Name: Un rápido y fácil tubería para generar genómica punto mutantes de C. elegans utilizando CRISPR/Cas9 ribonucleoproteínas (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-04-30T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 37 s
Description: Aprende a generar mutaciones puntuales genómicas en C. elegans utilizando ribonucleoproteínas CRISPR/Cas9 y plantillas de reparación dirigida por homología. Este método permite estudios funcionales de variantes genéticas en neurociencia.

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Hay no hay conflictos de intereses relacionados con este informe.

Todos los procedimientos experimentales y cuidado de los animales siguieron la pauta de los institutos nacionales de salud y el cuidado Animal institucional y Comité uso (IACUC) en la Universidad de Michigan. Usar soluciones libres de RNasa y pipetear consejos en todo el protocolo. Limpie el área de trabajo, pipetas, tubos y centrifugar con solución de Rnasa descontaminación siguiendo las pautas del fabricante (ver Tabla de materiales).
1. sgRNA selección de objetivos
<ol><li>Mediante un explorador web, abra la página web: http://crispor.tefor.net8<ol>
<li>Entrada ~ 60 pares de bases (PB) de secuencia que flanquean la edición deseada de interés (es decir, 30 bp 5' y 3' de la edición deseada).</li>
		<li>Seleccione el genoma de Caenorhabditis elegans en el menú desplegable.</li>
		<li>Seleccione el motivo adyacente de Protospacer (bp-NGG - SpCas9, 20 SpCas9-HF1, eSPCas9 1.1) desde el menú desplegable.</li>
		<li>Haga clic en enviar. En la página de resultados, seleccione la secuencia de destino ordenada superior más cercana a la edición de interés. Si no hay ningún sitios de destino adecuado dentro de la secuencia de entrada de la bp 60 de flanqueo, ampliar la secuencia de consulta hasta 100 bp (es decir, 50 bp ambos lados de la edición).</li>
	</ol>
</li>
	<li>A partir de una fuente disponible, por ejemplo, synthego, obtener un 20-mer objetivo sgRNA con las siguientes especificaciones: 3 nmol; sin modificaciones.</li>
	<li>Tras la recepción, centrifugar sgRNA liofilizado que contienen tubo en > 12.000 x g durante 1 min a temperatura ambiente. Añadir 60 μL de TE libre de nucleasas en el tubo y Resuspenda suavemente mediante pipeteo arriba y abajo de 15 a 20 veces con una pipeta de P200. La concentración final es de 50 μm.</li>
</ol>2. homología indica reparación plantilla diseño
<ol><li>Diseñar una plantilla HDR ssODN contiene: 1) la mutación de interés, 2) un sitio único endonuclease de la restricción en-marco, 3) una mutación silenciosa de uno o ambos de los Gs dentro de la secuencia de NGG PAM y 4) 50 bp 5' y 3' homología de armas que flanquea la mutación de la primera y la última. (Figura 1) 9 , 10.<ol>
<li>Si no es posible la mutación de la secuencia de PAM NGG, introducir mutaciones silenciosas 5-6 dentro de la secuencia de reconocimiento de destino sgRNA para evitar escote sgRNA-mediada de la plantilla de informe de ssODN.</li>
	</ol>
</li>
	<li>A partir de una fuente disponible, por ejemplo, idtdna, obtener un "oligonucleótidos de ADN Ultramer" con los siguientes parámetros: escala: 4 nmol; Formulación: Ninguno; Purificación: La desalación estándar.</li>
	<li>Al recibir, de centrífuga ssODN liofilizado que contienen tubo > 12.000 x g durante 1 min a temperatura ambiente. Resuspenda suavemente ssODN a una concentración final de 100 μm en ddH libre de nucleasa2O mediante pipeteo arriba y abajo de 15 a 20 veces con una pipeta de P200.</li>
</ol>3. diseño Primers de genotipado
<ol><li>Diseño de un primer set que flanqueaban la modificación del genoma para generar un ~ 400-700 bp PCR amplicon11.</li>
	<li>Optimizar condiciones ciclo PCR para producir productos individuales y específicos11.</li>
</ol>4. preparar la mezcla de inyección
<ol><li>Centrífuga de mesa 1 reactivos a la velocidad máxima por 2 min a 4 ° C.</li>
	<li>En el orden indicado, añadir los reactivos de la tabla 1 a un tubo PCR libre de nucleasas.</li>
	<li>Mezclar bien mediante pipeteo suavemente hacia arriba y hacia abajo 10 veces con una pipeta de P20.</li>
	<li>Incubar la mezcla de inyección durante 10 min a temperatura ambiente.</li>
</ol>5. inyección protocolo
<ol><li>Micropipeta de inyección de carga con aproximadamente la mitad de la mezcla de inyección12. Guarde el resto de mezcla de inyección en caso de que la aguja se atasca o se rompe.</li>
