Name: Virus de la entrega de guías CRISPR para la próstata murina por alteración del gen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-04-27T15:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 21 s
Description: Aprenda a realizar edición génica en la próstata murina mediante entrega viral de guías CRISPR/Cas9. Este método permite alterar la expresión génica ortotópicamente y estudiar el cáncer de próstata in vivo.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Señor fue financiado por una beca de la sociedad danesa del cáncer (R146-A9394-16-S2). MFB y MKT fueron financiados por AUFF NOVA (AUFF-E-2015-FLS-9-8). Señor y MFB fueron financiado por la escuela de postgrado, salud, AU. El laboratorio E.F.W. es apoyado por becas del Ministerio de economía (SAF2015-70857, cofinanciado por el FEDER de la UE) y una ERC advanced grant (741888 - CSI-Fun).
Queremos agradecer a Liliana Fajardo Mellor (Genes, desarrollo y enfermedad; Centro Nacional de investigación de cáncer) para la lectura crítica del manuscrito.

Este protocolo trata de un procedimiento quirúrgico en ratones de laboratorio. Todos los experimentos con animales deben ser revisados y aprobados por un cuidado institucional del Animal y el Comité uso (IACUC) individualmente. Como el enfoque se basa en la supervivencia y recuperación de animales, asegurar adecuada anestesia, manejo del dolor y un ambiente quirúrgico aséptico en todos los tiempos. Use una almohadilla de calefacción para prevenir la hipotermia durante la cirugía y hasta la recuperación de la anestesia.
1. a partir de consideraciones
<ol><li>Dependiendo del virus usado, pueden aplicar requisitos de título diferentes; diluir el virus por consiguiente. Nota: En este ejemplo, se inyecta un virus Adeno-asociado, diluido en PBS en un título de 1 x 1012 UI/mL. El virus tiene el serotipo 9 y contiene RNA guía Pten y expresión de la proteína de Cre bajo un promotor ubiquitina (figura 1). Pérdida de Pten aumentó pAKT y proliferación del epitelio prostático13.</li>
	<li>Utilizar ratones machos en una edad de 8 semanas en el momento de la cirugía para asegurar el desarrollo adecuado de próstata. Nota: Se muestra en este experimento de ratones son Rosa26-LSL-Cas9-EGFP knockin ratones C57BL/6J fondo12 (figura 1).</li>
	<li>Recién prepare una mezcla de anestesia general y si es posible mantenerlo estéril. Nota: Para mejor recuperación animal después de la cirugía, un antídoto de la anestesia es muy recomendable.<ol>
<li>Para preparar un volumen total de 5 mL de anestésico, mezclar clorhidrato de medetomidina 0.15 mL (1 mg/mL), 0.4 mL midazolam (5 mg/mL) y butorfanol 0.25 mL (10 mg/mL) con 4,2 mL de agua salina estéril. Nota: Pueden utilizarse métodos alternativos de anestesia, como isoflurano inhalable, según las directrices de cuidado institucional de los animales.</li>
		<li>Para invertir el efecto de la poste-cirugía de hidrocloruro de medetomidina, mezclar atipamezole 0,1 mL (5 mg/mL) con 4,9 mL de agua salina estéril.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Prepare un ambiente aséptico quirúrgico adecuada desinfección y esterilización. Instrumentos quirúrgicos autoclave antes de su uso.</li>
</ol>2. virus-entrega a la próstata murina
