Name: Ex útero Electroporación y culturas Organotypic rebanada de cerebros embrionarios de ratón para vivir-la proyección de imagen de interneuronas GABAérgicas de migrando (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-04-20T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 50 s
Description: Aprende a visualizar interneuronas GABAérgicas en migración mediante electroporación ex útero y cultivos de rebanadas organotípicas de cerebro embrionario de ratón. Este método de bajo costo permite estudiar el desarrollo neuronal y trastornos del neurodesarrollo.

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Este trabajo fue apoyado por subvenciones de la Fundación de Saboya y la Fundación de epilepsia de la curación de funcionamiento y por el equipo de becas de la Fundación Canadiense para la innovación E.R (microscopio confocal) y G.H (microscopio confocal de disco de spinning). E.R. recibe un premio de carrera de la Fonds de recherche du Québec-Santé (FRQ-S; Premio clinician-Scientist) así como de los institutos canadienses de investigación en salud (CIHR; Premio al investigador joven). G.H. es un erudito principal del FRQ-S. L.E es el destinatario del Premio Steriade Saboya posdoctoral de la Fundación de Saboya, la formación postdoctoral CHU Sainte-Justine Fundación y el Premio de formación postdoctoral FRQ-S, en colaboración con la Fundación de las estrellas. Este proyecto ha sido posible por el Canadá de cerebro a través del fondo de investigación cerebral de Canadá, con el apoyo financiero de Canadá de la salud, otorgado a L.E.