	<li>Romper la punta de la micropipeta para que ~ 20-30 PSI produce un flujo gradual de solución12. Nota: Más grande de punta negativamente afecta la salud animal y disminuir la producción de progenie F1 .</li>
	<li>Inyectar 10 a 15 jóvenes adulto gusanos en ambos brazos gonadales si es posible12. Si no, la inyección en un brazo gonadal es suficiente.</li>
	<li>Permiten animales inyectados (P0) recuperar para 1-2 h a temperatura ambiente en una placa de los medios de comunicación (NGM) crecimiento nematodos OP50 semillas 35 mm. Posteriormente, solo inyectados P0 animales placas NGM individuales sembradas OP50 35 mm con un gusano de alambre de platino escoger12.</li>
</ol>6. pantalla P0 placas y1sola mCherry(+) F s
<ol><li>Después de la inyección dos días, identificar placas,0 P con progenie de1 F expresando mCherry en la faringe mediante un estereomicroscopio fluorescente (figura 1, día 2 - 3). Seleccione las placas de0 de tres P que contienen la mayoría de los animales1 mCherry(+) F.</li>
	<li>De cada una de las tres placas de0 de P seleccionadas, solo 8-12 mCherry(+) F1 animales para un total de 24-36 mCherry(+) F1s usando un gusano pick (figura 1, día 2 - 3). Nota: mCherry(-) animales también pueden ser destacados de estas placas de P0 , pero la probabilidad de identificar correctamente editado animales es mucho menor (figura 2A).</li>
	<li>Permiten individuales F1s para fertilizarse y poner huevos 1-2 días a temperatura ambiente.</li>
</ol>7. sencillo PCR y genotipificación del gusano
<ol><li>Después de 1-2 días de puesta de huevos, transferir la F1s en cada PCR tira casquillos del tubo que contiene 7 μl de tampón de lisis del gusano utilizando una púa de gusano (tabla 2, figura 1, día 4-5).</li>
	<li>Tubos de PCR de centrífuga a máxima velocidad durante 1 min a temperatura ambiente para traer animales a la parte inferior del tubo y la congelación de los tubos a-80 ° C durante 1 h. Nota: Gusanos pueden ser almacenados a-80 ° C indefinidamente.</li>
	<li>Lyse gusanos congelados en un termociclador con el siguiente programa: 60 ° C durante 60 min, 95 ° C durante 15 min, 4 ° C mantener.</li>
	<li>Mastermix PCR de configuración como se muestra en la tabla 3.</li>
	<li>Añadir 21 μl del mastermix PCR en tubos PCR limpios y luego añadir 4 μL de lisis de gusano del paso 3. Mezclar con una pipeta y ejecutar programa PCR siguiendo las pautas del fabricante (ver Tabla de materiales).</li>
	<li>Purificar las reacciones de PCR utilizando un kit de ADN limpio y concentrado, siguiendo las instrucciones del fabricante (ver Tabla de materiales). Eluir el ADN agregando 10 μl de agua a la columna de vuelta.</li>
	<li>Mastermix de enzima de la restricción de configuración como se muestra en la tabla 4.</li>
	<li>Añadir 10 μl de la enzima de la restricción mastermix a cada reacción de PCR limpio e incubar durante 1-2 h a 37 ° C13.</li>
	<li>Separado digerido productos de la PCR en un gel de agarosa 1.5% a 120 V con 1 x Tris-acetato-EDTA (TAE) buffer14.</li>
</ol>8. identificación y verificación de la secuencia de los animales editados
<ol><li>Examinar muestras de la enzima que digiere la presencia de bandas que indican potencial editado animales14 (figura 1, día 4-5). Nota: Cargar un control de N2 para identificar posibles mutaciones indel que pueden ser observadas como cambios en el tamaño de la banda o inesperado y complejo enzimático de la restricción digestión, los patrones de bandas.</li>
	<li>Después de identificar los posibles animales editados, utilice las restantes 3 μl de lisis de gusano y repetir la reacción de PCR. No limpie o enzimas de restricción digiere la reacción de PCR después de completar el programa. La reacción de PCR en gel de agarosa al 1%, independiente de la carga y extraer la banda utilizando un gel de extracción kit15 (ver Tabla de materiales).</li>
	<li>Gel de16 secuencia Sanger extrajo ADN utilizando la cartilla de F1 para identificar animales correctamente editados (figura 1A) Nota: Lee contendrán heterocigoto overlaid picos debido a la presencia del tipo salvaje y alelo de ingeniería.</li>
	<li>Para obtener animales homocigóticos de animales editados heterozigóticos verificados, solo 8-122 animales y realice los pasos 7-8.</li>
</ol>

