Name: Toeprinting análisis de formación de complejos de iniciación traducción de mRNAs mamíferos (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-05-10T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 37 s
Description: Aprende el análisis de toeprinting para estudiar la formación de complejos de iniciación de traducción en mRNAs mamíferos. Este método permite investigar mecanismos de traducción dependientes de cap e IRES en biología molecular.

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Este trabajo fue financiado por una Ciencias naturales e Ingeniería investigación Consejo de Canadá-Discovery Grant (RGPIN-2017-05463), la Fundación de Canadá para la innovación-John R. Evans líderes fondo (35017), el programa de Innova Campus Alberta y Alberta Ministerio de Desarrollo económico y comercio.

Nota: El ARN es altamente susceptible a la degradación por ribonucleasas (RNasas). Tomar las precauciones normales para mantener intacto el ARN. Cambiar guantes con frecuencia. Usar filtrado pipetas, recipientes de plástico libre de nucleasas y productos químicos libre de nucleasas en todas las etapas del protocolo. Uso libre de nucleasas o dietil pirocarbonato (DEPC)-tratamiento de agua para todas las soluciones.
1. preparación de soluciones
<ol><li>Preparación de buffer de Toeprinting: 20 mM Tris-HCl (pH 7.6), 100 mM KOAc, 2,5 mM Mg(OAc)2, 5% (p/v) de sacarosa, espermidina de Ditiotreitol (DTT) y 0,5 mM de 2 mM.<ol>
<li>Tienda TDT y espermidina en alícuotas de un solo uso a-20 ° C para evitar ciclos de congelación y descongelación repetida. Nota: TDT y espermidina deben agregarse al búfer de toeprinting inmediatamente antes del uso. Una solución que carecen de TDT y espermidina puede almacenarse a-20 ° C.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Preparar alícuotas de 85 mM guanylyl 5' imidodiphosphate (GMP-PNP) y 91 mM adenosín trifosfato (ATP). Almacenar las alícuotas a-20 ° C.</li>
	<li>Preparar 450 mL de mezcla de gel de urea de poliacrilamida - 7M de 6%: 67,5 mL de 40% acrylamide:bis-acrilamida (19:1), 189 g de urea, 112,5 de 5 x TBE (Tris/borato/thylenediaminetetraacetic ácido (EDTA)) y 120 mL de agua. Disolver la urea por calentamiento en un baño de agua de 37 ° C o en un plato caliente con agitación. Filtrar la solución (por ej., 0,2 μm filtro de vacío de nitrocelulosa). Nota: La solución puede almacenarse a 4 ° C durante al menos un mes. PRECAUCIÓN: Monómero acrilamida es una neurotoxina que puede ser absorbida por la piel. Tener mucho cuidado para evitar contacto con la piel (es decir., guantes, una bata de laboratorio y protección de los ojos). Poliacrilamida también debe manejarse con cuidado, como polimerización no puede proceder a la terminación de 100%.</li>
	<li>Preparar formamida colorante de carga: 95% formamida, 18 mM EDTA, 0.025% (w/v) sodio dodecil sulfato (SDS), azul de bromofenol 0.025% (w/v), 0.025% (w/v) xileno cyanol. Almacenar a-20 ° C.</li>
	<li>1 nmol de primer (5' CTCGATATGTGCATCTGTA; 5' extremo marcado con IRDye 800) se disuelven en 100 μL de agua para una trabajo de concentración de 10 pmol/μL. Almacenar a-20 ° C en alícuotas de un solo uso (aproximadamente 10 μl), protegidos de la luz.</li>
</ol>2. preparación de ARNm
<ol><li>Ampliar las plantillas de la DNA para la síntesis de mRNA por reacción en cadena de polimerasa (PCR) de las plantillas adecuadas (es decir., ADN genómico o DNA del plasmid, según sea el caso). Uso de una polimerasa de la DNA según las instrucciones del fabricante, de alta fidelidad con las siguientes condiciones de reacción (35 ciclos): derretir, 98 ° C, 10 s; Recueza, 53 ° C, 20 s; extender, 72 ° C, 30 s. Nota: El primer forward (5' AAGCTTAATACGACTCACTATAG) incorpora la secuencia de promotor de T7 para permitir la transcripción de RNA; el primer revés (5' T51GAATTCGGATCCGACCGTGG) incluye 51 residuos de timina para prever una cola poly-A del ARN transcrito. Tenga en cuenta que también puede ser RNA en vitro transcritos del ADN plásmido.</li>
	<li>Uso un kit apropiado de transcripción in vitro transcribir ARN que contiene IRES o ARN capsulado de la plantilla de la DNA. Siga las instrucciones del fabricante. Preparar la muestra de RNA en volúmenes de reacción μL 20 estándar. Tratar el ARN recién sintetizado con 2 unidades de libre de Rnasa DNasa durante 30 min a 37 ° C.</li>
