&gt; Células epiteliales intestinales

Este informe describe un método rápido y confiable para la validación de blancos del mRNA de miRNAs celular. Los usos del método biotinilado sintético basado en la LNA de ácido nucleico bloqueado miRNA imita para capturar objetivo mRNA. Posteriormente, se emplean bolas magnéticas recubiertas de estreptavidina para telecine blanco mRNA para la cuantificación por reacción en cadena de polimerasa qPCR.

Desplegable base de biotina de ensayo a validar mRNA miRNAs objetivos de celular

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Un procedimiento de aislamiento de RNA tándem basada en oligonucleótidos recuperar complejos eucariotas ARNm-proteína

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Solo paso purificación de complejos macromoleculares utilizando RNA unido a biotina y un enlazador foto escindibles

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Un análisis extraíble cuantitativo optimizado de proteínas de unión al ARN utilizando ARN biotinilado corto

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Desthiobiotin-estreptavidina-afinidad mediada por purificación de proteínas de interacción con RNA en células de mesotelioma

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