Todos los experimentos con animales fueron aprobados por el Comité Institutionnel des Bonnes Pratiques avec les Animaux de Recherche (CIBPAR) en el centro de investigación de CHU Sainte-Justine y fueron conducidos de acuerdo con el Consejo Canadiense sobre guía de cuidado de animales el cuidado y uso de animales de experimentación (Ed. 2).
El protocolo descrito aquí fue optimizado para la electroporación de embriones en el día embrionario (e) 13.5, a la vez cuando INs derivados de MGE activamente generados, antes de la deriva máxima de CGE INs producción45,46. Además, para sesgar la electroporación hacia INs GABAérgico, utilizamos un promotor expresado selectivamente en el INs (por ejemplo, el promotor de Dlx5/6 con su potenciador mínimo)47.
1. preparación de soluciones para electroporación y culturas Organotypic rebanada
<ol><li>Preparar 125 mL de medio de cultivo estéril.<ol>
<li>Medir 125 mL regular neurona-específica del medio de cultivo (véase Tabla de materiales para la formulación) en una botella esterilizada en un gabinete de bioseguridad UV-esterilizado previamente rociado con etanol al 70%. Añadir 2.25 mL de 50 x suplemento libre de suero enolase, 1,75 mL de glutamina 200mM (concentración final de 0,5 mM) y 6,25 mL de suero de caballo inactivado con calor previamente alícuotas bajo condiciones estériles. Mezclar bien, alícuota de 15 mL tubos cónicos estériles y almacenar a 4 ° C. Nota: Medio de cultivo preparado puede almacenarse hasta por 3 semanas a 4 ° C.</li>
		<li>Dividir 100 X solución de N-2 formulación48 de Botteinstein 150 alícuotas μl bajo condiciones estériles y congelar a-20 ° C hasta su uso.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Preparar 1 L de líquido cefalorraquídeo artificial estéril (ACSF).<ol>
<li>Medir 800 mL de agua destilada en un vaso de precipitados de 1 L. Añadir 25,67 g de sacarosa, 5,08 g de cloruro de sodio (NaCl), 2,18 g de bicarbonato de sodio (NaHCO3), 1,80 g de glucosa, 0,19 g de cloruro de potasio (KCl), 0.15 g de fosfato monobásico de sodio anhidro (NaH2PO4), 1 mL de 1 M stock CaCl2 .2 h2O y 2 mL de 1 M stock MgSO4.7H2O. remover para disolver a temperatura ambiente. Añadir agua destilada hasta alcanzar un volumen total de 1 L.</li>
		<li>Usa un filtro de 0,22 μm, filtrar la solución en un frasco estéril en un gabinete de bioseguridad esterilizar y almacenar a 4 ° C durante 1 mes.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Preparar una solución fresca de agarosa al 4% en ACSF antes de cada experimento.<ol>
<li>Medir 25 mL de la ACSF previamente preparado en un tubo cónico estéril de 50 mL y añadir 1 g de agarosa de punto de bajo punto de fusión.</li>
		<li>Calor de 45 s en un horno de microondas. Para evitar derrames, interrumpir la calefacción cada 3-4 s cuando la ebullición comienza, abrir el tubo para que la presión hacia fuera, vuelva a cerrar y agitar manualmente para mezclar la agarosa. Repita hasta que la solución de agarosa es homogénea. Mantener la solución de agarosa a 42 ° C durante el resto del experimento para evitar la solidificación. Nota: Las temperaturas más elevadas dañará los tejidos del cerebro.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. preparación de plásmidos para la inyección
<ol><li>Tire una pipeta de microinyección de vidrio<ol>
<li>Establezca el tirador de la micropipeta con los parámetros apropiados, garantizar el capilar de vidrio en el espacio proporcionado y asegúrese de que esté centrado con el filamento.</li>
		<li>Presione el botón de extracción.</li>
		<li>Retire cuidadosamente las pipetas de microinyección recién hecha desde el extractor de calor y el lugar en un cuadro o caja de Petri limpia hasta su uso posterior para evitar dañar la punta.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Configuración la seguridad de la biotecnología con todos los instrumentos necesarios para esto experimentar (ver figura 1A), rocíe generosamente todos los instrumentos en el gabinete de seguridad de la biotecnología con etanol al 70% y esterilizar los instrumentos y el medio ambiente con la luz UV durante 15-20 min.</li>
	<li>Durante la etapa de esterilización, descongelar plásmidos en hielo (4 ° C).</li>
	<li>Medir 10 μl del plásmido de una solución stock (4 μg/μl) en un tubo de centrífuga limpio de 1,5 mL. Añadir el 0.01% de verde rápido FCF. Mezclar suavemente, hacer girar brevemente y no en hielo hasta su uso. Nota: Maxi-prep DNA debe estar preparado según protocolo del fabricante usando un kit libre de endotoxina maxi-prep. ADN puede ser solubilizado en buffer TE, o libre de nucleasa H2O y la preparación del plásmido con tinte solución puede, pero no no tiene que ser realizada bajo condiciones estériles. Plásmidos de Maxi-prep deben ser alícuotas para evitar múltiples ciclos de hielo-deshielo. Plásmidos alícuotas no se deben mezclar con el tinte más 2 h antes de su uso y no se deben congelar para su uso posterior.</li>
	<li>Después de la esterilización, preparar el inyector de nano como sigue.<ol>
<li>Elija uno de la pipeta de microinyección de vidrio preparadas previamente almacenada en una caja limpia o placa de Petri y uso pinzas pequeñas para cortar la punta de la pipeta en forma biselada para alcanzar un diámetro exterior de aproximadamente 15 μm. Nota: El diámetro externo dado aquí es una medida aproximada para dar al usuario una idea de lo que usamos en nuestros experimentos y se ha optimizado para facilitar la perforación del cráneo para la inyección de plásmidos sin dañar el cerebro, permitiendo al fluido carga y liberación de la DNA. El diámetro exterior puede medirse observando el corte punta de la pipeta de microinyección de vidrio apposed a una barra de escala micrométrica bajo un microscopio de campo brillante.</li>
		<li>Utilice una jeringa para llenar la micropipeta con aceite mineral de su unpulled extremo (para expulsar todo el aire).</li>
		<li>Inserte la micropipeta de vidrio lleno en el nano-inyector siguiendo las instrucciones del fabricante.</li>