<ol><li>Dickinson, D. J., Goldstein, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR-Based+Methods+for+Caenorhabditis+elegans+Genome+Engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">CRISPR-Based Methods for Caenorhabditis elegans Genome Engineering.</a> Genetics. 202, 885-901 (2016).</li>
<li>Doudna, J. A., Charpentier, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome+editing.+The+new+frontier+of+genome+engineering+with+CRISPR-Cas9%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Genome editing. The new frontier of genome engineering with CRISPR-Cas9.</a> Science. 346, 1258096(2014).</li>
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<li>Kim, S., Kim, D., Cho, S. W., Kim, J., Kim, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+efficient+RNA-guided+genome+editing+in+human+cells+via+delivery+of+purified+Cas9+ribonucleoproteins%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Res%22%5BJournal%5D)">Highly efficient RNA-guided genome editing in human cells via delivery of purified Cas9 ribonucleoproteins.</a> Genome Res. 24, 1012-1019 (2014).</li>
<li>Haeussler, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+off-target+and+on-target+scoring+algorithms+and+integration+into+the+guide+RNA+selection+tool+CRISPOR%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biol%22%5BJournal%5D)">Evaluation of off-target and on-target scoring algorithms and integration into the guide RNA selection tool CRISPOR.</a> Genome Biol. 17, 148(2016).</li>
<li>Paix, A., Folkmann, A., Seydoux, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Precision+genome+editing+using+CRISPR-Cas9+and+linear+repair+templates+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Precision genome editing using CRISPR-Cas9 and linear repair templates in C. elegans.</a> Methods. , (2017).</li>
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<li>JoVE Science Education Database. <a target="_blank" href="https://www.jove.com/science-education/5070/restriction-enzyme-digests"> Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. Restriction Enzyme Digests.</a> J Vis Exp. , (2017).</li>
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<li>Gurney, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Motor+neuron+degeneration+in+mice+that+express+a+human+Cu%2CZn+superoxide+dismutase+mutation%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Motor neuron degeneration in mice that express a human Cu,Zn superoxide dismutase mutation.</a> Science. 264, 1772-1775 (1994).</li>
</ol>

Agradecemos a los miembros del laboratorio Beg de lectura crítica de este manuscrito. Las cepas fueron proporcionadas por el centro de genética de Caenorhabditis , que es financiado por los NIH oficina de programas de infraestructura de investigación (P40 OD010440). Investigación en el laboratorio de Beg es apoyada por becas del NIH (R01 NS094678) y Asociación de la Distrofia Muscular (MDA382300) a A.A.B.