<ol><li>Anestesiar el animal por la inyección intraperitoneal con una jeringa estéril de 1 mL y una aguja de 27 x ½". Utilizar una dosis de anestesia de 0.01 mL/g de peso corporal. Si el procedimiento dura más de 30 min, mantener la anestesia mediante la inyección de 1/3 de la a partir de la dosis cada 30 minutos.</li>
	<li>Examinar la profundidad anestésica mediante la evaluación de la relajación muscular y pedal retirada reflejos palpebrales. Cuando se observa pérdida de los reflejos, afeite la parte inferior del abdomen del animal.</li>
	<li>Cuidadosamente cubra los ojos del animal con ungüento oftálmico veterinaria utilizando un hisopo de algodón estéril para prevenir la ceguera debido a la falta de reflejo corneal.</li>
	<li>Limpie el abdomen depilado con 70% etanol y 10% de povidona yodada para la desinfección de la zona quirúrgica. Frote el área quirúrgico del centro de la zona quirúrgica hacia la periferia.</li>
	<li>Realizar una incisión vertical de piel en la línea media abdominal baja de aproximadamente 1 cm con una tijera quirúrgica estéril.</li>
	<li>Levantar el peritoneo mediante unas pinzas de punta fina para no dañar los órganos que están debajo. Cuidadosamente hacer una incisión de < 8 mm con tijeras quirúrgicas a través del peritoneo. Nota: A diferencia de los humanos, glándula de la próstata de un roedor consta de cuatro lóbulos separados. El lóbulo anterior se une a la vesícula seminal.</li>
	<li>Mueva suavemente el tejido adiposo a un lado para descubrir la vesícula seminal. Usando unas pinzas de anillo, levante cuidadosamente la vesícula seminal hasta la próstata anterior puede ser identificados (figura 1).</li>
	<li>Inyectar un volumen total de 30 μL solución de virus (3 x 1010 partículas virales) en el epitelio prostático anterior utilizando una jeringa de insulina de 0,5 mL con aguja 30 x 8 mm. Minimizar las fugas y garantizar que el líquido es absorbido dentro del tejido, formando una pequeña burbuja. Vuelva a colocar la vesícula seminal en la cavidad abdominal.</li>
	<li>La sutura del peritoneo con 2-3 suturas interrumpidos simple utilizando suturas absorbibles 6-0 y 13 mm, 3/8 círculo, una aguja de punto de forma cónica.</li>
	<li>Sujete con grapa la piel con 3 pinzas estériles 4.8 x 6.5 mm levantando la piel con pinzas para evitar dañar el peritoneo.</li>
	<li>Para la mejor recuperación, aplicar el antídoto de la anestesia en dosis de 0.01 mL/g de peso corporal por inyección intraperitoneal utilizando una jeringa estéril de 1 mL y una aguja de 27 x ½". Coloque con cuidado la espalda animal en su jaula.</li>
</ol>3. después de la cirugía procedimientos
<ol><li>Mantener la jaula con los ratones que experimentaron la cirugía sobre una almohadilla de calefacción durante 1 h después del procedimiento, para prevenir la hipotermia hasta que se recuperó completamente. Si se aplica el antídoto, el animal debe ser despierto unos minutos después de la inyección.</li>
	<li>Monitorear los animales diariamente indicaciones apropiadas herida curación y el dolor. Si es necesario, administrar analgésicos adicionales según las pautas de cuidado institucional de los animales.</li>
	<li>Eliminar clips de la piel después de 4-5 días, una vez que la herida se cierra.</li>
</ol>

