Un rápido y fácil tubería para generar genómica punto mutantes de C. elegans utilizando CRISPR/Cas9 ribonucleoproteínas

El objetivo general de este procedimiento es generar mutaciones genómicas puntuales en C. Elegans utilizando plantillas de reparación dirigida por homología de oligonucleótidos monocatenarios y ribonucleoproteínas CRISPR/Cas9. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la neurociencia, como la determinación de las consecuencias patológicas de la varianza genética asociada con las enfermedades neurodegenerativas. La principal ventaja de esta técnica es que las mutaciones genómicas puntuales pueden generarse rápidamente, lo que permite el estudio funcional de la varianza genética en el contexto del control regulador endógeno, evitando al mismo tiempo las advertencias de la sobreexpresión de proteínas.

Para llevar a cabo la selección de dianas de sgRNA, abra la página web que se muestra aquí. Ingrese aproximadamente 60 pares de bases de secuencia que flanquean la edición deseada de interés. Después de seleccionar el genoma de C.Elegans y el motivo adyacente del protoespaciador de acuerdo con el protocolo de texto, haga clic en enviar.

En la página de resultados, elija la secuencia de objetivos mejor clasificada más cercana a la edición de interés. Una vez recibido, centrifugue el tubo que contiene ARNg liofilizado a temperatura ambiente y al menos 12.000 g durante un minuto. Agregue 60 microlitros de TE libre de nucleasa al tubo y use una pipeta p200 para resuspender suavemente pipeteando hacia arriba y hacia abajo de 15 a 20 veces.

La concentración final es de 50 micromolares. Diseñar una plantilla HDR ssODN que contenga la mutación de interés, un sitio endonucleasa de restricción de marco único, una mutación silenciosa de uno o ambos de los Gs dentro de la secuencia NGG PAM y 50 pares de bases, cinco brazos de homología primos y tres primos que flanquean la primera y la última mutación. Al recibirlo, centrifugue el tubo que contiene ssODN liofilizado como se acaba de demostrar y luego use DD H20 libre de nucleasa para resuspender suavemente ssODN hasta una concentración final de 100 micromolares.

Para preparar una mezcla de inyección, centrifugue los reactivos que se muestran aquí a velocidad máxima y cuatro grados centígrados durante dos minutos. En el orden indicado, agregue los reactivos a un tubo de PCR libre de nucleasa. A continuación, utilice una pipeta p20 para mezclar suave y minuciosamente el contenido.

Incuba el tubo a temperatura ambiente durante diez minutos. Después de inyectar animales P0 de acuerdo con el protocolo de texto, permita que se recuperen a temperatura ambiente durante una o dos horas en una placa NGM de 35 milímetros sembrada con OP50. Posteriormente, utilizando un pico de tornillo sin fin de alambre de platino, transfiera los animales P0 de inyección única a placas NGM individuales de 35 milímetros sembradas con OP50.

Dos días después de la inyección, utilice un microscopio fluorescente para identificar las placas de P0 que contienen progenie F1, que expresa mCherry en la faringe. Elija tres placas P0 que contengan la mayor cantidad de animales F1 mCherry positivos. De cada una de las tres placas P0 seleccionadas, use un palillo de tornillo sin fin para individualizar de ocho a 12 mCherry positivos F1 para un total de 24 a 36 mCherry F1 positivos.

Permita que los F1 individuales se autofertilizen y pongan huevos a temperatura ambiente durante uno o dos días. Después de uno o dos días de puesta de huevos, use un palillo de lombriz para transferir los F1 a tapas de tubo de tiras de PCR individuales que contengan siete microlitros de tampón de lisa de lombrices. Centrifugar los tubos de PCR a máxima velocidad y temperatura ambiente durante un minuto para llevar a los animales al fondo del tubo.

A continuación, congele los tubos a 80 grados centígrados bajo cero durante una hora. A continuación, lisar los gusanos congelados en un termociclador utilizando el siguiente programa. A continuación, configure una mezcla maestra de PCR como se muestra en esta tabla.

Agregue 21 microlitros de mezcla maestra de PCR en tubos de PCR limpios, luego agregue cuatro microlitros del tubo de lisis de gusano y mezcle bien mediante pipeteo. A continuación, ejecute el programa de PCR siguiendo las directrices del fabricante. Purifique las reacciones de PCR utilizando un kit de limpieza y concentración de ADN siguiendo las instrucciones del fabricante.

A continuación, diluye el ADN añadiendo 10 microlitros de agua a la columna de centrifugado. Después de configurar la mezcla maestra de enzimas de restricción, agregue 10 microlitros a cada reacción de PCR limpia e incube los tubos a 37 grados centígrados durante una o dos horas. A continuación, separe los productos de PCR digeridos en un gel de agarosa al 1,5% utilizando 1x tampón TAE a 120 voltios.

Examinar las muestras digeridas con enzimas para detectar la presencia de bandas que indiquen posibles animales editados. Después de identificar los posibles animales editados, use los tres microlitros restantes de lisis de lombrices y repita la PCR. A continuación, cargue inmediatamente las reacciones completas en un gel de agarosa al 1% antes de separar y extraer la banda con un kit de extracción de gel.

Utilizando el cebador F1, lleve a cabo la secuenciación Sanger para identificar correctamente a los animales editados. Finalmente, para obtener animales homocigotos a partir de animales heterocigotos editados verificados, se unen de ocho a 12 animales F2 y se realiza el genotipado y verificación de secuencias de acuerdo con el protocolo de texto. Para demostrar la simplicidad, viabilidad y eficiencia del enfoque basado en CRISPR/Cas9 RNP, se seleccionó el gen sod-1 de C. Elegans para introducir la variante humana G93a asociada a la enfermedad en el genoma del gusano.

Esta imagen en gel muestra los resultados del genotipado de 24 animales F1 mCherry positivos: 10 contenían modificación monoalílica o bialílica, 10 eran de tipo salvaje, tres eran indels potenciales y uno era un fallo de PCR. Para demostrar que el marcador fluorescente mCherry enriquece para la modificación del genoma, se seleccionaron ocho animales mCherry negativos de cada una de las tres placas P0.

Solo un animal fue modificado correctamente, mientras que 23 eran de tipo salvaje. Esta figura muestra el cromatograma del producto de PCR extraído en gel de longitud completa, lo que demuestra que los cambios precisos de nucleótidos diseñados en la plantilla ssODN HDR se incorporaron fielmente al genoma de este animal F1 homocigótico. Una vez dominada, esta técnica se puede utilizar para generar e identificar mutaciones genómicas puntuales en C. Elegans en cuatro o cinco días si se realiza correctamente.

Al intentar este procedimiento, es importante recordar que debe utilizar reactivos y técnicas libres de núcleo, como agua sin RNasa, puntas de pipeta de filtro y guantes. Siguiendo este procedimiento, se pueden realizar ensayos celulares, moleculares y de comportamiento para investigar los fenotipos que pueden asociarse con la mutación de interés. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo generar con precisión mutaciones genómicas puntuales en C. Elegans utilizando ARNasa de guía única quimérica y proteínas ribonucleares CRISPR/Cas9.