El sistema CRISPR Cas9 es una herramienta potente y eficaz para modificar precisamente el genoma de organismos modelo. Aquí, demostramos que eso quimérico sgRNAs20 junto con ssODN HDR plantillas permiten la generación altamente eficiente de genómicas mutaciones de punto en C. elegans. Importante aún, demostramos que entrega RNP produce alto rendimiento edición cuando la fluorescencia se utiliza como un marcador de selección Co, destacando la facilidad y la fiabilidad de la técnica.
<p...

Recientes avances tecnológicos han transformado radicalmente y acelera la capacidad de genomas de Ingeniero precisamente. En particular, el sistema CRISPR Cas9, que depende de la endonucleasa de RNA-dirigida Cas9 para inducir una rotura de doble cadena (DSB) cerca de la secuencia de destino de interés, se ha utilizado extensivamente para diseñar con precisión el genoma de la mayoría de organismos modelo utilizados en investigación biomédica1,2,3,4. Significativamente, el uso de CRISPR Cas9 ha desbloqueado la edición del genoma en especies difíciles como C. elegans5. Independientemente de la especie, generando mutaciones puntuales con el genoma de CRISPR-Cas9 basado en sistema de edición se basa en tres componentes básicos: 1) Cas9 endonucleasa, 2) un guía única RNA (sgRNA) que dirige la endonucleasa Cas9 para una secuencia de destino y 3) un usuario diseñado plantilla de reparación dirigido por homología (HDR) que contiene la edit(s) de interés2.
Hay varios métodos que pueden utilizar para introducir la segmentación sgRNA e Cas9 nucleasa en células como plásmido, RNA y entrega viral basado en métodos6. Recientemente, entrega directa de pre-complexed sgRNA-Cas9 ribonucleoproteínas (RNPs) ha emergido como una herramienta potente y eficaz en el genoma basado en el Cas9 CRISPR edición7. La entrega directa de pre-complexed CRISPR Cas9 RNPs tiene varias ventajas, a saber: 1) RNPs omitir la necesidad de transcripción celular y traducción 2) RNPs se eliminan rápidamente, que puede aumentar la especificidad al reducir el tiempo disponible para objetivo escote y 3) RNPs no contienen ninguna elementos extranjeros de ADN/ARN que evita la introducción de secuencias de no nativos en el genoma del anfitrión a través de la integración al azar. En conjunto, estos atributos probablemente proporcionan una breve ráfaga de objetivos CRISPR edición minimizando efectos off-target.
Se describe un protocolo sencillo y eficaz para introducir cambios genomic específico en C. elegans. Este protocolo incluye la focalización sgRNA y diseño de plantillas de informe único oligonucleótido trenzado (ssODN), secuestrantes de RNP sgRNA Cas9 y entrega y una estrategia de genotipación para la identificación inequívoca de los animales debidamente editados. Usando esta estrategia, no sólo pueden recuperar los cambios específicos del sitio que desee, pero otras mutaciones indel no específicos pueden también ser recuperados. Por lo tanto, nuestra estrategia permite la generación de una serie alélica mediante una estrategia única, donde mono-alélica, bi-alélicos y indel mutantes pueden generarse en la generación de1 F.