	<li>Diluir el ARN tratados con DNasa a 110 μl con agua libre de nucleasa añadir 110 μl ácido fenol, agitarlos durante 5 s y centrifugar durante 3 minutos a 20.000 x g a temperatura ambiente. Quitar 100 μl de la fase acuosa a un tubo nuevo de microcentrífuga de 1,5 mL, añadir 10 μl de acetato de sodio de 3 M y s. vortex 2 Agregar 3 volúmenes de etanol al 100%, agitarlos durante 5 s y precipitar el ARN a-20 ° C durante la noche.</li>
	<li>Centrifugue a > 20.000 x g durante 30 min a 4 ° C y descarte el sobrenadante. Lavar el pellet con 500 μl de etanol al 70% (v/v) helado y repita la centrifugación. Aspirar tanto el sobrenadante como sea posible y secar el pellet para 5-10 minutos tenga cuidado de no desalojar la pelotilla.</li>
	<li>Resuspender el RNA en el volumen adecuado de agua libre de nucleasa para producir una concentración de trabajo de 0,5 μg/μL. Esto puede ser almacenado a-80 ° C o utilizar inmediatamente.</li>
</ol>3. Toeprinting reacción
<ol><li>Mix 15 μL de conejo reticulocitos lisado (RRL, no tratados con nucleasa), (40 unidades) de 1 μL de inhibidor de la Rnasa, 1 μl de 91 mM ATP (1,82 mM final) y 1 μL de 85 mM GMP-PNP (1,7 mM final) en un tubo de microcentrífuga de 1,5 mL. Incubar a 30 ° C durante 5 minutos. Nota: La RRL debe alícuotas de un solo uso evitar repetidor hielo-deshielo. Control crítico es una reacción falta RRL, para aclarar las pausas naturales de transcripción inversa debido a la estructura secundaria del ARN. Añadir el tampón de toeprinting para reemplazar RRL para este control.</li>
	<li>Añadir 0,5 μg (1 μl) de ARN e incubar a 30 ° C durante 5 minutos.</li>
	<li>Agregar 22 μL de tampón de Toeprinting e incubar a 30 ° C por 3 minutos.</li>
	<li>Añadir 0,5 μl (5 pmol) de primer etiquetado IRDye e incubar en hielo durante 10 minutos.</li>
	<li>Añadir 2 μl de 25 mM de dNTPs (concentración final: 1 mM), 2 μl de 100 mM de Mg(OAc)2, 1 μl de aviar Myeloblastosis Virus de la transcriptasa reversa (RT-AMV) y 3,5 μl de tampón de Toeprinting. El volumen final es de 50 μL.</li>
	<li>Incubar la reacción a 30 ° C por 45 min.</li>
	<li>Añadir 200 μL de agua libre de nucleasas y extraer inmediatamente con 250 μl de fenol: cloroformo: isoamílico de 25:24:1 alcohol (pH aproximadamente 8.0). Agitarlos durante 5 s y centrifugue a 20.000 x g durante 3 min a temperatura ambiente. Retirar la fase acuosa a un tubo nuevo de microcentrífuga de 1,5 mL, agregar 3 volúmenes de etanol al 100%, agitarlos durante 5 s y precipitar a-20 ° C durante la noche.</li>
	<li>Centrifugue a > 20.000 x g durante 30 min a 4 ° C y descarte el sobrenadante. Lavar el pellet de ADN con 500 μl de etanol al 70% (v/v) helada. Centrifugue a > 20.000 x g durante 15 min a 4 ° C. Aspiración flotante tanto como sea posible y seque el precipitado durante 5-10 minutos tenga cuidado de no desalojar la pelotilla.</li>
	<li>Disolver el precipitado en 6 μL de agua libre de nucleasas y agregar 3 μL de formamida carga del tinte.</li>
</ol>4. secuencia de reacciones
<ol><li>Utilice la plantilla de la DNA de 2.1 y la cartilla IRDye-etiquetados en el paso 3.4 para las reacciones de secuenciación estándar, utiliza dideoxynucleotides (ddNTPs) como terminadores de cadena. Utilice un kit de secuenciación de ADN adecuado y siga las instrucciones del fabricante.</li>
	<li>Mezcla 6 μL de cada reacción de secuenciación con 3 μL de formamida carga del tinte.</li>
</ol>5. preparación de la secuenciación Gel y electroforesis
Nota: Este protocolo usa un sensor de fluorescencia basada en gel y una 21 cm x 23 cm x 0,2 gel de mm, pero puede ser adaptado para otros secuenciadores o tamaños de gel, si es necesario.
<ol><li>Limpie bien los espaciadores de 0,2 mm, así como el corto (23 x 25 cm) y placas de vidrio de largo (30 × 25 cm) con 100% de etanol. Secar al aire.</li>
	<li>Mezclar 30 mL de gel de urea de 6% poliacrilamida - 7M se mezclan con 200 μL de persulfato de amonio 10% (p/v) (APS) y 20 μL de tetramethylethylenediamine (TEMED). Verter el gel, teniendo cuidado para evitar burbujas e inserte el peine de 'dientes de tiburón' gel. Permita que el gel polimerice durante 1 h a temperatura ambiente.</li>
	<li>Montar el aparato de la secuencia y llenar los depósitos con 1 x TBE.</li>
	<li>Funcionamiento previo durante 15 min a 1500 V hasta alcanzar la temperatura óptima de 55 ° C.</li>
	<li>Calentar la mezcla de tinte de la muestra/carga (de medidas 3.9 o 4.2) a 85 ° C por 5 min carga 1 μL en el gel de secuenciación.</li>
	<li>Correr el gel a 1500 V de 8 h. La máquina Lee las bandas en tiempo real.</li>
	<li>Desmontar el aparato y elimine el gel de acrilamida y buffer de corriente.</li>
</ol>

