Toeprinting análisis de formación de complejos de iniciación traducción de mRNAs mamíferos
10 de mayo de 2018
Toeprinting tiene como objetivo medir la capacidad de in vitro transcrito RNA para formar complejos de iniciación de traducción con los ribosomas en una variedad de condiciones. Este protocolo describe un método para RNA mamíferos toeprinting y puede utilizarse para estudiar traducción dependiente de la tapa y IRES-conducido.
El objetivo general de este análisis es observar la formación del complejo de iniciación de la traducción en los ARNm de mamíferos. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la traducción del ARNm, como el inicio de la traducción mediada por IRES. La principal ventaja de esta técnica es que se puede realizar un análisis detallado de la formación del complejo de iniciación de la traducción en un ARNm específico.
Ensamble las reacciones de transcripción para transcribir el ARN de las plantillas de ADN amplificadas por PCR, codificando el ARN de XIAP IRES o sus mutantes. A continuación, agregue dos unidades de DNasa libre de ARN para eliminar la plantilla de ADN a cada reacción de ARN de 20 microlitros. Incubar a 37 grados centígrados durante 30 minutos.
A continuación, diluir el ARN tratado con DNasa con agua libre de nucleasas hasta un volumen final de 110 microlitros. A continuación, agregue 110 microlitros de fenol ácido para comenzar la purificación del ARN. Agite las muestras durante cinco segundos y centrifuga a 20.000 x g durante tres minutos a temperatura ambiente.
Es fundamental diluir el ARN o el CDNA antes de la extracción con fenol. Si el volumen es demasiado bajo, va a ser difícil recuperar físicamente la fase acuosa y el rendimiento final será bajo. Luego, transfiera cuidadosamente 100 microlitros de la fase acuosa que contiene ARN a un nuevo tubo de microcentrífuga.
Añadir 10 microlitros de acetato de sodio 3 M, pH 5,5, y mezclar las muestras. A continuación, añada tres volúmenes de etanol al 100% para precipitar el ARN y vórtice las muestras durante cinco segundos. Incubar durante la noche a 20 grados centígrados.
Al día siguiente, centrifugar las muestras a 20.000 x g durante 30 minutos a cuatro grados centígrados y desechar el sobrenadante. A continuación, lavar el pellet con 500 microlitros de etanol 70% helado y repetir la centrifugación. Aspire con cuidado la mayor cantidad posible de sobrenadante sin desalojar el pellet.
Luego, seque el pellet al aire durante cinco a 10 minutos. Vuelva a suspender el pellet en agua libre de nucleasas hasta una concentración final de 0,5 microgramos por microlitro. Para comenzar el ensayo de huellas dactilares, agregue 15 microlitros de lisado de reticulocitos de conejo no tratado con nucleasa a cada tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitros, que representan el ARN XIAP IRES de tipo salvaje y sus mutantes.
Agregue un inhibidor de RNasa, ATP y GMP-PNP a cada tubo. Incubar a 30 grados centígrados durante cinco minutos. Después de esto, agregue un microlitro del ARN respectivo a cada uno de los tubos e incube a 30 grados centígrados durante cinco minutos adicionales.
Durante el período de incubación, agregue DTT y espermidina al tampón de huellas de los pies. A continuación, añade 22 microlitros de tampón de toeprint a cada uno de los tubos e incuba a 30 grados centígrados durante tres minutos. A continuación, añade 0,5 microlitros de imprimación de impresión de dedos marcada con tinte IR e incuba la reacción en hielo durante 10 minutos.
Posteriormente, agregue dos microlitros de dNTP, dos microlitros de acetato de magnesio y un microlitro de transcriptasa inversa del virus de la mioloblastosis aviar. Lleva el volumen final a 50 microlitros con tampón de punta. Luego, permita que la extensión de la imprimación ocurra durante 45 minutos a 30 grados centígrados.
También es fundamental agregar acetato de magnesio a la reacción de impresión del pie, sin el cual, la transcriptasa inversa no funcionará de manera óptima. Después de esto, agregue 200 microlitros de agua sin nucleasas. Añadir 250 microlitros de fenol:cloroformo:alcohol isoamílico 25:24:1, pH 8,0, para iniciar la purificación del ADNc.
Después de vórtice las muestras durante cinco segundos, centrifugar las muestras a 20.000 x g a temperatura ambiente durante tres minutos. A continuación, transfiera cuidadosamente la fase acuosa que contiene el ADN a un nuevo tubo de microcentrífuga. Luego, agregue tres volúmenes de etanol al 100% para precipitar el ADN y el vórtice durante cinco segundos.