<table><tbody><tr><td>CRISPRevolution sgRNA&nbsp; EZ Kit</td><td>Synthego Inc.</td><td></td><td>sgRNA quimérico</td></tr><tr><td>libre de nucleasas TE</td><td>Synthego Inc.</td><td>provisto con el kit de sgRNA EZ kit</td><td></td></tr><tr><td>Agua libre de nucleasas</td><td>Synthego Inc.</td><td>provisto con el kit de sgRNA EZ kit</td><td></td></tr><tr><td>4 nmole Ultramer DNA Oligo</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td></td><td>ssODN plantilla HDR</td></tr><tr><td>Alt-R S.p. HiFi Cas9 Nucleasa 3NLS</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td>1078728</td><td>proteína Cas9</td></tr><tr><td>pCFJ90&nbsp;</td><td>Addgene</td><td>19327</td><td>Pmyo-2::mCherry Marcador Plásmido</td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma</td><td>P5405</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma</td><td>H4034</td><td></td></tr><tr><td>ADN Limpio & Concentrador</td><td>Zymo Research</td><td>D4004</td><td></td></tr><tr><td>Zymoclean Gel Kit de Recuperación de ADN</td><td>Zymo Research</td><td>D4002</td><td></td></tr><tr><td>Q5 Hot Start High-Fidelity 2X Master Mix New</td><td>England Biolabs</td><td>M0494L</td><td></td></tr><tr><td>Proteinasa K</td><td>Sigma</td><td>P2308</td><td></td></tr><tr><td>Vidrio Borosilicato Micropipetas de vidrio</td><td>Sutter Instruments</td><td>BF100-78-10</td><td>OD: 1.0mm. ID: 0,78 mm</td></tr><tr><td>Clorhidrato de Trizma</td><td>Sigma</td><td>T5941</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Sigma</td><td>M2393</td><td></td></tr><tr><td>NP-40</td><td>Sigma</td><td>74385</td><td></td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP337-100</td><td></td></tr><tr><td>RNaseZap Solución de descontaminación</td><td>Fisher Scientific</td><td>AM9780</td><td></td></tr></tbody></table>

un rápido y fácil tubería para generar genómica punto mutantes de c. elegans utilizando crispr/cas9 ribonucleoproteínas

A Rapid and Facile Pipeline for Generating Genomic Point Mutants in C. elegans Using CRISPR/Cas9 Ribonucleoproteins

Las repeticiones palindrómico intercaladas regularmente agrupadas (CRISPR) - CRISPR - asociaron proteína 9 (Cas9) sistema de defensa inmune adaptante procariotas ha sido cooptado como una poderosa herramienta para la ingeniería del genoma eucariota precisa. Aquí, presentamos un método rápido y sencillo usando RNAs quiméricos guía sola (sgRNA) y CRISPR Cas9 ribonucleoproteínas (RNPs) para la generación eficiente y precisa de genómicas mutaciones de punto en C. elegans. Describimos una tubería sgRNA selección de objetivos, diseño de plantilla de reparación dirigido por homología (HDR), secuestrantes de CRISPR Cas9 de RNP, entrega y una estrategia de genotipificación que permite la identificación rápida y robusta de animales correctamente editados. Nuestro enfoque no sólo permite el fácil generación y la identificación del punto deseado de genomic de animales mutantes, sino que también facilita la detección de otros alelos del complejo indel en aproximadamente 4-5 días con alta eficiencia y una proyección reducida carga de trabajo.

Mutaciones en humanos de la superóxido dismutasa 1 (SOD1) representan ~ 10-20% de la esclerosis de lateral amiotrófica, una enfermedad neurodegenerativa devastadora que invariablemente conduce a la parálisis y la muerte17. Humano SOD-1 es una proteína conservada evolutivamente compartir similitud de identidad y el 70% del 55% con la proteína SOD-1 de C. elegans (figura 1B). Para demostrar la simplicidad, viabilidad y ...

Aquí, presentamos un método para diseñar el genoma de C. elegans utilizando ribonucleoproteínas Cas9 CRISPR y plantillas de reparación dependiente de homología.

Un rápido y fácil tubería para generar genómica punto mutantes de C. elegans utilizando CRISPR/Cas9 ribonucleoproteínas

The clustered regularly interspersed palindromic repeats (CRISPR)-CRISPR-associated protein 9 (Cas9) prokaryotic adaptive immune defense system has been ...