<ol><li>Ferlay, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer+incidence+and+mortality+worldwide%3A+sources%2C+methods+and+major+patterns+in+GLOBOCAN+2012%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Cancer%22%5BJournal%5D)">Cancer incidence and mortality worldwide: sources, methods and major patterns in GLOBOCAN 2012.</a> Int J Cancer. 136, E359-E386 (2015).</li>
<li>Gerlinger, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intratumor+heterogeneity+and+branched+evolution+revealed+by+multiregion+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22N+Engl+J+Med%22%5BJournal%5D)">Intratumor heterogeneity and branched evolution revealed by multiregion sequencing.</a> N Engl J Med. 366, 883-892 (2012).</li>
<li>Robinson, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrative+Clinical+Genomics+of+Advanced+Prostate+Cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Integrative Clinical Genomics of Advanced Prostate Cancer.</a> Cell. 162, 454(2015).</li>
<li>Gama Sosa, M. A., De Gasperi, R., Elder, G. A. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/19937345">Animal transgenesis: an overview.</a> Brain Struct Funct. 214, 91-109 (2010).</li>
<li>Wu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+a+prostate+epithelial+cell-specific+Cre+transgenic+mouse+model+for+tissue-specific+gene+ablation%5BTitle%5D)+AND+%22Mech+Dev%22%5BJournal%5D)">Generation of a prostate epithelial cell-specific Cre transgenic mouse model for tissue-specific gene ablation.</a> Mech Dev. 101, 61-69 (2001).</li>
<li>Ma, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+biallelic+inactivation+of+Pten+in+the+mouse+prostate+leads+to+prostate+cancer+accompanied+by+increased+epithelial+cell+proliferation+but+not+by+reduced+apoptosis%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Targeted biallelic inactivation of Pten in the mouse prostate leads to prostate cancer accompanied by increased epithelial cell proliferation but not by reduced apoptosis.</a> Cancer Res. 65, 5730-5739 (2005).</li>
<li>Chen, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crucial+role+of+p53-dependent+cellular+senescence+in+suppression+of+Pten-deficient+tumorigenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Crucial role of p53-dependent cellular senescence in suppression of Pten-deficient tumorigenesis.</a> Nature. 436, 725-730 (2005).</li>
<li>Leow, C. C., Wang, X. D., Gao, W. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+method+of+generating+prostate-specific+Cre-LoxP+gene+switching+via+intraductal+delivery+of+adenovirus%5BTitle%5D)+AND+%22Prostate%22%5BJournal%5D)">Novel method of generating prostate-specific Cre-LoxP gene switching via intraductal delivery of adenovirus.</a> Prostate. 65, 1-9 (2005).</li>
<li>Thomsen, M. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Loss+of+JUNB%2FAP-1+promotes+invasive+prostate+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+Differ%22%5BJournal%5D)">Loss of JUNB/AP-1 promotes invasive prostate cancer.</a> Cell Death Differ. 22, 574-582 (2015).</li>
<li>Cho, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((a+novel+GEM+model+for+metastatic+prostate+cancer+analysis+and+therapy%2C+reveals+myc+as+a+driver+of+Pten-mutant+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Discov%22%5BJournal%5D)">a novel GEM model for metastatic prostate cancer analysis and therapy, reveals myc as a driver of Pten-mutant metastasis.</a> Cancer Discov. 4, 318-333 (2014).</li>
<li>Cho, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+in+vivo+validation+of+candidate+drivers+derived+from+the+PTEN-mutant+prostate+metastasis+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Rapid in vivo validation of candidate drivers derived from the PTEN-mutant prostate metastasis genome.</a> Methods. 77-78, 197-204 (2015).</li>
<li>Platt, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR-Cas9+knockin+mice+for+genome+editing+and+cancer+modeling%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">CRISPR-Cas9 knockin mice for genome editing and cancer modeling.</a> Cell. 159, 440-455 (2014).</li>
<li>Wang, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prostate-specific+deletion+of+the+murine+Pten+tumor+suppressor+gene+leads+to+metastatic+prostate+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">Prostate-specific deletion of the murine Pten tumor suppressor gene leads to metastatic prostate cancer.</a> Cancer Cell. 4, 209-221 (2003).</li>
<li>Liu, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Copy+number+analysis+indicates+monoclonal+origin+of+lethal+metastatic+prostate+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">Copy number analysis indicates monoclonal origin of lethal metastatic prostate cancer.</a> Nat Med. 15, 559-565 (2009).</li>
<li>Haffner, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tracking+the+clonal+origin+of+lethal+prostate+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">Tracking the clonal origin of lethal prostate cancer.</a> J Clin Invest. 123, 4918-4922 (2013).</li>
<li>Daya, S., Berns, K. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+therapy+using+adeno-associated+virus+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Microbiol+Rev%22%5BJournal%5D)">Gene therapy using adeno-associated virus vectors.</a> Clin Microbiol Rev. 21, 583-593 (2008).</li>
<li>Price, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+Aspects+of+Development+and+Structure+in+the+Prostate%5BTitle%5D)+AND+%22Natl+Cancer+Inst+Monogr%22%5BJournal%5D)">Comparative Aspects of Development and Structure in the Prostate.</a> Natl Cancer Inst Monogr. 12, 1-27 (1963).</li>
<li>McNeal, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anatomy+of+the+prostate%3A+an+historical+survey+of+divergent+views%5BTitle%5D)+AND+%22Prostate%22%5BJournal%5D)">Anatomy of the prostate: an historical survey of divergent views.</a> Prostate. 1, 3-13 (1980).</li>
<li>Thomsen, M. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SOX9+elevation+in+the+prostate+promotes+proliferation+and+cooperates+with+PTEN+loss+to+drive+tumor+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">SOX9 elevation in the prostate promotes proliferation and cooperates with PTEN loss to drive tumor formation.</a> Cancer Res. 70, 979-987 (2010).</li>
</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