<ol><li>Holcik, M., Sonenberg, N. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/15803138">Translational control in stress and apoptosis.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 6 (4), 318-327 (2005).</li>
<li>Lacerda, R., Menezes, J., Romao, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((More+than+just+scanning%3A+the+importance+of+cap-independent+mRNA+translation+initiation+for+cellular+stress+response+and+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Mol+Life+Sci%22%5BJournal%5D)">More than just scanning: the importance of cap-independent mRNA translation initiation for cellular stress response and cancer.</a> Cell Mol Life Sci. 74 (9), 1659-1680 (2017).</li>
<li>Sharma, D. K., Bressler, K., Patel, H., Balasingam, N., Thakor, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+Eukaryotic+Initiation+Factors+during+Cellular+Stress+and+Cancer+Progression%5BTitle%5D)+AND+%22J+Nucleic+Acids%22%5BJournal%5D)">Role of Eukaryotic Initiation Factors during Cellular Stress and Cancer Progression.</a> J Nucleic Acids. 2016, 8235121(2016).</li>
<li>Gebauer, F., Hentze, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+mechanisms+of+translational+control%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Molecular mechanisms of translational control.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 5 (10), 827-835 (2004).</li>
<li>Anthony, D. D., Merrick, W. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+40+S+and+80+S+complexes+with+mRNA+as+measured+by+sucrose+density+gradients+and+primer+extension+inhibition%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Analysis of 40 S and 80 S complexes with mRNA as measured by sucrose density gradients and primer extension inhibition.</a> J Biol Chem. 267 (3), 1554-1562 (1992).</li>
<li>Hartz, D., McPheeters, D. S., Traut, R., Gold, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extension+inhibition+analysis+of+translation+initiation+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Extension inhibition analysis of translation initiation complexes.</a> Methods Enzymol. 164, 419-425 (1988).</li>
<li>Shirokikh, N. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+analysis+of+ribosome-mRNA+complexes+at+different+translation+stages%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Quantitative analysis of ribosome-mRNA complexes at different translation stages.</a> Nucleic Acids Res. 38 (3), 15(2010).</li>
<li>Thakor, N., Holcik, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IRES-mediated+translation+of+cellular+messenger+RNA+operates+in+eIF2alpha-+independent+manner+during+stress%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">IRES-mediated translation of cellular messenger RNA operates in eIF2alpha- independent manner during stress.</a> Nucleic Acids Res. 40 (2), 541-552 (2012).</li>
<li>Liwak, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor+suppressor+PDCD4+represses+internal+ribosome+entry+site-mediated+translation+of+antiapoptotic+proteins+and+is+regulated+by+S6+kinase+2%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Tumor suppressor PDCD4 represses internal ribosome entry site-mediated translation of antiapoptotic proteins and is regulated by S6 kinase 2.</a> Mol Cell Biol. 32 (10), 1818-1829 (2012).</li>
<li>Thakor, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+mRNA+recruits+the+ribosome+via+eIF3-PABP+bridge+to+initiate+internal+translation%5BTitle%5D)+AND+%22RNA+Biol%22%5BJournal%5D)">Cellular mRNA recruits the ribosome via eIF3-PABP bridge to initiate internal translation.</a> RNA Biol. , 1-15 (2016).</li>
<li>Thoma, C., Bergamini, G., Galy, B., Hundsdoerfer, P., Hentze, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhancement+of+IRES-mediated+translation+of+the+c-myc+and+BiP+mRNAs+by+the+poly%28A%29+tail+is+independent+of+intact+eIF4G+and+PABP%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">Enhancement of IRES-mediated translation of the c-myc and BiP mRNAs by the poly(A) tail is independent of intact eIF4G and PABP.</a> Mol Cell. 15 (6), 925-935 (2004).</li>
<li>Baird, S. D., Lewis, S. M., Turcotte, M., Holcik, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+search+for+structurally+similar+cellular+internal+ribosome+entry+sites%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">A search for structurally similar cellular internal ribosome entry sites.</a> Nucleic Acids Res. 35 (14), 4664-4677 (2007).</li>
<li>Merrick, W. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evidence+that+a+single+GTP+is+used+in+the+formation+of+80+S+initiation+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Evidence that a single GTP is used in the formation of 80 S initiation complexes.</a> J Biol Chem. 254 (10), 3708-3711 (1979).</li>
<li>Arnaud, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+New+34-Kilodalton+Isoform+of+Human+Fibroblast+Growth+Factor+2+Is+Cap+Dependently+Synthesized+by+Using+a+Non-AUG+Start+Codon+and+Behaves+as+a+Survival+Factor%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">A New 34-Kilodalton Isoform of Human Fibroblast Growth Factor 2 Is Cap Dependently Synthesized by Using a Non-AUG Start Codon and Behaves as a Survival Factor.</a> Mol Cell Biol. 19 (1), 505-514 (1999).</li>
<li>Dmitriev, S. E., Pisarev, A. V., Rubtsova, M. P., Dunaevsky, Y. E., Shatsky, I. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conversion+of+48S+translation+preinitiation+complexes+into+80S+initiation+complexes+as+revealed+by+toeprinting%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Lett%22%5BJournal%5D)">Conversion of 48S translation preinitiation complexes into 80S initiation complexes as revealed by toeprinting.</a> FEBS Lett. 533 (1-3), 99-104 (2003).</li>
<li>Faye, M. D., Graber, T. E., Holcik, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessment+of+selective+mRNA+translation+in+mammalian+cells+by+polysome+profiling%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Assessment of selective mRNA translation in mammalian cells by polysome profiling.</a> J Vis Exp. (92), e52295(2014).</li>
<li>Duncan, C. D. S., Mata, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+cycloheximide+on+the+interpretation+of+ribosome+profiling+experiments+in+Schizosaccharomyces+pombe%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Effects of cycloheximide on the interpretation of ribosome profiling experiments in Schizosaccharomyces pombe.</a> Sci Rep. 7 (1), 10331(2017).</li>
<li>Beck, H. J., Janssen, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+Translation+Initiation+Regulation+Mechanism+in+Escherichia+coli+ptrB+Mediated+by+a+5%27-Terminal+AUG%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Novel Translation Initiation Regulation Mechanism in Escherichia coli ptrB Mediated by a 5'-Terminal AUG.</a> J Bacteriol. 199 (14), (2017).</li>
</ol>