		<li>Vacío 2/3rds de la micropipeta de vidrio (manteniendo suficiente aceite para evitar la entrada de aire).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Cuidadosamente insertar la micropipeta dispuesta en el tubo que contiene la solución de plásmido/tinte y llene la micropipeta de vidrio con la solución de plásmido/tinte.</li>
</ol>3. recolección de embriones de ratón de hembras preñadas
<ol><li>Supervisar diariamente las hembras de cría a evaluar para el taponamiento vaginal, preferiblemente al mismo tiempo todos los días (mediodía). Día e0.5 corresponde al primer día, cuando se observa un tapón vaginal. Nota: Los experimentos descritos aquí se pueden realizar en ratones de tipo salvaje. Sin embargo, para facilitar la identificación de la MGE y etiquetar todos INs GABAérgico (o subconjuntos específicos como INs MGE-derivado), animales transgénicos se pueden utilizar (por ejemplo: GAD67EGFP; Dlx5/6Cre con un alelo de Cre-reportero, etc.47,49). En esta situación, el plásmido experimental inyectado debe expresar otro fluoróforo (por ejemplo mCherry o TdTomato) para permitir la visualización de los INs transfected (amarillo) que puede ser comparado con no transfectadas in (verde).</li>
	<li>La mujer en el día embrionario e13.5, de sacrificio por dislocación del cuello. Nota: Los agentes anestésicos en el momento del sacrificio pueden afectar en la migración y la supervivencia50,51 y deben evitarse.</li>
	<li>Recoger embriones por cesárea como sigue.<ol>
<li>Rocíe generosamente el abdomen femenino con etanol al 70%. Levante la piel del abdomen con un par de pinzas esterilizadas y con la otra mano, utilice tijeras quirúrgicas esterilizadas para cortar la piel del abdomen.</li>
		<li>Con un segundo par de pinzas esterilizadas y tijeras, tire de la fascia abdominal y cortarlo evitando cuidadosamente el útero.</li>
		<li>Con un tercer par de pinzas esterilizadas y tijeras, tire de los cuernos uterinos y cortar fuera de la cavidad pélvica. Colocar los cuernos uterinos disecados en un plato de petri 60 mm estéril llenado de nervios basado en el medio de cultivo suplementado con aminoácidos, vitaminas y sales inorgánicas (véase Tabla de materiales para productos comercialmente disponibles).</li>
	</ol>
</li>
	<li>En un gabinete de bioseguridad estéril, usar dos pares de Pinzas finas (una en cada mano) para diseccionar los embriones de la placenta y aislar las cabezas por decapitación.</li>
	<li>Corte de bisel la punta de una pipeta de transferencia plástica estéril 3 mL, aspirar las cabezas y transferencia en una nueva placa de petri estéril 60 mm capas con cera negra solidificada y llena con la misma base de nervios suplido medio de cultivo como el anterior. Nota: Este paso minimiza a la transferencia de contaminantes (pelo de ratón, sangre). La cera negra se utiliza para estabilizar la cabeza durante la disección. Medios de cultivo no necesita ser oxigenada durante estos procedimientos.</li>
</ol>4. intraventricular plásmido inyecciones y electroporación Ex Vivo de la MGE
Nota: Los pasos siguientes deben realizarse en condiciones estériles en el gabinete de bioseguridad previamente preparado.
<ol><li>Capas de lugar el plato de petri de 60 mm con cera negra y que contiene las cabezas decapitadas en neural basado suplido medio de cultivo con los prismáticos en el gabinete de seguridad de la biotecnología.</li>
	<li>Estabilizar la cabeza, la parte rostral hacia la derecha, con las pinzas finas con la mano izquierda y use el inyector de nano en la mano derecha para inyectar 1-2 μl de la solución de plásmido/tinte de ventrículo lateral derecho. Nota: Pueden ser experiencias de coexpresión realizado por co-electroporating un plásmido de rescate y un plásmido del shRNA-expresión mezclando ambos plásmidos en concentraciones equimolares.</li>
	<li>Electroporate el cerebro inyectado.<ol>
<li>Coloque la cabeza entre los electrodos con el electrodo negativo situado dorsalmente y paralelo a la cabeza y el electrodo positivo hacia el lado ventral de la cabeza para apuntar el MGE.</li>
		<li>Una vez que los electrodos están bien posicionados, entregar 4 pulsos cuadrados de 40 V de 50 ms a ms 500 pulsos entre intervalos.</li>
		<li>Quitar cualquier tejido residual de los electrodos mediante pinzas ya colocadas en la bioseguridad gabinete. Nota: Estos parámetros se han optimizado específicamente para la electroporator utilizado en nuestros experimentos. Recomendamos que los usuarios realizan pruebas optimizando previamente si se utiliza un tipo diferente de electroporator.</li>
		<li>Repita los pasos 4.1 a 4.3 para todos los cerebros restantes. Nota: Aunque este protocolo describe las manipulaciones necesarias para un cerebro, es posible inyectar hasta 4 cerebros secuencialmente antes de electroporating cada cerebro, aumentando así el rendimiento. Esta estrategia es especialmente ventajosa cuando 2 o más diferentes plásmidos se inyectan secuencialmente (control o experimental plásmido) durante el mismo experimento (permitiendo comparación entre hermanos de camada). Además, es posible inyectar y electroporate simultáneamente ambos lados del cerebro para aumentar el rendimiento, colocando los electrodos completamente paralelo a la superficie del cerebro.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. disección y culturas Organotypic rebanada del cerebro
<ol><li>Mientras manipula aún en el ambiente estéril de la gabinete de bioseguridad, diseccionar el cerebro fuera del cráneo.<ol>
<li>Estabilizar la cabeza en la capa de cera negra insertando una aguja en cada ojo evitando cuidadosamente el cerebro.</li>
		<li>Use un par de Pinzas finas para sostener el lado izquierdo del cuello y un segundo par de Pinzas finas para rasgar la piel del cráneo, de atrás hacia delante.</li>