Incubar durante la noche a 20 grados centígrados. Al día siguiente, centrifugar los tubos a 20.000 x g durante 30 minutos a cuatro grados centígrados y desechar el sobrenadante. A continuación, lavar el pellet de ADN con 500 microlitros de etanol 70% helado y centrifugar a 20.000 x g durante 15 minutos a cuatro grados centígrados.
Aspire tanto sobrenadante como sea posible, teniendo cuidado de no desprender la bolita. Luego, seque el pellet al aire durante cinco a 10 minutos. Disuelva el pellet de ADN en seis microlitros de agua libre de nucleasa.
A continuación, añade tres microlitros de colorante de carga de formamida. Utilice un kit de secuenciación para preparar una escalera de secuenciación de nucleótidos de didesoxi con el cebador de huellas y la construcción de ADN que codifica el ARN de XIAP IRES. A continuación, mezcle seis microlitros de cada reacción de secuenciación con tres microlitros del colorante de carga de formamida.
Después de limpiar y ensamblar las placas, vierta el gel e inserte el peine. Después de la polimerización del gel, ensamble el aparato de secuenciación y llene los depósitos con 1x TBE. Luego, preejecute a 1500 voltios durante 15 minutos hasta alcanzar una temperatura de 55 grados centígrados.
Caliente todas las muestras con colorante de formamida a 85 grados centígrados durante cinco minutos. A continuación, cargue un microlitro de cada muestra en un gel de secuenciación de poliacrilamida al 6% y haga funcionar el gel a 1500 voltios durante ocho horas. Por último, lea las bandas en tiempo real con un generador de imágenes fluorescente.
Este método muestra que la confirmación del ARN es fundamental para la formación del complejo de iniciación de la traducción. La transcripción inversa del complejo ribosoma de ARNm de XIAP produce huellas típicas de 17 a 19 nucleótidos aguas abajo de AUG. El mutante 5'PPT muestra una formación alterada de las huellas dactilares.
Sin embargo, cuando se transcribe con el 5'cap, se produce la formación de complejos de iniciación. Del mismo modo, el mutante 3'PPT también muestra un deterioro en la formación de huellas dactilares. Sin embargo, la transcripción con el 5'cap conduce a la formación de complejos de iniciación.
El mutante doble PPT que alberga las mutaciones 5'PPT y 3'PPT es capaz de formar el complejo de iniciación sin el 5'cap. La formación de la huella del pie está fuertemente afectada para el mutante del codón de inicio en ausencia de RRL y GMP-PNP y una cola Poly A. Los productos de CDNA se comparan con una escalera de secuenciación de nucleótidos didesoxi.
La beta globina humana, o ARNm HBB, no muestra huella en ausencia de la gorra 5'. Sin embargo, el complejo de iniciación se forma en la capa 5'UTR de HBB, produciendo huellas de 16 a 18 nucleótidos aguas abajo de AUG. Una vez dominada, esta técnica se puede realizar en tres días, incluyendo la preparación de plantillas de transcripción in vitro y ARN, si se realiza correctamente.
Siguiendo este procedimiento, se pueden realizar otros métodos, como el sondeo estructural, para responder a preguntas adicionales, como la estructura secundaria de las variantes de tipo salvaje o mutante del IRES. Tras su desarrollo, esta técnica ha allanado el camino para que los investigadores en el campo de la traducción del ARNm exploren la traducción mediada por IRES in vitro. Después de ver este video, debe tener una buena comprensión de cómo realizar la impresión de dedos del ARNm de mamíferos y analizar la formación de complejos de iniciación de la traducción.
No olvide que el fenol ácido, el fenol, el cloroformo, el alcohol isoamílico y la acrilamida pueden ser extremadamente peligrosos. Se debe usar equipo de protección personal adecuado mientras se usan estos reactivos.
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Visión general
Este análisis de toeprinting tiene como objetivo medir la formación de complejos de iniciación de la traducción en los ARNm de mamíferos. Proporciona información sobre los mecanismos de traducción tanto dependientes como independientes de la cap y dirigidos por IRES.
Componentes clave del estudio
Área de la ciencia
- Neurociencia
- Bioquímica
- Biología molecular
Antecedentes
- El toeprinting es una técnica utilizada para estudiar la iniciación de la traducción.
- Permite el análisis de interacciones específicas de ARNm con ribosomas.