Los autores no tienen ningún conflicto de interés divulgar.

Toeprinting es una técnica poderosa para medir directamente la capacidad de un RNA de interés para apoyar la formación de complejos de iniciación de traducción bajo circunstancias muy controladas. Este protocolo describe una técnica simplificada para toeprinting RNAs mamíferos. Lisado de reticulocitos de conejo (RRL) se utilizaban como una fuente conveniente de los ribosomas, eIFs, iniciador ARNt y IRES trans-actuando factores (ITAFs). El experimentador proporciona su RNA de elección y también puede complementar...

Como traducción consume energía celular más, es lógico que la traducción es bien regulada1. Por el contrario, la desregulación de la traducción- y las consiguientes alteraciones en la producción de proteína-se observa a menudo en Estados de la respuesta de estrés y enfermedad, como cáncer1,2. Una ventaja importante de control traduccional es la velocidad con que las células pueden alterar su producción de proteína para responder a diferentes estímulos3. Regulación de la traducción representa así un mecanismo importante que puede influir en la supervivencia celular y la muerte1,2,3. De los pasos de la traducción, la iniciación es la más altamente regulado y complejo3. Brevemente, más eukaryotic mRNAs contiene una 5' m7G tapa que casi siempre es esencial para su traducción. Dependiente de la tapa de iniciación requiere eIF4A y eucariótico de iniciación factores eIF4E y eIF4G (el complejo cap-reconocimiento) para interactuar con el extremo 5' del mRNA. 43S preinitiation ribosome complejo, que contiene eIF2-limite iniciador ARNt y eIF3, es reclutado para el extremo 5' de los ARNm a través de una interacción de eIF4G con eIF3. El complejo de preiniciación está pensado para escanear mRNA, ayudados por eIF4A (una RNA helicasa) hasta que encuentra el codón de inicio (AUG). Posteriormente se forma el complejo de iniciación 48S y tRNA se entrega en el sitio P del ribosoma. Finalmente, las subunidades 60S y 40S del ribosoma se unen para formar el inicio de los años 80 complejo, seguido por la traducción elongación1,3,4. En cambio, sitios de entrada interna del ribosoma (IRESes) eludir el requisito para un casquillo de 5' mediante la contratación de la subunidad ribosómica 40S directamente a la del codón de iniciación3. Condiciones de estrés fisiológico atenúan mundial traducción del mRNA debido a las modificaciones de los factores clave general eucariótico de iniciación (eIFs). Sin embargo, mecanismos de iniciación de traducción no-canónico permiten traducción selectiva de ciertos mRNAs que codifican a menudo proteínas de respuesta al estrés, y la desregulación de la iniciación de la traducción no-canónico está implicada en Estados de enfermedades como el cáncer 1 , 2. elementos reguladores RNA discreto, como IRESes celular, permiten la traducción de estos mRNAs2,3.
Un aspecto particularmente interesante de control traduccional es entender los mecanismos de la canónica versus no-canónico traducción de un ARNm determinado. Toeprinting es una técnica que permite el estudio detallado de mecanicista de la iniciación de la traducción de ARN específica in vitro. El objetivo de toeprinting es evaluar la capacidad de un RNA de interés nuclear la formación de una iniciación de la traducción con el ribosoma en una variedad de condiciones, para determinar que secuencias de elementos estructurales y accesorios factores son necesarios para la iniciación de la traducción eficaz. Por ejemplo, contratación de ribosoma puede obstaculizado en la ausencia de una 5' cap pero estimulado por la presencia de un IRES.
El principio de la técnica es en vitro transcribe un RNA de interés, incubar en presencia de extractos celulares que contienen componentes de traducción (o los componentes purificados) permitan transcriben de complejos de iniciación para formar y para invertir el ARN con una imprimación específica. Complejos estables de RNA ribosoma hará transcripción reversa a estancar en el 3' borde del ribosoma, el supuesto 'toeprint'5,6,7.
En este protocolo, subunidades ribosomales, eIFs, tRNAs y IRES trans-acción (ITAFs) están convenientemente contribuyeron por lisado de reticulocitos de conejo (RRL). Otra ventaja de este protocolo es el uso de una cartilla marcada con fluorescencia y reproductor de imágenes de fluorescencia basada en gel, en lugar de una cartilla radiactiva. Esto elimina pasos adicionales, incluyendo radiolabeling la cartilla, así como el gel de secado y exponerlo a una pantalla de intensificación. Las bandas fluorescentes se registran en tiempo real, como el gel, lo que permite una mayor resolución. Esté sin X-ligado inhibidor de apoptosis (XIAP) la proteína IRES ARN se usa como un ejemplo aquí, aunque tapado mRNAs también puede ser analizada por esta técnica8.
A diferencia de los análisis de western, que mide el resultado final del proceso de traducción en los lysates de la célula, toeprinting es un enfoque en vitro para medir la formación de complejos de iniciación traducción en un RNA. Este enfoque reduccionista permite el estudio muy detallado de sustratos o factores que regulan la iniciación de la traducción (ej., con o sin tapón mRNA, IRES estructura, presencia o ausencia de cola poly-A, disposición de los factores de la proteína específica, etcetera). Por lo tanto, toeprinting puede utilizarse para estudiar los diferentes modos de traducción8 o los efectos de estructuras de mRNA como IRESes, en síntesis de proteínas9,10.