El objetivo general de este procedimiento es generar mutaciones genómicas puntuales en C. Elegans utilizando plantillas de reparación dirigida por homología de oligonucleótidos monocatenarios y ribonucleoproteínas CRISPR/Cas9. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la neurociencia, como la determinación de las consecuencias patológicas de la varianza genética asociada con las enfermedades neurodegenerativas. La principal ventaja de esta técnica es que las mutaciones genómicas puntuales pueden generarse rápidamente, lo que permite el estudio funcional de la varianza genética en el contexto del control regulador endógeno, evitando al mismo tiempo las advertencias de la sobreexpresión de proteínas.Para llevar a cabo la selección de dianas de sgRNA, abra la página web que se muestra aquí. Ingrese aproximadamente 60 pares de bases de secuencia que flanquean la edición deseada de interés. Después de seleccionar el genoma de C.Elegans y el motivo adyacente del protoespaciador de acuerdo con el protocolo de texto, haga clic en enviar.En la página de resultados, elija la secuencia de objetivos mejor clasificada más cercana a la edición de interés. Una vez recibido, centrifugue el tubo que contiene ARNg liofilizado a temperatura ambiente y al menos 12.000 g durante un minuto. Agregue 60 microlitros de TE libre de nucleasa al tubo y use una pipeta p200 para resuspender suavemente pipeteando hacia arriba y hacia abajo de 15 a 20 veces.La concentración final es de 50 micromolares. Diseñar una plantilla HDR ssODN que contenga la mutación de interés, un sitio endonucleasa de restricción de marco único, una mutación silenciosa de uno o ambos de los Gs dentro de la secuencia NGG PAM y 50 pares de bases, cinco brazos de homología primos y tres primos que flanquean la primera y la última mutación. Al recibirlo, centrifugue el tubo que contiene ssODN liofilizado como se acaba de demostrar y luego use DD H20 libre de nucleasa para resuspender suavemente ssODN hasta una concentración final de 100 micromolares.Para preparar una mezcla de inyección, centrifugue los reactivos que se muestran aquí a velocidad máxima y cuatro grados centígrados durante dos minutos. En el orden indicado, agregue los reactivos a un tubo de PCR libre de nucleasa. A continuación, utilice una pipeta p20 para mezclar suave y minuciosamente el contenido.Incuba el tubo a temperatura ambiente durante diez minutos. Después de inyectar animales P0 de acuerdo con el protocolo de texto, permita que se recuperen a temperatura ambiente durante una o dos horas en una placa NGM de 35 milímetros sembrada con OP50. Posteriormente, utilizando un pico de tornillo sin fin de alambre de platino, transfiera los animales P0 de inyección única a placas NGM individuales de 35 milímetros sembradas con OP50.Dos días después de la inyección, utilice un microscopio fluorescente para identificar las placas de P0 que contienen progenie F1, que expresa mCherry en la faringe. Elija tres placas P0 que contengan la mayor cantidad de animales F1 mCherry positivos. De cada una de las tres placas P0 seleccionadas, use un palillo de tornillo sin fin para individualizar de ocho a 12 mCherry positivos F1 para un total de 24 a 36 mCherry F1 positivos.Permita que los F1 individuales se autofertilizen y pongan huevos a temperatura ambiente durante uno o dos días. Después de uno o dos días de puesta de huevos, use un palillo de lombriz para transferir los F1 a tapas de tubo de tiras de PCR individuales que contengan siete microlitros de tampón de lisa de lombrices. Centrifugar los tubos de PCR a máxima velocidad y temperatura ambiente durante un minuto para llevar a los animales al fondo del tubo.A continuación, congele los tubos a 80 grados centígrados bajo cero durante una hora. A continuación, lisar los gusanos congelados en un termociclador utilizando el siguiente programa. A continuación, configure una mezcla maestra de PCR como se muestra en esta tabla.Agregue 21 microlitros de mezcla maestra de PCR en tubos de PCR limpios, luego agregue cuatro microlitros del tubo de lisis de gusano y mezcle bien mediante pipeteo. A continuación, ejecute el programa de PCR siguiendo las directrices del fabricante. Purifique las reacciones de PCR utilizando un kit de limpieza y concentración de ADN siguiendo las instrucciones del fabricante.A continuación, diluye el ADN añadiendo 10 microlitros de agua a la columna de centrifugado. Después de configurar la mezcla maestra de enzimas de restricción, agregue 10 microlitros a cada reacción de PCR limpia e incube los tubos a 37 grados centígrados durante una o dos horas. A continuación, separe los productos de PCR digeridos en un gel de agarosa al 1,5% utilizando 1x tampón TAE a 120 voltios.Examinar las muestras digeridas con enzimas para detectar la presencia de bandas que indiquen posibles animales editados. Después de identificar los posibles animales editados, use los tres microlitros restantes de lisis de lombrices y repita la PCR. A continuación, cargue inmediatamente las reacciones completas en un gel de agarosa al 1% antes de separar y extraer la banda con un kit de extracción de gel.Utilizando el cebador F1, lleve a cabo la secuenciación Sanger para identificar correctamente a los animales editados. Finalmente, para obtener animales homocigotos a partir de animales heterocigotos editados verificados, se unen de ocho a 12 animales F2 y se realiza el genotipado y verificación de secuencias de acuerdo con el protocolo de texto. Para demostrar la simplicidad, viabilidad y eficiencia del enfoque basado en CRISPR/Cas9 RNP, se seleccionó el gen sod-1 de C. Elegans para introducir la variante humana G93a asociada a la enfermedad en el genoma del gusano.Esta imagen en gel muestra los resultados del genotipado de 24 animales F1 mCherry positivos: 10 contenían modificación monoalílica o bialílica, 10 eran de tipo salvaje, tres eran indels potenciales y uno era un fallo de PCR. Para demostrar que el marcador fluorescente mCherry enriquece para la modificación del genoma, se seleccionaron ocho animales mCherry negativos de cada una de las tres placas P0.Solo un animal fue modificado correctamente, mientras que 23 eran de tipo salvaje. Esta figura muestra el cromatograma del producto de PCR extraído en gel de longitud completa, lo que demuestra que los cambios precisos de nucleótidos diseñados en la plantilla ssODN HDR se incorporaron fielmente al genoma de este animal F1 homocigótico. Una vez dominada, esta técnica se puede utilizar para generar e identificar mutaciones genómicas puntuales en C. Elegans en cuatro o cinco días si se realiza correctamente.Al intentar este procedimiento, es importante recordar que debe utilizar reactivos y técnicas libres de núcleo, como agua sin RNasa, puntas de pipeta de filtro y guantes. Siguiendo este procedimiento, se pueden realizar ensayos celulares, moleculares y de comportamiento para investigar los fenotipos que pueden asociarse con la mutación de interés. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo generar con precisión mutaciones genómicas puntuales en C. Elegans utilizando ARNasa de guía única quimérica y proteínas ribonucleares CRISPR/Cas9.