		<li>Manteniendo la cabeza lateralmente con las pinzas en una mano, utilice otro par de pinzas en la otra mano para cortar con cuidado el cráneo a nivel del tronco encefálico y tire suavemente el cráneo hacia arriba. Con cada pinza, corte del cráneo en el plano sagital (línea media) hacia el frente y luego incidir lateralmente para liberar a los fragmentos de cráneo.</li>
		<li>Levante el tronco del encéfalo y corte cuidadosamente las meninges y nervios craneales hasta el cerebro está completamente fuera del cráneo. Nota: Todos los pasos descritos en 5.1 deben realizarse bajo estrictas condiciones de esterilidad en un gabinete de bioseguridad.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Incrustar el cerebro en 4% agarosa de punto de bajo punto de fusión para seccionamiento.<ol>
<li>Llenar un plato de petri de 35 mm con la solución de agarosa preparada anteriormente (mantenerse líquido a 42 ° C).</li>
		<li>Transferir rápidamente un cerebro de electroporated al plato lleno de agarosa utilizando la pipeta de transferencia anteriormente cortado. Mantener el plato a temperatura ambiente.</li>
		<li>Revuelva la agarosa con un palo de metal para mantener el cerebro en el medio del pozo (para evitar el hundimiento) y colocar el cerebro en un rostro caudal plano paralelo al plato. Dejar de revolver cuando la agarosa se solidifique, para evitar cualquier daño de cerebro.</li>
		<li>Utilice una cuchilla de afeitar para cortar la agarosa que rodean el cerebro para formar un bloque rectangular, dejando un margen de 1-2 milímetros alrededor del cerebro. Asegúrese de que la parte rostral del cerebro es perpendicular al límite anterior del bloque para facilitar la orientación para los pasos posteriores de seccionamiento.</li>
		<li>Repita para cada cerebro. Nota: Es posible cortar más de un cerebro a la vez (máximo 3) formando bloques de agarosa separado mientras cada cerebro en distintas alturas.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Secciones coronales de vibratome y sector cultura.<ol>
<li>Descongelar una alícuota de 100 X N-2 suplemento (150 μL) en el hielo y añadir al medio de cultivo alícuotas de 15 mL en condiciones estériles.</li>
		<li>Transferencia de 750 μl del medio de cultivo (con suplemento de X N2 1) en cada pocillo de una placa de cultivo de 6 pozos.</li>
		<li>Con una pinza curva, coloque una célula cultura (diámetro de 30 mm, 0,4 μm de tamaño de poro, PTFE) en cada bien llenas de medio.</li>
		<li>Llene el baño vibratome con ACSF continuamente oxigenada. Enfriar a 4 ° C con hielo alrededor de la bañera, o utilizar un vibratome refrigerado.</li>
		<li>Ajustar la velocidad de vibratome a 0.150 mm/s y la frecuencia de 80 hertzios.</li>
		<li>Pegar el bloque de agarosa en la plataforma de vibratome, borde rostral hacia abajo y ventral borde frente al usuario.</li>
		<li>Cortar el cerebro en secciones coronales para obtener 250 μm de espesor secciones (a 4 ° C).</li>
		<li>Con espátulas estériles, recoger secciones de 2-3 que contiene el MGE y lugar insertar todas las secciones del cerebro de un animal en una sola membrana de 30 mm, evitando cuidadosamente la superposición entre las secciones. Coloque el inserto en un pozo de una placa de cultivo de 6 pozos (contiene 750 μl de medio de cultivo suplementado, como se describe anteriormente). Por otra parte, cada sección puede colocarse en una membrana independiente de 13 mm de diámetro en una placa de cultivo de 12-bien llenada con medio de cultivo de 500 μl suplido. La cantidad de medio de cultivo recomendado para cada pozo permite que las secciones del cerebro ser alimentado por los medios de comunicación sin ser sumergido. Nota: Los pasos descritos en 5.3.6 y 5.3.7 no llevan a cabo bajo condiciones de esterilidad completadas, a menos que el vibratome puede ser esterilizado y usado en un gabinete de bioseguridad. Por lo tanto, es crucial para llevar a cabo estos pasos con cuidado para evitar cualquier contaminación. Equipo de protección adecuado (mascarilla limpia, guantes quirúrgicos y bata de laboratorio) se debe usar en todo momento y partes del cuerpo, incluso cubiertas, tales como pelo, cara y manos, nunca debe pasar por placas (con o sin medio de cultivo). También se recomienda rociar etanol al 70% con frecuencia en los guantes y espátulas que se utiliza para recoger las secciones de la cerebral.</li>
		<li>Coloque la placa de cultivo en una ventilado incubadora estéril a 37 ° C con 60% humedad y 5% CO2 para 48 o 72 h. Nota: Estos tiempos de incubación fueron optimizados para la proyección de imagen de Time-lapse de INs derivados de MGE y proyección de imagen confocal de rodajas fijas, respectivamente. Tiempos de incubación óptimo deben analizarse previamente para cada diseño experimental. Además, si la incubación elegida es de 72 h y bajo, es necesario cambiar el medio de cultivo. Tiempos más largos de incubación, el medio de cultivo debe cambiarse cada 2-3 días.</li>
		<li>Después de la hora deseada de la incubación, transferir las secciones de interés a un cubreobjetos de 8 cámaras y añadir 3-5 μl de medio de cultivo. Lugar el cubreobjetos en una cámara ambiental (37 ° C, 60% de humedad, 5% CO2) conectado a un invertido de giro confocal de disco equipado con un software de adquisición informática para instalar la sesión Time-lapse de imágenes. Nota: Como alternativa, las secciones se pueden fijar con paraformaldehído al 4% (durante la noche a 4 ° C o 2 h a temperatura ambiente) y posteriormente immunostained con anticuerpos diferentes para la visualización de las características morfológicas del electroporated INs bajo un confocal microscopio. Aunque eGFP y mCherry pueden visualizarse por microscopía confocal sin ningún procedimiento contra manchas, se recomienda realizar inmunohistoquímica contra GFP y mCherry para mejorar la señal ya que el proceso de fijación puede reducir la fluorescencia, reduciendo la detección de los componentes más finos de neuronas embrionarias, como pequeñas ramas en los procesos principales o finales.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