<table><tbody><tr><td>DEPC (Pirocarbonato de dietilo)</td><td>Sigma</td><td>D5758-100ML</td><td></td></tr><tr><td>TRIS base, Ultrapuro</td><td>JT Baker</td><td>4109-01</td><td></td></tr><tr><td>KOAc (Acetato de potasio)</td><td>Bio Basic</td><td>PB0438</td><td></td></tr><tr><td>Mg(OAc)2 (Acetato de magnesio tetrahidratado)</td><td>Bio Basic</td><td>MB0326</td><td></td></tr><tr><td>Sacarosa, grado de biología molecular</td><td>Calbiochem</td><td>573113-1KG</td><td></td></tr><tr><td>Espermidina</td><td>Sigma</td><td>85558</td><td></td></tr><tr><td>GMP-PNP (Guanosina 5&prime;-[&beta;,&gamma;-imido]trifosfato sal trisódica hidratado) 0,1 M solución</td><td>Sigma</td><td>G0635</td><td></td></tr><tr><td>ATP (Adenosina 5&prime;-trifosfato) sal disódica, solución 100 mM</td><td>Sigma</td><td>A6559</td><td></td></tr><tr><td>19:1 Acrilamida:bis-acrilamida, 40%</td><td>Bio Basic</td><td>A0006</td><td></td></tr><tr><td>Urea</td><td>Bio Basic</td><td>UB0148</td><td></td></tr><tr><td>Unidades de filtración de tapa de botella de 500 ml, 0,2 y micro; m</td><td>Sarstedt</td><td>83.1823.101</td><td></td></tr><tr><td>Formamida</td><td>Sigma</td><td>F9037-100ML</td><td></td></tr><tr><td>EDTA (sal disódica, dihidratada)</td><td>Bio Basic</td><td>EB0185</td><td></td></tr><tr><td>SDS</td><td>Bio Basic</td><td>SB0485</td><td></td></tr><tr><td>Azul de bromofenol</td><td>Bio Basic</td><td>BDB0001</td><td></td></tr><tr><td>Xileno cianol FF</td><td>Bio Basic</td><td>XB0005</td><td></td></tr><tr><td>MEGAshortscript T7 kit de transcripción</td><td>Ambion</td><td>AM1354</td><td></td></tr><tr><td>mMESSAGE mMACHINE T7 kit de transcripción</td><td>Ambion</td><td>AM1344</td><td></td></tr><tr><td>Ácido Fenol:Cloroformo (5:1)</td><td>Ambion</td><td>AM9722</td><td></td></tr><tr><td>25:24:1 Fenol:Cloroformo:Alcohol isoamílico</td><td>Invitrogen</td><td>15593-049</td><td></td></tr><tr><td>Lisado de reticulocitos de conejo (RRL). NO debe tratarse con nucleasas.</td><td>Green Hectares, USA</td><td></td><td>Contacto Green Hectares, solicite 1:1 RRL:water</td></tr><tr><td>RiboLock RNasa Inhibidor (40 U/&micro; L)</td><td>Thermo Fisher</td><td>E00382</td><td></td></tr><tr><td>100 mM dNTPs</td><td>Invitrogen</td><td>56172, 56173, 56174, 56175</td><td>Mezcle partes iguales para obtener un stock de 25 mM cada una.</td></tr><tr><td>AMV-RT, 10 U/&micro; L</td><td>Promega</td><td>M5101</td><td></td></tr><tr><td>Sequenase Versión 2.0 Kit de secuenciación de ADN</td><td>Thermo Fisher</td><td>707701KT</td><td></td></tr><tr><td>Modelo 4200 IR2 Analizador de ADN</td><td>LI-COR</td><td></td><td>El producto ha sido descontinuado</td></tr><tr><td>APS (Persulfato de amonio)</td><td>Bio Basic</td><td>AB0072</td><td></td></tr><tr><td>TEMED</td><td>Bio Basic</td><td>TB0508</td><td></td></tr><tr><td>Phusion Polimerasa de alta fidelidad</td><td>Nuevo Inglaterra Biolabs</td><td>M0530</td><td></td></tr><tr><td>Turbo Dnase</td><td>Thermo Fisher</td><td>AM2238</td><td></td></tr></tbody></table>