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Investigación

JoVE Journal

Genetics

Genética

Este video describe una técnica para cribar rápidamente un solo nematodo en busca de un marcador genético mediante cribado por PCR. En el protocolo de ejemplo, seleccionamos la edición del genoma basada en CRISPR.

PCR de un solo gusano: un método para extraer y amplificar el ADN genómico

Este video describe la microinyección, un método común para crear cepas transgénicas de C. elegans. En el ejemplo, veremos el uso de la microinyección para introducir un complejo de ribonucleoproteína (RNP) para la edición de genes con bases CRISPR.

Microinyección de gónadas: un método de administración de compuestos directamente en la línea germinal de C. elegans

CRISPR/Cas9 es un sistema robusto para producir disrupción de genes y elementos genéticos. En este trabajo describimos un protocolo para la creación eficiente de deleciones genómicas en líneas celulares de mamíferos utilizando CRISPR/Cas9.

Generación de deleciones genómicas en líneas celulares de mamíferos a través de CRISPR / Cas9

La técnica de determinación del genotipo se describe aquí, que las parejas de reacción en cadena de la polimerasa fluorescente (PCR) para electroforesis capilar en gel, permite para el genotipado de alto rendimiento de clones knockout nucleasa mediada. Se evita limitaciones que enfrentan las otras técnicas de genotipificación y es más rentable que los métodos de secuenciación.