Los autores no tienen nada que revelar. Las opiniones aquí expresadas no necesariamente representan las opiniones de la Ministra de salud o el gobierno de Canadá.

En este artículo, nos proporcionan un método confiable para realizar ex útero electroporación del ratón MGE en e13.5 y para la generación de culturas organotypic de rebanadas del cerebro embrionario. Aunque en vitro métodos, tales como el análisis de la cámara de Boyden, son relativamente fáciles de realizar y pueden utilizarse para evaluar los roles específicos de diferentes genes y proteínas sin la interferencia de otros factores, impide la investigación de IN dinámica de migración con respecto a la d...

Interneuronas GABAérgicas corticales (INs) son diversos en cuanto a sus propiedades bioquímicas, propiedades fisiológicas y conectividad, y median diversas funciones en redes maduro1,2,3 ,4,5. La especificación de subtipos diferentes de INs cortical es estrictamente regulada a través de cascadas genéticas que han sido extensivamente estudiados1,2. La mayoría (70%) de los INs GABAérgicas corticales origina de progenitores en la eminencia ganglionar medial (MGE), una estructura embrionaria ubicada ventralmente y debe migrar a través de distancias relativamente largas para llegar a la placa cortical1, 2 , 6. mientras que las células piramidales corticales migran radialmente desde la zona ventricular (VZ) a la placa cortical a lo largo del andamio de la glia radial, la migración tangencial del INs, que no están vinculados a estos andamios, requiere una variedad de intrínseca y señales extrínsecas para atraer las neuronas migrantes hacia la placa cortical, al mismo tiempo guiándolos lejos de estructuras no corticales2,7,8. Después de salir del ciclo celular, INs son repelidos de la MGE por quimio-repulsivo señales expresadas en VZ de MGE, que desencadena la migración tangencial a la placa cortical9,10. Migración de INs evitar el estriado con la ayuda de diferentes señales repulsivas11 y, después de llegar a la placa cortical, cambia de una tangencial a una migración radial y llegar a su posición final laminar, en parte en respuesta a señales del piramidal las células de12 y otras poblaciones celulares13. La migración de los INs, en cuanto a otras poblaciones neuronales, implica varios cambios morfológicos dinámicos para permitir el movimiento real de la neurona. Este supuesto locomoción neuronal se caracteriza por ciclos repetitivos de tres pasos sucesivos: el alargamiento de un proceso principal, un movimiento activo anterograde del núcleo (nucleokinesis) y la retracción del proceso final14. EN migración está regulada por numerosas señales intrínsecas y extrínsecas que la ramificación y la remodelación activa del proceso principal para guiar el INs en la dirección correcta, determinar la orientación y la velocidad de migración14,15 ,16.
Los determinantes de regulación cortical en la migración se han estudiado ampliamente en los últimos años1,2,7,17,18,19,20 y alteración en algunos de estos agentes moleculares se ha postulado para dar lugar a trastornos del neurodesarrollo, como el pediátrico refractaria epilepsia o Autismo espectro trastornos1,2,21, 22 , 23 , 24. por lo tanto, el desarrollo de diversos enfoques in vitro e in vivo se ha seguido para impulsar significativamente nuestra capacidad para el estudio de este proceso dinámico, como previamente ha25. Los métodos in vitro , incluyendo el análisis de la cámara de Boyden y el análisis de la elección de raya, proporcionan el medio más rápido y más reproducible de evaluación del requisito e impacto célula Autónoma de proteínas o genes específicos durante la migración neuronal, sin la influencia de otros factores25. Estos ensayos son particularmente útiles cuando se combinan con imágenes en vivo8,26,27. Con estas técnicas, son fácilmente Obtenido de e13.5 MGE y aislado por la disociación enzimática y mecánica, después de que se pueden investigar diferentes vías de señalización y señales de orientación, como se ilustra anteriormente8,28 . Sin embargo, estos ensayos tienen lugar en una matriz extracelular artificial en la ausencia de la arquitectura tridimensional del tejido, que puede modificar propiedades de comportamiento y de la célula neuronales, afectando potencialmente a migración y supervivencia de la célula25. Para evitar estas limitaciones, los explantes MGE ex vivo se han desarrollado como una herramienta alternativa para cuantificar los dinámicos cambios morfológicos que ocurren durante la migración junto con parámetros como la velocidad y orientación14, 29. Generación de MGE explantes es relativamente sencilla y ha sido ampliamente descrito en otra parte30. Implica la chapa de un pequeño extracto de la MGE en una monocapa de células corticales mixtas o en una mezcla de matrigel y colágeno en presencia de señales atractivo o repulsivo25, siendo este último opcional31. MGE explantes permiten alta resolución imágenes de células escasamente marcadas, simplificar el estudio de los procesos intracelulares, como remodelación citoesqueleto durante proceso principales de ramificación, como se mostró anteriormente32,33 ,34 y en el presente estudio. Explantes MGE se han utilizado con éxito para evaluar cambios dinámicos del citoesqueleto durante la migración en un entorno 2D, por ejemplo después de manipulaciones farmacológicas o quimiotácticas específicas (véase, por ejemplo, Tielens et al 201633) . Sin embargo, con este enfoque, INs migran dentro de una matriz artificial, y esto podría alterar en comportamiento y la reproducibilidad y el significado de los resultados experimentales.
Por el contrario, en el útero la electroporación permite la manipulación genética de los INs en su ambiente nativo y es un método ampliamente usado para evaluar rápida y eficientemente el impacto de la ganancia y pérdida de función del gen mientras que eludir las limitaciones de golpe de gracia costosa y desperdiciadora de tiempo y knock-in estrategias25,35. Electroporación en el útero puede ser inclinada hacia en progenitores mediante el uso de promotores específicos de tipo celular y colocando los electrodos hacia las estructuras ventromedial, incluyendo el MGE36. Además, en el útero la electroporación permite la oportuna expresión de construcciones experimentales en 1-2 días, en comparación con el 7-10 días necesarios para la construcción de expresión utilizando viral vectores25. Sin embargo, en el útero la electroporación de en progenitores tiende a ser bajo rendimiento. De hecho, si bien progenitores de células piramidales en la zona ventricular dorsal pueden ser transfectadas eficientemente usando en el útero electroporación, dirigidas a las estructuras más ventral situadas, como el MGE, es más técnicamente difícil, especialmente en pequeños e13.5 embriones y la alta tasa de letalidad embrionaria más reduce el rendimiento experimental25.
Para eludir algunas de las limitaciones técnicas asociadas con in vitro MGE presentaron experimentos y electroporación en vivo en el útero , ex vivo organotypic rebanada culturas se han desarrollado8,37, 38,39. Cerebro organotypic rebanada culturas ofrecen la ventaja de la mímica en vivo de las condiciones, mientras que siendo menos costosos y desperdiciadores de tiempo de modelos de animales genera25. De hecho, estas preparaciones permiten un acceso fácil a la MGE, junto con la visualización específica del INs y pueden combinarse con electroporación focal para investigar vías moleculares específicas en INs migración en medio ambiente más fisiológico8 , 39 , 40 , 41. por lo tanto, hemos optimizado una aproximación por organotypic culturas38, que combinamos con electroporación ex utero y la proyección de imagen confocal Time-lapse, para evaluar el proceso morfológico y dinámico que ocurre durante la migración tangencial de MGE-INs. El presente Protocolo fue adaptado y optimizado de otros que han usado ex útero o en el útero cerebro electroporación organotypic rebanada culturas y estudiar la migración de las células piramidales42,43 y cortical INs36,39,44. Específicamente, embriones de ratón son decapitados y el MGE es electroporated ex vivo después de la inyección intraventricular de la plásmidos experimental, lo que permite más eficiente y precisa selección de progenitores MGE que lo que puede lograrse con electroporación en el útero . Luego se extraen los cerebros y seccionado en rebanadas coronales todo el cerebro que pueden ser cultivados por unos pocos días, lo que permite la continua seguimiento y proyección de imagen de transfected INs. Este enfoque etiquetas típicamente 5-20 INs migración tangencial por rebanada del cerebro, minimizando el número de iteraciones experimentales necesaria para alcanzar significación estadística, mientras etiquetado una población neuronal lo suficientemente escasa para asegurar la fácil separación de neuronas individuales para la reconstrucción y evaluación morfológica fina. Además, en comparación con explantes MGE, culturas organotypic aseguran que migrar INs están expuestos a un ambiente más natural, incluyendo entradas de aferentes talámicos y quimiocinas secretadas localmente. Este enfoque es apropiado para cuantificar la direccionalidad y la ruta migratoria adoptada por INs transfected, ofreciendo información anatómica suficiente para permitir la caracterización de procesos dinámicos más finos como principal proceso de ramificación, nucleokinesis y al final proceso de retracción.