toeprinting análisis de formación de complejos de iniciación traducción de mrnas mamíferos

Toeprinting Analysis of Translation Initiation Complex Formation on Mammalian mRNAs

Iniciación de la traducción es el paso tarifa-limitador de la síntesis de proteínas y representa un punto clave en el cual las células regulan su producción de proteínas. Regulación de la síntesis de proteínas es la clave para la respuesta de estrés celular, y la desregulación es central a muchos Estados de enfermedad, como el cáncer. Por ejemplo, aunque estrés celular conduce a la inhibición de la traducción global de atenuación dependiente de la tapa de iniciación, ciertas proteínas de respuesta al estrés se convierten selectivamente en forma independiente de la tapa. Elementos reguladores discretos de RNA, como sitios de entrada interna del ribosoma celular (IRESes), permiten la traducción de los mRNAs específicos. Identificación de estos mRNAs y la caracterización de sus mecanismos, han sido una zona clave en biología molecular. Toeprinting es un método para el estudio de RNA estructura y función lo que respecta a la iniciación de la traducción. El objetivo de toeprinting es evaluar la capacidad de in vitro transcrito RNA para formar complejos estables con los ribosomas en una variedad de condiciones, para determinar que secuencias, elementos estructurales o factores accesorios participan en ribosoma vinculante, un pre-cursor de iniciación de traducción eficiente. Junto con otras técnicas, como análisis occidental y polysome perfilado, toeprinting permite una sólida caracterización de mecanismos para la regulación de la iniciación de la traducción.

Anteriormente hemos descrito la capacidad de los IRES XIAP para apoyar la iniciación de la traducción de la casquillo-independiente en vitro8,10. Toeprinting fue la técnica clave para interrogar los detalles mecanicistas de la iniciación de XIAP IRES complejo. Una construcción de ADN codifican un ARNm que contiene el IRES XIAP (figura 1A) fue en vitro transcritas y s...

Toeprinting tiene como objetivo medir la capacidad de in vitro transcrito RNA para formar complejos de iniciación de traducción con los ribosomas en una variedad de condiciones. Este protocolo describe un método para RNA mamíferos toeprinting y puede utilizarse para estudiar traducción dependiente de la tapa y IRES-conducido.

Toeprinting análisis de formación de complejos de iniciación traducción de mRNAs mamíferos

Translation initiation is the rate-limiting step of protein synthesis and represents a key point at which cells regulate their protein output. Regulation ...