En este protocolo, se describe un método para alterar la expresión génica en el lóbulo anterior de la próstata murina por inyección de virus, creando un poderoso nuevo modelo de ratón para cáncer de próstata (figura 2). La administración exitosa de un Adenovirus primero fue descrita por Leow et en 20058. Anteriormente hemos mostrado cómo un Adenovirus que codifica para una proteína del recombinase de Cre puede substituir cruces desperdiciadora de tiempo de un...

Detección y tratamiento del cáncer de próstata han mejorado significativamente durante la última década. Aún así, la incidencia de cáncer de próstata está aumentando, a raíz de la esperanza de vida. Con un estimado 1,1 millones nuevos casos en todo el mundo, es una de las causas más comunes de muerte relacionada con cáncer en los hombres 1. El cáncer de próstata es lento en su desarrollo, pero cuando el cáncer ha progresado a un estado metastásico avanzado, el pronóstico es pobre debido a las opciones de tratamiento limitadas. Hasta ahora, sólo unos pocos genes se han identificado como controladores comunes de este cáncer, y su heterogeneidad y multifocalidad impide la detección de biomarcadores y enfermedad targetable controladores2,3.
Técnicas clásicas de GEMMs generación a menudo se deterioran por su complejidad, gastos de tiempo y costos. Modelos condicionales han sido ampliamente utilizados para el estudio de genes candidatos de cáncer de próstata, que resultan en mortalidad embrionaria cuando inactivado en la línea germinal4. Modelos más comunes implican un recombinase de Cre prostático específico conducido por cualquiera un Probasin modificado5 o promotor PSA6 integrada en el GEMM por cruzamiento adicional. En estos modelos, el gen de interés estará dirigido en la mayoría de las células epiteliales prostáticas, generación de hiperplasia en el órgano entero, que puede perjudicar tracto urinario función7 del animal.
Entrega viral de la proteína de Cre por inyección en el lóbulo anterior de la próstata murina puede resolver este problema dirigiéndose sólo a unas pocas células8. Teniendo en cuenta, los beneficios del método de una amplia gama de variaciones posibles requisitos técnicos de laboratorios, conocimientos y objetivos. Enfoques exitosos utilizando Adenovirus a JunB y Pten9 o Lentivirus a Pten y Trp5310 ha demostrado entre otros. Agregar los transgenes, como luciferasa, el constructo viral o el GEMM además permitirá monitorización no invasiva de progresión de la enfermedad mediante bioluminiscencia imagen11.
La edición del genoma basado en la tecnología CRISPR/Cas9 revela una oportunidad nueva y rápida para el estudio de cáncer a través de la rápida generación de nocauts somática12. Entrega viral solo guía RNAs (sgRNAs) dirigida al lóbulo anterior de la próstata murino establece un modelo fisiológico más relevante del cáncer de próstata. De esta forma, las células con mutaciones solicitadas pueden formar clones capaces de expansión y de invasión. Además, uso de guía RNAs para varios genes diana va a generar clones de células con alteraciones en distintos genes. Esto permitirá que la heterogeneidad del tumor y una presión de selección natural en la progresión del cáncer, que puede revelar la importancia de cada alteración de genes o mecanismos epistáticas.
Aquí presentamos un método para entregar partículas virales a la próstata murina para alteración de la expresión génica. Por una pequeña incisión abdominal, se expone el lóbulo prostático anterior murino y se inyectan partículas virales en el lóbulo. Cinco días después de la cirugía, quirúrgicos clips pueden eliminarse de la piel y el cáncer prostático puede ser analizada desde 8 semanas después. En general, este es un procedimiento rápido y eficiente, que tiene poco impacto en el ratón y permite mayor tumor sin comprometer el ratón.