<table><tbody><tr><td>Medio neurobasal</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>21103049</td><td>Medio de cultivo específico de neuronas disponible comercialmente. Formulación completa disponible en este sitio web: https://www.thermofisher.com/ca/en/home/technical-resources/media-formulation.251.html</td></tr><tr><td>B-27 Suplemento sin suero</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>17504044</td><td>50X Suplemento específico para neuronas sin suero</td></tr><tr><td>15 mL tubos de centrífuga estériles</td><td>Sarstedt</td><td>62.554.002</td><td></td></tr><tr><td>Leibovitz's (1X) L-15 Medio (+ L-Glutamina)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>11415064</td><td>Medio de cultivo neural disponible en el mercado complementado con aminoácidos, vitaminas y sales inorgánicas. Formulación completa disponible en el sitio web del distribuidor&nbsp;</td></tr><tr><td>L-Glutamina</td><td>Invitrogen</td><td>25030-081</td><td></td></tr><tr><td>Suero de caballo, inactivado por calor</td><td>Millipore-Sigma</td><td>H1138-500ML</td><td></td></tr><tr><td>Suplemento Neurocell N-2 100X</td><td>Wisent</td><td>305-016</td><td>Formulación N-2 de Botteinstein</td></tr><tr><td>Botellas de medios de PETG cuadradas VWR 125 mL</td><td>VWR</td><td>89132-062</td><td></td></tr><tr><td>Clase II Tipo A Gabinete de bioseguridad</td><td>Nuaire</td><td>NU-540</td><td></td></tr><tr><td>Sacarosa</td><td>BioShop</td><td>SUC700.1</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro de sodio</td><td>BioShop</td><td>SOD001.1</td><td></td></tr><tr><td>Bicarbonato de sodio</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>S233-500</td><td></td></tr><tr><td>D+ glucosa</td><td>Millipore-Sigma</td><td>G7528-250G</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro de potasio</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>P217-500</td><td></td></tr><tr><td>Fosfato de sodio monobásico anhidro</td><td>BioShop</td><td>SPM400.500</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro de calcio dihidratado;</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>C79-500</td><td></td></tr><tr><td>Sulfato de magnesio heptahidratado</td><td>BiosShop</td><td>MAG522</td><td></td></tr><tr><td>Agarosa</td><td>BioShop</td><td>AGA002.500</td><td></td></tr><tr><td>Tubos de centrífuga estériles de 50 mL</td><td>Sarstedt</td><td>62.547.004</td><td></td></tr><tr><td>Tubos de centrífuga de 1,5 mL</td><td>Sarstedt</td><td>72.690.001</td><td></td></tr><tr><td>P-97 Tirador de micropipetas Flaming/Brown</td><td>Sutter Instrumentos Co.</td><td>Modelo P-97</td><td></td></tr><tr><td>0,4 mm Di.D. x 75 mm Tubo capilar</td><td>Drummond scientific</td><td>1-000-800/12</td><td></td></tr><tr><td>Etanol</td><td>VWR</td><td>E193</td><td></td></tr><tr><td>Jeringa de 5 mL</td><td>Becton Dickinson & Co</td><td>309646</td><td></td></tr><tr><td>Aceite mineral (pesado)</td><td>Pinzas suizas Rougier Pharma</td><td></td><td></td></tr><tr><td>WPI #5</td><td>World Precision Instruments</td><td>504511</td><td>11 cm, rectas, puntas de 0,06x0,07mm, antimagnéticas. Necesitarás 2 de estos.</td></tr><tr><td>Pinzas Suizas WPI #7</td><td>World Precision Instruments</td><td>504504</td><td>11,5 cm, 0,18x0,2mm, puntas curvas</td></tr><tr><td>Pinzas HTC</td><td>World Precision Instruments</td><td>504617</td><td>11 cm, Recta, plana</td></tr><tr><td>Tijeras de operación</td><td>World Precision Instruments</td><td>501225</td><td>16 cm, Sharp/sharp, recta. Necesitarás 3 de estos.</td></tr><tr><td>Pinza de vendaje</td><td>World Precision Instruments</td><td>501217</td><td>12,5 cm, recta, dentada</td></tr><tr><td>Pinza de iris</td><td>World Precision Instruments</td><td>504478</td><td>10,2 cm, curva completa, dentada</td></tr><tr><td>Pinzas de tejido DeBakey</td><td>World Precision Instruments</td><td>501996</td><td>15 cm, ángulo de 45 grados, mandíbula delicada, 1,5 mm</td></tr><tr><td>de ancho Microespátula de Fisherbran con extremos redondeados</td><td>FisherScientific</td><td>21-401-5</td><td>Necesitará 2 de estos.</td></tr><tr><td>Inyector Nanoject II Auto-Nanolitro</td><td>Drummond scientific</td><td>3-000-204</td><td></td></tr><tr><td>TC Dish 60, Standard</td><td>Sarstedt</td><td>83.3901</td><td>Plato de 60 mm</td></tr><tr><td>Plato de cultivo de tejidos</td><td>Sarstedt</td><td>83.1800</td><td>Plato de 35 mm</td></tr><tr><td>Cera negra</td><td>FisherScientific</td><td>S17432</td><td></td></tr><tr><td>Pipetas de transferencia&nbsp;</td><td>Ultident</td><td>170-CTB700-212</td><td>3 mL, bombilla pequeña</td></tr><tr><td>Microscopio estereoscópico</td><td>Leica Biosystems</td><td>Leica M80</td><td>En reemplazo de nuestro microscopio estereoscópico que ha sido descontinuado por el fabricante (StereoMaster de FisherScientific)</td></tr><tr><td>Electro Square Porator</td><td>BTX Harvard Apparatus</td><td>ECM 830</td><td></td></tr><tr><td>Pinzas, Plattinum Chapado, 3mm</td><td>BTX Harvard Apparatus</td><td>45-0487</td><td></td></tr><tr><td>25G 1 1/2</td><td>Becton Dickinson & Co</td><td>305127</td><td></td></tr><tr><td>Leica VT1000S Micrótomo de cuchilla vibratoria</td><td>Leica Biosystems VT1000S</td><td></td><td></td></tr><tr><td>GEM, Hoja de afeitar de un solo filo</td><td>Microscopía electrónica Sciences</td><td>71952-10</td><td>Retire el extremo romo antes de insertarlo en el espacio designado de la cuchilla del vibratomo</td></tr><tr><td>&micro;-Deslizamiento 8 pocillo</td><td>Ibidi</td><td>80827</td><td>Paquete de 15</td></tr><tr><td>insertos</td> <td>de cultivo de células milicelularesMillipore-Sigma</td><td>PICM0RG50</td><td>30 mm, PTFE hidrófilo, 0,4 y micro; m poro, paquete de 50.&nbsp;</td></tr><tr><td>Microscopio Leica DMi6000</td><td>Leica Microsystems N</td><td>/A</td><td></td></tr><tr><td>Cabezal confocal de disco giratorio Ultraview Vox</td><td>Perkin Elmer</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Volocity 6.0 software de adquisición</td><td>Improvision/Perkin Elmer</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>LiveCell Sistema de incubación de etapa superior</td><td>Dispositivos de patología</td><td>LC30030</td><td>Proporciona control de temperatura, CO2 y humedad.</td></tr><tr><td>Microscopio confocal SP8</td><td>Leica</td><td></td><td></td></tr><tr><td>mCherry-Lifeact-7</td><td>Addgene</td><td>54491</td><td>Regalo de Michael Davidson</td></tr><tr><td>Frasco Fast Green FCF</td><td>Millipore-Sigma</td><td>F7258-25G</td><td>25G, certificado por la Comisión de Manchas Biológicas</td></tr></tbody></table>