El objetivo general de este análisis es observar la formación del complejo de iniciación de la traducción en los ARNm de mamíferos. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la traducción del ARNm, como el inicio de la traducción mediada por IRES. La principal ventaja de esta técnica es que se puede realizar un análisis detallado de la formación del complejo de iniciación de la traducción en un ARNm específico.Ensamble las reacciones de transcripción para transcribir el ARN de las plantillas de ADN amplificadas por PCR, codificando el ARN de XIAP IRES o sus mutantes. A continuación, agregue dos unidades de DNasa libre de ARN para eliminar la plantilla de ADN a cada reacción de ARN de 20 microlitros. Incubar a 37 grados centígrados durante 30 minutos.A continuación, diluir el ARN tratado con DNasa con agua libre de nucleasas hasta un volumen final de 110 microlitros. A continuación, agregue 110 microlitros de fenol ácido para comenzar la purificación del ARN. Agite las muestras durante cinco segundos y centrifuga a 20.000 x g durante tres minutos a temperatura ambiente.Es fundamental diluir el ARN o el CDNA antes de la extracción con fenol. Si el volumen es demasiado bajo, va a ser difícil recuperar físicamente la fase acuosa y el rendimiento final será bajo. Luego, transfiera cuidadosamente 100 microlitros de la fase acuosa que contiene ARN a un nuevo tubo de microcentrífuga.Añadir 10 microlitros de acetato de sodio 3 M, pH 5,5, y mezclar las muestras. A continuación, añada tres volúmenes de etanol al 100% para precipitar el ARN y vórtice las muestras durante cinco segundos. Incubar durante la noche a 20 grados centígrados.Al día siguiente, centrifugar las muestras a 20.000 x g durante 30 minutos a cuatro grados centígrados y desechar el sobrenadante. A continuación, lavar el pellet con 500 microlitros de etanol 70% helado y repetir la centrifugación. Aspire con cuidado la mayor cantidad posible de sobrenadante sin desalojar el pellet.Luego, seque el pellet al aire durante cinco a 10 minutos. Vuelva a suspender el pellet en agua libre de nucleasas hasta una concentración final de 0,5 microgramos por microlitro. Para comenzar el ensayo de huellas dactilares, agregue 15 microlitros de lisado de reticulocitos de conejo no tratado con nucleasa a cada tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitros, que representan el ARN XIAP IRES de tipo salvaje y sus mutantes.Agregue un inhibidor de RNasa, ATP y GMP-PNP a cada tubo. Incubar a 30 grados centígrados durante cinco minutos. Después de esto, agregue un microlitro del ARN respectivo a cada uno de los tubos e incube a 30 grados centígrados durante cinco minutos adicionales.Durante el período de incubación, agregue DTT y espermidina al tampón de huellas de los pies. A continuación, añade 22 microlitros de tampón de toeprint a cada uno de los tubos e incuba a 30 grados centígrados durante tres minutos. A continuación, añade 0,5 microlitros de imprimación de impresión de dedos marcada con tinte IR e incuba la reacción en hielo durante 10 minutos.Posteriormente, agregue dos microlitros de dNTP, dos microlitros de acetato de magnesio y un microlitro de transcriptasa inversa del virus de la mioloblastosis aviar. Lleva el volumen final a 50 microlitros con tampón de punta. Luego, permita que la extensión de la imprimación ocurra durante 45 minutos a 30 grados centígrados.También es fundamental agregar acetato de magnesio a la reacción de impresión del pie, sin el cual, la transcriptasa inversa no funcionará de manera óptima. Después de esto, agregue 200 microlitros de agua sin nucleasas. Añadir 250 microlitros de fenol:cloroformo:alcohol isoamílico 25:24:1, pH 8,0, para iniciar la purificación del ADNc.Después de vórtice las muestras durante cinco segundos, centrifugar las muestras a 20.000 x g a temperatura ambiente durante tres minutos. A continuación, transfiera cuidadosamente la fase acuosa que contiene el ADN a un nuevo tubo de microcentrífuga. Luego, agregue tres volúmenes de etanol al 100% para precipitar el ADN y el vórtice durante cinco segundos.Incubar durante la noche a 20 grados centígrados. Al día siguiente, centrifugar los tubos a 20.000 x g durante 30 minutos a cuatro grados centígrados y desechar el sobrenadante. A continuación, lavar el pellet de ADN con 500 microlitros de etanol 70% helado y centrifugar a 20.000 x g durante 15 minutos a cuatro grados centígrados.Aspire tanto sobrenadante como sea posible, teniendo cuidado de no desprender la bolita. Luego, seque el pellet al aire durante cinco a 10 minutos. Disuelva el pellet de ADN en seis microlitros de agua libre de nucleasa.A continuación, añade tres microlitros de colorante de carga de formamida. Utilice un kit de secuenciación para preparar una escalera de secuenciación de nucleótidos de didesoxi con el cebador de huellas y la construcción de ADN que codifica el ARN de XIAP IRES. A continuación, mezcle seis microlitros de cada reacción de secuenciación con tres microlitros del colorante de carga de formamida.Después de limpiar y ensamblar las placas, vierta el gel e inserte el peine. Después de la polimerización del gel, ensamble el aparato de secuenciación y llene los depósitos con 1x TBE. Luego, preejecute a 1500 voltios durante 15 minutos hasta alcanzar una temperatura de 55 grados centígrados.Caliente todas las muestras con colorante de formamida a 85 grados centígrados durante cinco minutos. A continuación, cargue un microlitro de cada muestra en un gel de secuenciación de poliacrilamida al 6% y haga funcionar el gel a 1500 voltios durante ocho horas. Por último, lea las bandas en tiempo real con un generador de imágenes fluorescente.Este método muestra que la confirmación del ARN es fundamental para la formación del complejo de iniciación de la traducción. La transcripción inversa del complejo ribosoma de ARNm de XIAP produce huellas típicas de 17 a 19 nucleótidos aguas abajo de AUG. El mutante 5'PPT muestra una formación alterada de las huellas dactilares.Sin embargo, cuando se transcribe con el 5'cap, se produce la formación de complejos de iniciación. Del mismo modo, el mutante 3'PPT también muestra un deterioro en la formación de huellas dactilares. Sin embargo, la transcripción con el 5'cap conduce a la formación de complejos de iniciación.El mutante doble PPT que alberga las mutaciones 5'PPT y 3'PPT es capaz de formar el complejo de iniciación sin el 5'cap. La formación de la huella del pie está fuertemente afectada para el mutante del codón de inicio en ausencia de RRL y GMP-PNP y una cola Poly A. Los productos de CDNA se comparan con una escalera de secuenciación de nucleótidos didesoxi.La beta globina humana, o ARNm HBB, no muestra huella en ausencia de la gorra 5'. Sin embargo, el complejo de iniciación se forma en la capa 5'UTR de HBB, produciendo huellas de 16 a 18 nucleótidos aguas abajo de AUG. Una vez dominada, esta técnica se puede realizar en tres días, incluyendo la preparación de plantillas de transcripción in vitro y ARN, si se realiza correctamente.Siguiendo este procedimiento, se pueden realizar otros métodos, como el sondeo estructural, para responder a preguntas adicionales, como la estructura secundaria de las variantes de tipo salvaje o mutante del IRES. Tras su desarrollo, esta técnica ha allanado el camino para que los investigadores en el campo de la traducción del ARNm exploren la traducción mediada por IRES in vitro. Después de ver este video, debe tener una buena comprensión de cómo realizar la impresión de dedos del ARNm de mamíferos y analizar la formación de complejos de iniciación de la traducción.No olvide que el fenol ácido, el fenol, el cloroformo, el alcohol isoamílico y la acrilamida pueden ser extremadamente peligrosos. Se debe usar equipo de protección personal adecuado mientras se usan estos reactivos.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Biochemistry