- El método puede aplicarse para investigar la iniciación de la traducción mediada por IRES.
- Comprender estos procesos es crucial para obtener información sobre la regulación de la expresión génica.
Propósito del estudio
- Observar la formación de complejos de iniciación de la traducción en los ARNm de mamíferos.
- Explorar los mecanismos de iniciación de la traducción mediada por IRES.
- Proporcionar un análisis detallado de la iniciación de la traducción en ARNm específicos.
Métodos utilizados
- Se ensamblan reacciones de transcripción para transcribir ARN a partir de plantillas de ADN amplificado por PCR.
- Se añade DNase libre de RNasa para eliminar la plantilla de ADN de las reacciones de ARN.
- La incubación se realiza a 37 grados Celsius durante 30 minutos.
- Se realiza un análisis de toeprinting para evaluar la formación de complejos.
Principales resultados
- El método demuestra con éxito la formación de complejos de iniciación de la traducción.
- Se obtiene información sobre la iniciación de la traducción mediada por IRES.
- Se pueden analizar en detalle las interacciones específicas de ARNm con los ribosomas.
- La técnica proporciona un marco robusto para estudiar la iniciación de la traducción.
Conclusiones
- El toeprinting es un método eficaz para estudiar la iniciación de la traducción.
- La técnica mejora la comprensión de los mecanismos de traducción de ARNm.
- Se puede aplicar a varios ARNm para explorar su dinámica de traducción.
Preguntas frecuentes
Executive Industry Relevance
Toeprinting analysis enables precise interrogation of translation initiation mechanisms, a critical control point in protein synthesis regulation. This method provides actionable insights into cap-dependent and IRES-mediated translation, directly informing target validation and mechanistic de-risking in early discovery. Its ability to dissect regulatory elements and ribosome interactions supports predictive confidence for portfolio triage in disease-relevant systems.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables direct assessment of ribosome binding to specific mRNA sequences and structures.
- Clarifies the functional impact of regulatory elements such as IRES on translation initiation.
- Supports mechanistic de-risking by distinguishing cap-dependent from cap-independent initiation pathways.
- Facilitates hypothesis-driven validation of translational control points relevant to disease states.
Screening & Assay Development
- Provides a validated system for quantifying translation initiation complex formation under defined conditions.
- Enables reproducible measurement of mutant and wild-type mRNA interactions with ribosomes.
- Supports assay standardization for downstream screening of translation modulators.
- Delivers quantitative outputs that inform compound evaluation and mechanistic screening.
Translational & Preclinical Research
- Aligns with disease-relevant models by interrogating stress-response translation mechanisms.
- Supports continuity from molecular discovery to preclinical validation of translational regulation.
- Enables risk-adjusted advancement by clarifying the translational impact of RNA regulatory elements.
- Provides mechanistic data to inform biomarker development for translation-based interventions.
Pipeline & Workflow Integration
Toeprinting positions within the early discovery to lead identification continuum, bridging molecular mechanism elucidation and assay development for translation-targeted programs.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing of translation initiation mechanisms and regulatory element function.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative readouts for translation initiation complex formation.
- Analytics: Enables direct comparison of wild-type and mutant mRNA translation initiation efficiency.
- Translational Research: Connects molecular findings to disease-relevant translation control and stress-response pathways.
- Enterprise Reuse: Functions as a reusable platform for diverse mRNA and regulatory element interrogation across programs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation and reduces mechanistic ambiguity in translation control.
- Operational Value: Standardizes translation initiation assays for reproducibility and scalability across R&D teams.
- Strategic Value: Informs go/no-go decisions by clarifying translational regulation and supporting capital-efficient portfolio advancement.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of targets and mechanisms based on translational control data.
Implementation Considerations
- Requires expertise in RNA handling, in vitro transcription, and ribosome complex assembly.
- Demands access to specialized reagents, fluorescent imaging, and sequencing infrastructure.
- Necessitates rigorous cross-team standardization for reproducible toeprint quantification.
- Adaptation may be needed for different mRNA templates or regulatory element contexts.
- Careful handling of hazardous reagents and optimization of reaction conditions are essential for reliable outputs.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:04
Title
0:34
Preparation of mRNA
2:59
Toeprinting Assay
6:32
Sequencing Reactions and Gel Electrophoresis
7:53
Results: Importance of IRES Secondary Structure in the Formation of Translation Initiation Complexes on an Uncapped XIAP IRES RNA
9:35
Conclusion