<table><tbody><tr><td><fuerte>Equipo</fuerte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>B6J.129(B6N)-Gt(ROSA)26Sortm1(CAG-cas9*,-EGFP)Fezh/J</td><td>ratones The Jackson Laboratory</td><td>26175</td><td></td></tr><tr><td>0,5 ml Jeringa de insulina U-100</td><td>BD 324825</td><td></td><td>para inyección de virus</td></tr><tr><td>Jeringa de 1 ml</td><td>BD</td><td>300013</td><td>para inyección de anestesia</td></tr><tr><td>30 G 1/2' ' aguja</td><td>BD</td><td>304000</td><td>para inyección de anestesia</td></tr><tr><td>6-0 Sutura Polysorb</td><td>Medtronic</td><td>GL889</td><td>para cerrar el peritoneo</td></tr><tr><td>Cortina de cirugía esterilizada desechable</td><td>múltiples proveedores</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Almohadilla térmica</td><td>múltiples proveedores</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Povidona-Yodo Almohadilla de preparación</td><td>Fisher Scientific</td><td>06-669-70</td><td></td></tr><tr><td>Recorte máquina</td><td>Aesculap</td><td>GT415</td><td>para afeitar el abdomen</td></tr><tr><td>Pinzas Dumont</td><td>F.S.T</td><td>11252-00</td><td></td></tr><tr><td>Halsey Micro Portaagujas</td><td>F.S.T</td><td>12500-12</td><td></td></tr><tr><td>Tijeras de iris</td><td>F.S.T</td><td>14094-11</td><td></td></tr><tr><td>Pinza de patrón estrecho</td><td>F.S.T</td><td>11002-12</td><td></td></tr><tr><td>Pinzas de anillo</td><td>F.S.T</td><td>11106-09</td><td></td></tr><tr><td>Mango del sistema de pinzas para heridas incl. clips</td><td>F.S.T</td><td>12030-01</td><td>para cerrar la piel</td></tr><tr><td>Removedor del sistema de pinzas para heridas</td><td>F.S.T</td><td>12030-04</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio</td><td>Leica</td><td></td> Se <td>han utilizado diferentes modelos</td></tr> <tr><td>Reagents</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1x PBS</td><td>Gibco</td><td>10010-023</td><td></td></tr><tr><td>Antisedan</td><td></td><td></td><td>obtenido del animalario</td></tr><tr><td>Butorfanol</td><td></td><td></td><td>obtenido del animalario</td></tr><tr><td>Medetomidinaclorhidrato</td><td></td><td></td><td>obtenido del animalario</td></tr><tr><td>Midazolam</td><td></td><td></td><td>obtenido del animalario</td></tr><tr><td>100% etanol</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-032-103</td><td></td></tr><tr><td>Pomada ocular</td><td>Takeda</td><td>7242</td><td></td></tr><tr><td>Virus (AAV, AV)</td><td>múltiples proveedores</td><td></td><td>virus utilizado en este protocolo es un</td></tr><tr><td>anticuerpo pAKT</td> de producción interna <td>CST</td><td>4060</td><td>utilizado 1:200 dillution</td></tr><tr><td>GFP anitbody</td><td>CST</td><td>2956</td><td>utilizado 1:100 dillution</td></tr></tbody></table>

virus de la entrega de guías crispr para la próstata murina por alteración del gen

Virus Delivery of CRISPR Guides to the Murine Prostate for Gene Alteration

Con una incidencia creciente del cáncer de próstata, identificación de nuevos controladores de tumor o moduladores es crucial. Modelos de ratón modificados genéticamente (GEMM) para cáncer de próstata se ven obstaculizados por la heterogeneidad del tumor y su dinámica compleja de la microevolución. Modelos de ratón de cáncer de próstata tradicionales incluyen, entre otros, del germline y nocauts condicionales, la expresión transgénica de oncogenes y modelos de xenoinjerto. Generación de mutaciones de novo en estos modelos es complejo, lento y costoso. Además, la mayoría de los modelos tradicionales de destino la mayoría del epitelio prostático, mientras que el cáncer de próstata humano es bien sabido evolucionar como un evento aislado en sólo un pequeño subconjunto de células. Modelos valiosos deben simular no sólo iniciación del cáncer de próstata, pero también la progresión a enfermedad avanzada.
Aquí se describe un método para atacar algunas células en el epitelio de la próstata las células transductoras de partículas virales. La entrega de un virus dirigido a la próstata murina permite la alteración de la expresión génica en el epitelio de la próstata. Cantidad y tipo de virus por este medio definirá el número de células específicas de alteración genética por transducción de algunas células para la iniciación del cáncer y muchas células para la terapia génica. A través de inyección basados en cirugía en el lóbulo anterior, distal de la vía urinaria, el tumor en este modelo puede ampliarse sin deteriorar la función urinaria del animal. Además, dirigiéndose a sólo un subconjunto de células epiteliales prostáticas la técnica permite expansión clonal del tumor y por lo tanto imita la iniciación del tumor humano, progresión, así como invasión a través de la membrana basal.
Esta novedosa técnica ofrece un modelo de cáncer de próstata de gran alcance con mayor relevancia fisiológica. Sufrimiento de los animales es limitado, y ya no cría adicional se requiere, en general animal cuenta se reduce. Al mismo tiempo, se aceleraron el análisis de nuevos genes candidatos y vías, que a su vez es más rentable.