Bioquímica

Un obstáculo importante para los análisis bioquímicos de los ribosomas que contienen naciente peptidil-ARNt ha sido la presencia de los ribosomas otros en las mismas muestras, los ribosomas no participan en la traducción de la secuencia del ARNm específico que se analiza. Hemos desarrollado una metodología sencilla para purificar, exclusivamente, los ribosomas que contiene la naciente peptidil-tRNA de interés.

El aislamiento de los ribosomas traducir contienen peptidil-ARNt para el Análisis Funcional y Estructural

Aquí, se describe un método para analizar los cambios en la iniciación de la traducción de ARNm de células eucariotas en respuesta a condiciones de estrés. Este método se basa en la separación de velocidad en gradientes de sacarosa de la traducción de los ribosomas de los ribosomas no traducir.

Análisis de la Traducción Iniciación Durante condiciones de estrés por polisoma Profiling

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En Interrogatorio vivo del Sistema Nervioso Central Translatome por Polyribosome Fraccionamiento

Los ribosomas desempeñan un papel central en la síntesis de proteínas. Polyribosome (polisomas) fraccionamiento por centrifugación en gradiente de densidad de sacarosa permite la determinación directa de la eficiencia de traducción de los ARNm individuales en un genoma de gran escala. Además, este método se puede utilizar para el análisis bioquímico de ribosoma y factores de polisomas asociados tales como chaperones y moléculas de señalización.

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Este manuscrito describe un método para visualizar y cuantificar eventos traducción localizada en compartimientos subcelulares. El enfoque propuesto en este manuscrito requiere un sistema de proyección de imagen confocal básico y reactivos y es rápida y rentable.

La inmunofluorescencia cuantitativa a medida Global localizada traducción

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El seguimiento de eventos de traducción individuales permite estudios cinéticos de alta resolución de mecanismos de traducción dependientes de la tapa. Aquí demostramos un ensayo in vitro de una sola molécula basado en interacciones por imágenes entre anticuerpos etiquetados fluorescentemente y péptidos nacientes etiquetados con epitopos. Este método permite la caracterización de moléculas únicas de cinética de iniciación y elongación peptídica durante la traducción activa dependiente de la...

Un ensayo de imágenes de molécula única in vitro para el análisis de cinética de traducción dependiente de la tapa

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Presentamos una técnica para estabilizar rápidamente complejos traslacionales (biosíntesis de proteínas) con reticulación de formaldehído en levaduras vivas y células de mamíferos. El enfoque permite diseccionar intermedios transitorios e interacciones dinámicas ARN:proteína. Los complejos reticulados se pueden utilizar en múltiples aplicaciones posteriores, como en métodos de perfiles basados en secuenciación profunda, microscopía y espectrometría de masas.

Fijación rápida in vivo y aislamiento de complejos traslacionales de células eucariotas

Aquí se describe protocolos para romper las células de mamíferos por molienda en estado sólido a una temperatura criogénica, producir un extracto celular a partir del polvo de células resultante, y aislar los complejos de proteínas de interés por captura de afinidad sobre perlas paramagnéticas a escala micrométrica de anticuerpos acoplados.

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Aprende el análisis de toeprinting para estudiar la formación de complejos de iniciación de traducción en mRNAs mamíferos. Este método permite investigar mecanismos de traducción dependientes de cap e IRES en biología molecular.

Toeprinting análisis de formación de complejos de iniciación traducción de mRNAs mamíferos

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