ex útero electroporación y culturas organotypic rebanada de cerebros embrionarios de ratón para vivir-la proyección de imagen de interneuronas gabaérgicas de migrando

Ex Utero Electroporation and Organotypic Slice Cultures of Embryonic Mouse Brains for Live-Imaging of Migrating GABAergic Interneurons

Interneuronas GABAérgicas (INs) son componentes esenciales de las redes neuronales que cognición y comportamiento. INs destinada a rellenar la corteza migrar tangencialmente de su lugar de origen en el telencéfalo ventral (incluyendo de las eminencias ganglionares mediales y caudales (MGE, CGE)) a la placa cortical dorsal en respuesta a una variedad de intrínseco y extrínseco señales. Diferentes metodologías se han desarrollado en los años genético manipular vías específicas e investigar cómo regulan los cambios citoesqueléticos dinámicos necesarios para la correcta migración. En el útero de la electroporación se ha utilizado ampliamente para estudiar el efecto de la represión del gen o sobreexpresión en IN específico subtipos al evaluar el impacto en la morfología y posición final. Sin embargo, mientras que este enfoque se utiliza fácilmente modificar radialmente migración de las células piramidal, es técnicamente más difícil cuando dirigidos a electroporación pulg en el útero genera un bajo rendimiento dado las tasas de disminución de la supervivencia de los cachorros cuando la electroporación se lleva a cabo antes de e14.5, como es habitual al estudiar INs derivados de MGE. En un enfoque alternativo, MGE explantes proporcionan un fácil acceso al MGE y facilitan la proyección de imagen de INs modificados genéticamente. Sin embargo, en estos explantes, INs emigran en una matriz artificial, carente de orientación endógena claves y entradas talámicas. Esto nos incitó a optimizar un método donde el INs puede migrar en un ambiente más naturalista, al eludir los desafíos técnicos de los enfoques en el útero . En este papel, describimos la combinación de la electroporación ex útero de ratón embrionario cerebro seguido organotypic rebanada culturas fácilmente, imagen y reconstruir genéticamente modificados INs migrando a lo largo de sus senderos naturales en respuesta a señales endógenas. Este enfoque permite tanto la cuantificación de los aspectos dinámicos de migración con la proyección de imagen confocal Time-lapse, así como el análisis detallado de diversos parámetros morfológicos usando reconstrucciones neuronales tejido immunolabeled fijo.

En esta sección, ofrecemos resultados representativos obtenidos tras la electroporación ex utero de un plásmido de control, o de un plásmido experimental dirigido a un gen de interés, en el MGE de embriones de ratón e13.5 seguido organotypic rebanada culturas se incubó a 37 ° C durante 48 h (para la proyección de imagen de Time-lapse) o 72 h (para fijación y etiquetado immunohistochemical) (ver figura 1B para protocolo esquemático). Ejemplos represen...

Aquí, nos proporcionan un método confiable y de bajo costo para generar culturas de electroporated cerebro organotypic rebanada de embriones de ratón adecuados para microscopía confocal y técnicas de imagen en vivo.

Ex útero Electroporación y culturas Organotypic rebanada de cerebros embrionarios de ratón para vivir-la proyección de imagen de interneuronas GABAérgicas de migrando

GABAergic interneurons (INs) are critical components of neuronal networks that drive cognition and behavior. INs destined to populate the cortex migrate ...

El objetivo general de este experimento es visualizar interneuronas GABAérgicas corticales modificadas genéticamente durante la migración tangencial en el entorno más naturalista posible. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en las neurociencias del desarrollo al detectar el impacto de la pérdida de función de genes específicos de proteínas durante el desarrollo del cerebro. La principal ventaja de esta técnica es que es de bajo coste y relativamente fácil de realizar en comparación con otros métodos similares como la electroporación intrauterina.Por lo tanto, esta técnica puede, en última instancia, mejorar el diagnóstico de los pacientes con trastornos genéticos del neurodesarrollo, como el autismo y la epilepsia, al aclarar la patogenicidad de las mutaciones específicas identificadas en los pacientes, así como el papel de los nuevos genes de la enfermedad durante el desarrollo del cerebro. Comience por configurar el gabinete de bioseguridad con todos los instrumentos necesarios para la disección y el cultivo. Rocíe generosamente todos los instrumentos de la cabina de bioseguridad con etanol al 70% y esterilice los instrumentos y el interior del armario con luz ul

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Neurociencia

Se presenta un método para preparar cortes organotípicos de embriones de ratón mitad de la gestación para el cultivo y la imagen de lapso de tiempo de extensión del nervio periférico.