Evaluar la distribución de virus a la próstata murina, analizaron muestras de tres meses después de la cirugía. Rosa26-LSL-Cas9-EGFP ratones12 expresan GFP en células que han sido expuestos a la proteína de Cre expresada por el virus. Las muestras de la próstata fueron examinadas con un microscopio de fluorescencia para identificar áreas con señal de GFP (figura 2A). La señal GFP indica actividad Cre en el epitelio de la próstata pero ...

Este protocolo describe un método nuevo para la entrega del virus a la próstata murina. Usando tecnología CRISPR/Cas9, sobreexpresión del gen o entrega del recombinase de Cre, la técnica permite orthotopic alteración de la expresión génica e implementa un modelo novedoso ratón para cáncer de próstata.

Virus de la entrega de guías CRISPR para la próstata murina por alteración del gen

With an increasing incidence of prostate cancer, identification of new tumor drivers or modulators is crucial. Genetically engineered mouse models (GEMM) ...

El objetivo general de este procedimiento quirúrgico es alterar la expresión génica en la próstata murina mediante la administración viral de guías CRISPR Cas9 para la inducción del cáncer de próstata. Este método puede ayudar a abordar nuevas preguntas en la biología del cáncer de próstata en lo que respecta al análisis y la validación de nuevos genes en un entorno in vivo. Las principales ventajas de esta técnica es que permite la edición genética rápida de múltiples genes al dirigirse solo a un subconjunto de las células prostáticas, como se ve en el escenario humano.Alguien que es nuevo en el procedimiento puede tener dificultades al principio debido al tamaño del órgano y la precisión que se necesita para una finalización quirúrgica exitosa. Para preparar un volumen total de 5 mililitros de anestésico, mezcle 0,15 mililitros de un mg por mililitro de clorhidrato de medetomidina, 0,4 mililitros de 5 mg por mililitro de midazolam y 0,25 mililitros de 10 mg por mililitro de butorfenol. A continuación, añade 4,2 mililitros de agua salina estéril.Para revertir los efectos del clorhidrato de medetomidina después de la cirugía, mezcle 0,1 mililitros de 5 mg por mililitro de atipamezol con 4,9 mililitros de agua salina estéril como antídoto anestésico. Prepare un entorno quirúrgico aséptico mediante la desinfección y esterilización adecuadas y autoclave los instrumentos quirúrgicos. Para administrar el virus a la próstata, después de anestesiar a un ratón macho de ocho semanas de edad de acuerdo con el protocolo de texto; Examine la profundidad anestésica evaluando la relajación muscular, el retiro del pedal y los reflejos palpables.Cuando se observe pérdida de reflejos, afeitar la parte inferior del abdomen del animal. Con un hisopo de algodón estéril, cubra cuidadosamente los ojos del animal con ungüento oftálmico veterinario para prevenir la ceguera causada por la xeroftalmia. Luego, use 70% de etanol y 10% de yodo de providona para limpiar el abdomen afeitado y desinfectar el área quirúrgica.A continuación, con unas tijeras quirúrgicas estériles, realice una incisión vertical de aproximadamente un centímetro en la piel en la línea media abdominal baja. Luego, con una pinza de punta fina, levante el peritoneo para evitar dañar los órganos que se encuentran debajo; y usar tijeras quirúrgicas para hacer cuidadosamente una incisión de ocho milímetros o menos a través del peritoneo. Mueva suavemente el tejido graso a un lado para descubrir la vesícula seminal.Luego, con una pinza de anillo, levante con cuidado la vesícula seminal hasta que se pueda identificar la próstata anterior. Ahora, con una jeringa de insulina de 0,5 mililitros y una aguja de calibre 30 de 8 milímetros; Inyectar un volumen total de 30 microlitros de solución viral en el epitelio prostático