Usando una técnica fluorescente PCR-capilar Electroforesis en gel con el genotipo CRISPR / Cas9 mediada Knockout mutantes en un formato de alto rendimiento

Edición del genoma específica en el sistema modelo Danio rerio (pez cebra) ha sido facilitada enormemente por la aparición de enfoques CRISPR. Adjunto, describimos un protocolo robusto optimizado para la generación y la identificación de alelos derivados CRISPR absurdo que incorpora el análisis de movilidad del heterodúplex y la identificación de mutaciones mediante secuenciación de próxima generación.

Producción eficiente y genera identificación de CRISPR/Cas9 Gene Knockouts en el sistema modelo Danio rerio

Utilizando un Cas9 Confecciones complejo de ribonucleoproteína (RNP) es un método eficaz para la edición del genoma exacto, eficiente. Aquí, podemos destacar su utilidad en una amplia gama de células y organismos, incluyendo las células humanas primarias y ambos clásicos y emergentes en organismos modelo.

Mayor genoma edición con Cas9 ribonucleoproteína en diversas células y organismos

Este protocolo proporciona un método para facilitar la generación de cambios de nucleótidos heterocigotos u homocigotos definidos utilizando CRISPR-CAS9 en células madre pluripotentes humanas.

Generación de modificaciones genómicas definidas utilizando CRISPR-CAS9 en células madre pluripotentes humanas

El objetivo de este protocolo es permitir la edición CRISPR/Cas9 sin fisuras del genoma de C. elegans utilizando complejos de ribonucleoproteína ensamblados y el marcador co-CRISPR dpy-10 para el cribado. Este protocolo se puede utilizar para realizar una variedad de modificaciones genéticas en C. elegans, incluidas inserciones, deleciones, reemplazos de genes y sustituciones de codones.

CRISPR/Cas9 Edición del gen C. elegans rbm-3.2 utilizando el marcador de detección co-CRISPR dpy-10 y complejos de ribonucleoproteína ensamblados.

Aquí, describimos una técnica simple destinada a la generación eficiente de ratones genéticamente modificados llamada CRISPR RNP Electroporación de Cigotos (CRISPR-EZ). Este método proporciona reactivos de edición por electroporación en embriones con una eficiencia cercana al 100%. Este protocolo es efectivo para mutaciones puntuales, pequeñas inserciones genómicas y deleciones en embriones de mamíferos.

Edición eficiente del genoma de ratones mediante electroporación CRISPR de cigotos

Este artículo demuestra la ingeniería genómica mediada por CRISPR-Cas9 en Steinernema hermaphroditum, un nematodo entomopatógeno (EPN: insectoparasito) y un modelo genético emergente. La tecnología descrita es útil para crear mutantes, permitiendo la elucidación de funciones génicas en la biología de los nematodos relevantes para la simbiosis mutualista y parasitaria.

Mutagénesis basada en CRISPR-Cas9 en el nematodo entomopatógeno Steinernema hermaphroditum y el mantenimiento de líneas mutantes

Un flujo de trabajo de microinyección CRISPR/Cas9 para el marcaje fluorescente endógeno en la línea germinal de Caenorhabditis elegans para obtener líneas homocigotas de knock-in para análisis in vivo de localización de proteínas.

Marcado fluorescente endógeno mediado por CRISPR/Cas9 de genes específicos de la línea germinal en Caenorhabditis elegans

Aprende a generar mutaciones puntuales genómicas en C. elegans utilizando ribonucleoproteínas CRISPR/Cas9 y plantillas de reparación dirigida por homología. Este método permite estudios funcionales de variantes genéticas en neurociencia.

Un rápido y fácil tubería para generar genómica punto mutantes de C. elegans utilizando CRISPR/Cas9 ribonucleoproteínas

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