Cultura rebanada de organotípicos que expresan GFP embriones de ratón de imágenes en tiempo real al crecimiento excesivo de Nervio Periférico

Un método para generar cortes organotípicos del cerebro medio E12.5 embrionarias murinas se describe. Las culturas rebanada organotípicos se puede utilizar para observar el comportamiento de las neuronas dopaminérgicas o neuronas del cerebro medio ventral.

Culturas organotípicos rebanada de mesencéfalo ventral embrionario: Un sistema para estudiar el desarrollo neuronal dopaminérgica In vitro</em

Para llevar a cabo una evaluación rápida de la función de los genes en el desarrollo de la corteza cerebral, se describen procedimientos que implican...

Métodos de estudio de la morfogénesis neuronal:<em&gt; Ex vivo</em&gt; RNAi electroporación en la corteza cerebral embrionario murino

Fuente: Wiegreffe, C., et. al.,  Imágenes confocales de lapso de tiempo de neuronas migratorias en cultivo de corte organotípico de cerebro de ratón embrionario usando En el útero Electroporación. J. Vis. Exp. {{TAG_ 44}} (2017) Este video muestra la microscopía confocal de lapso de tiempo para observar la migración radial de las neuronas corticales desde la zona subventricular a la placa cortical a través de andamios gliales radiales en cortes de cerebro embrionarios de ratón transducidos.

Imágenes de lapso de tiempo de la migración radial de neuronas corticales en cortes de cerebro embrionarios de ratón transducidos

Fuente: Denaxa, M., el al., Trasplante de progenitores interneuronales corticales modificados quimiogenéticamente en cerebros de ratón posnatales tempranos. J. Vis. Exp. (2019)Este video demuestra el procedimiento para inyectar un vector plásmido que lleva el gen de interés en progenitores interneuronales en un corte de cerebro embrionario, seguido de electroporación para la entrada de plásmidos y la expresión génica. Estos progenitores modificados se pueden usar más tarde para tratar...

Transferencia de genes asistida por electroporación integrada en agarosa en progenitores de interneuronas corticales de ratón

La migración de los neuroblastos es un acontecimiento fundamental en la neurogénesis postnatal. Se describe un protocolo para el etiquetado de la eficiencia de los neuroblastos por electroporación in vivo postnatal y la posterior visualización de su migración utilizando time-lapse de rodajas de cerebro agudas. Incluimos una descripción para el análisis cuantitativo de la dinámica de neuroblastos de seguimiento de vídeo.

In vivo Postnatal electroporación y time-lapse de Neuroblast Migración en rodajas de cerebro de ratón aguda

Aquí presentamos un protocolo que proporciona una herramienta para examinar los mecanismos reguladores de genes específicos durante el desarrollo del hipocampo. El empleo de la electroporación ex útero y el cultivo de cortes organotípicos permite la regulación hacia arriba y hacia abajo de la expresión de genes de interés en células individuales y seguir su destino durante el desarrollo.

Ex Utero electroporación y organotípicos rebanada Cultura de ratón Hipocampo Tissue

Este manuscrito ofrece protocolos que utilizan en el útero de electroporación (IUE) para describir la conectividad estructural de las neuronas en el nivel de una sola célula y la excitabilidad de las neuronas marcadas con fluorescencia. Histología se utiliza para caracterizar dendríticas y proyecciones axonales. células enteras de grabación en rodajas agudas se utiliza para investigar la excitabilidad.

La electroporación en el útero métodos para estudiar la excitabilidad de las subpoblaciones neuronales y Conectividad Una sola célula

Este protocolo proporciona instrucciones para la observación directa de neuronas corticales que migran radialmente. La electroporación in utero , el cultivo de corte organotípico y la formación de imágenes confocales en intervalos de tiempo se combinan para estudiar directa y dinámicamente los efectos de la sobreexpresión o regulación negativa de genes de interés en las neuronas que migran y para analizar su diferenciación durante el desarrollo.

Time-lapse Imágenes confocales de las neuronas migratorias en la cultura organotípica en rebanadas de cerebro de ratón embrionario<em&gt; En Utero</em&gt; Electroporación

Este protocolo demuestra un método sencillo y robusto para estudiar el crecimiento del axón in situ y la dinámica del cono de crecimiento. Describe cómo preparar cortes cerebrales agudos fisiológicamente relevantes ex vivo y proporciona una tubería de análisis fácil de usar.

In situ Visualización del crecimiento de axones y la dinámica de los conos de crecimiento en cultivos agudos de cortes cerebrales embrionarios ex vivo

Durante el desarrollo de la corteza cerebral, las neuronas y las células gliales se originan en la zona ventricular que recubre el ventrículo y migran hacia la superficie cerebral. Muchos genes están involucrados en este proceso. Este protocolo introduce la técnica para la obtención de imágenes en time-lapse de las neuronas migratorias y los progenitores gliales.

Imágenes de lapso de tiempo de neuronas migratorias y progenitores gliales en cortes de cerebro de ratón embrionario

Aprende a visualizar interneuronas GABAérgicas en migración mediante electroporación ex útero y cultivos de rebanadas organotípicas de cerebro embrionario de ratón. Este método de bajo costo permite estudiar el desarrollo neuronal y trastornos del neurodesarrollo.

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