anterior. Minimice las fugas y asegúrese de que el líquido se absorba dentro del tejido, formando una pequeña burbuja.A continuación, vuelva a colocar la vesícula seminal en la cavidad abdominal. Para asegurarse de que el líquido se absorba dentro del tejido en una pequeña burbuja y sin fugas, asegúrese de inyectar en paralelo a la vesícula seminal y siguiendo la forma del lóbulo prostático anterior. Con una aguja de punta cónica y un círculo de 3/8 de 13 milímetros, sutura el perineo con dos o tres puntos interrumpidos simples de sutura absorbible 6-0.Luego, levantar la piel con pinzas para evitar dañar el peritoneo; Engrapa la piel con tres clips estériles de 4,8 por 6,5 milímetros. Para una mejor recuperación después de la cirugía, use una jeringa estéril de 1 mililitro y una aguja de calibre 27 por 1/2 pulgada para administrar el antídoto anestésico en una dosis de 0.1 mililitros por gramo de peso corporal mediante inyección intraperitoneal. Luego, vuelva a colocar al animal con cuidado en su jaula.Mantenga la jaula sobre una almohadilla térmica durante una hora después del procedimiento para prevenir la hipotermia hasta que se recupere por completo. El animal debe despertarse unos minutos después de la inyección. Continúe monitoreando y tratando al animal diariamente de acuerdo con el protocolo de texto.Y, cuando la herida se haya cerrado, retire las pinzas cutáneas. Para evaluar la entrega del virus a la próstata murina, las muestras se analizaron tres meses después de la cirugía. Como se muestra aquí, los ratones utilizados en este estudio expresaron GFP en células que han sido expuestas a la proteína Cree expresada por el virus.La señal GFP muestra la actividad de Cree en el epitelio prostático, pero no si la edición génica ha sido inducida por la guía CRISPR. Estas secciones inmunohistoquímicas identifican áreas focales de células con altas expresiones de pAKT, lo que indica pérdida de P10. En estos paneles, el uso de pAKT y GFP identificó células dobles positivas, lo que confirmó la transformación de las células prostáticas por el virus adenoasociado.En general, estos resultados muestran que in vivo, la edición del gen CRISPR-Cas9 se puede realizar en el epitelio prostático utilizando el ratón Rosa26-LSL-Cas9-EGFP y el virus adenoasociado. Una vez dominado, el procedimiento se puede realizar en 15 minutos. Esta técnica allanó el camino para la investigación en el campo del cáncer de próstata para examinar múltiples genes con simultáneos in vivo.Después de ver este video, debe tener una buena comprensión de cómo administrar sustrato a la próstata murina. No hay que olvidar que cuando se trabaja con algunos virus puede ser extremadamente peligroso y siempre se deben tomar precauciones al realizar estos procedimientos.

virus-delivery-crispr-guides-to-murine-prostate-for-gene

Research

Investigación

JoVE Journal

Cancer Research

Investigación del cáncer

Este video describe un método para editar genes específicos en células de la glándula prostática utilizando un sistema de administración basado en adenovirus. El enfoque permite la alteración ortotópica y localizada de la expresión génica utilizando la tecnología CRISPR para desarrollar nuevos modelos de ratón para el cáncer de próstata.

Modelado del cáncer de próstata en modelos de ratón modificados genéticamente: una técnica de edición de genes localizados mediada por CRISPR/Cas9 en células del lóbulo anterior de la próstata de ratón

El sistema / Cas9 CRISPR ofrece el potencial para que la edición del genoma específico accesible y asequible para la comunidad científica. Este protocolo está destinado a demostrar cómo crear virus que Knockout un gen de interés utilizando el sistema / Cas9 CRISPR y, a continuación, inyectarlos estereotáxica en el cerebro del ratón adulto.

Proyectos, Embalaje y Entrega de alto título de CRISPR Retro y lentivirus vía estereotáxica Inyección

Un protocolo para rápido CRISPR/Cas9-mediado interrupción de genes en ratón y células hematopoyéticas primarias humanas se describe en este artículo. Cas9 sgRNA ribonucleoproteínas se introducen a través de electroporación con sgRNAs generado a través de transcripción en vitro y Cas9 comercial. Alta eficiencia edición se logra con tiempo limitado y costos financieros.

Interrupción génica altamente eficiente de las células progenitoras hematopoyéticas murinas y humanas por CRISPR/Cas9

El objetivo de este protocolo es demostrar la inyección intra prostática de las células de cáncer de próstata, con la posterior castración. Modelos preclínicos ortotópico de cáncer de próstata andrógeno-dependiente y resistente a la castración son críticos para el estudio de la enfermedad en el contexto de un microambiente tumoral clínicamente relevante y un anfitrión inmunocompetente.

Un modelo murino Syngeneic bioluminiscente y fluorescente ortotópico de cáncer de próstata andrógeno-dependiente y resistente a la castración

Aquí proporcionamos un protocolo detallado para llevar a cabo en vivo gene cardiaco edición en ratones usando Virus de Adeno-Associated recombinante (rAAV)-mediado entrega de CRISPR. Este protocolo ofrece una estrategia terapéutica prometedora para tratar cardiomiopatía distrófica en distrofia muscular de Duchenne y puede utilizarse para generar nocaut cardiaco específico en los ratones postnatales.

Entrega de mediada por Virus adeno-asociado de CRISPR para Gene cardiaco en ratones

Se describe un método novedoso para la entrega de plásmido de DNA en las células uroteliales del ratón vejiga en vivo a través de la cateterización de la uretra y electroporación. Ofrece una manera rápida y conveniente para la generación de modelos de ratón autóctonas de enfermedades de la vejiga.

Novedoso método de plásmido ADN entrega al urotelio de la vejiga de ratón por electroporación

Aquí describimos una metodología de detección CRISPR/Cas9 rápida y directa in vivo utilizando inyecciones lentivirales embrionarias de tero guiadas por ultrasonido para evaluar simultáneamente las funciones de varios genes en la piel y la cavidad oral de ratones inmunocompetentntes.

In Vivo CRISPR/Cas9 Screening para evaluar simultáneamente la función génica en la piel del ratón y la cavidad oral

El presente protocolo describe una única mutación M213L en Gja1 que conserva la generación completa de Connexin43 pero evita la traducción de la isoforma GJA1-20k traducida internamente más pequeña.

Eliminación de un sitio de inicio traslacional interno del ARNm mientras se conserva la expresión de la proteína de longitud completa

Este protocolo describe un flujo de trabajo de edición de genes de repeticiones palindrómicas cortas (CRISPR) agrupadas regularmente interespaciadas de alto rendimiento para el análisis de redes de clústeres de microARN que permite la generación rápida de un panel de líneas celulares modificadas genéticamente que llevan combinaciones únicas de eliminación de miembros de grupos de miRNA de hasta 35 kb dentro de un solo experimento.

Herramienta de edición de genes CRISPR para el análisis de redes de clústeres de microARN

Aquí, describimos una técnica simple destinada a la generación eficiente de ratones genéticamente modificados llamada CRISPR RNP Electroporación de Cigotos (CRISPR-EZ). Este método proporciona reactivos de edición por electroporación en embriones con una eficiencia cercana al 100%. Este protocolo es efectivo para mutaciones puntuales, pequeñas inserciones genómicas y deleciones en embriones de mamíferos.

Edición eficiente del genoma de ratones mediante electroporación CRISPR de cigotos

Presentamos un protocolo para la transducción retroviral de ARN guía en células T primarias de ratones transgénicos Cas9, proporcionando una alternativa eficiente para la edición de genes en el estudio de la diferenciación Th17.

Segmentación génica retroviral mediada por CRISPR/Cas9 para el estudio de la diferenciación de Th17 in vitro

Aprenda a realizar edición génica en la próstata murina mediante entrega viral de guías CRISPR/Cas9. Este método permite alterar la expresión génica ortotópicamente y estudiar el cáncer de próstata in vivo.

Virus de la entrega de guías CRISPR para la próstata murina por alteración del gen

Explorar más videos