Name: Culturas Organotypic tridimensionales de órganos sensoriales vestibulares y auditivas (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-06-01T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 17 s
Description: Aprende a establecer cultivos organotípicos tridimensionales de órganos vestibulares y auditivos murinos. Este método preserva la arquitectura tisular innata y permite estudiar señalización molecular y mecánica durante el desarrollo del oído interno.

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Agradecemos a Dr. A. Jacobo, Dr. J. Salvi y Petelski A. por sus contribuciones a la investigación original en que se basa este protocolo. También agradecemos a Llamas J. y W. Makmura asistencia técnica y agricultura animal. Reconocemos la beca de formación de NIDCD T32 DC009975, NIDCD conceder R01DC015530, Fondo de desarrollo terapéutico de Robertson y la Fundación de la familia Caruso para la financiación. Finalmente, reconocemos el apoyo del Instituto médico de Howard Hughes, que es un investigador Dr. Hudspeth.

Todos los métodos aquí descritos han sido aprobados por el cuidado Animal y comités de uso de la Universidad de Rockefeller y de la Universidad de California del sur.
1. (opcional) preparación del colágeno I solución de tendones Mouse-tail
Nota: Colágeno las soluciones están disponibles comercialmente. Siga las instrucciones del fabricante para la preparación del gel.
<ol><li>Eutanasia a ratones del adulto joven (3-5 semanas) de 5-10 de cualquier cepa de tipo salvaje con dióxido de carbono según el protocolo aprobado por el Comité de uso y cuidado institucional del Animal relevantes16. Recoger las colas y desinfectar sumergiendo en etanol al 70% durante un mínimo de 4 h a temperatura ambiente. Nota: Incubación por más de 48 h debe evitarse, ya que resulta en deshidratación excesiva del tejido y dificulta el proceso de extracción del tendón.</li>
	<li>Retire la piel de cada cola introduciendo un corte longitudinal con una hoja de bisturí y retrayendo la piel todo con pinzas. Transferencia de las colas sin piel en un plato de Petri de 100 mm lleno de etanol al 70% limpio y cortado en segmentos de 10 mm. Nota: Desechar las partes más finas de las colas, que son difíciles de manipular.</li>
	<li>Con unas pinzas, Asegure cada segmento de la cola a la parte inferior de la caja Petri y usar un segundo par de Pinzas finas para extraer los tendones de la cola una a la vez. Las fibras individuales del tendón deberán surgir con resistencia mínima. Nota: Fórceps #5 viejo, sordo funcionan bien para este paso.</li>
	<li>Preparar 100 mL de una solución al 0.1% (por volumen) de ácido acético en agua estéril grado molecular y añadir 10 mL de esta solución a un plato de Petri de 100 mm estériles. Transferir los tendones a la placa de Petri y dejar durante 1 hora a temperatura ambiente para desnaturalizar el colágeno I.</li>
	<li>Utilice una tijera estéril de bisturí o iridectomía con puntas romas, curva para picar el tendón en fragmentos de 1-2 mm. Transferir los tendones picaditos a un tubo estéril de 50 mL y Añadir ácido acético al 0.1% para llevar el volumen a 50 mL. Nota: Utilice cuatro o cinco colas por cada 50 mL de ácido para lograr un colágeno concentración de 2.0-2.5 mg/mL.</li>
	<li>Refrigere el colágeno solución a 4 ° C durante un mínimo de 48 h para facilitar la desnaturalización de la proteína completa. Vortex con un vórtex mesa situado a la máxima velocidad durante 1 minuto dos veces al día.</li>
	<li>Medir la concentración de la solución usando el análisis de ácido bicinchoninic, ajustar el colágeno I concentración a 2.0-2.5 mg/mL mediante la adición de solución al 0.1% de ácido acético y almacenar a 4 ° C. Nota: Colágeno solución se puede conservar por uno o dos años.</li>
	<li>(Opcional) Centrifugue el colágeno solución a 2.000 x g durante 1 h a 4 ° C y usar geles de la fracción superior translúcida (aproximadamente de la mitad del volumen), para conseguir colágeno ópticamente claro en la sección 4.</li>
</ol>2. disección de los órganos vestibulares y auditivas
<ol><li>Eutanasia a ratones embarazadas de cualquier tensión con dióxido de carbono según el protocolo aprobado por el Comité de uso y cuidado institucional del Animal relevantes16. Extraer y decapitar a los embriones. Nota: Lfng CreERT2/tdTomato ratones pueden usarse para permitir el etiquetado permanente de apoyar a las células a la exposición 4-hydroxytamoxifen17.</li>
	<li>Esterilizar todos los superficies de trabajo e instrumentos de disección, incluyendo dos pares de #5 pinzas y cuchillo pelo18, limpiar con etanol al 70%.</li>
	<li>Dividir cada cabeza en dos mitades mediante la introducción de un corte longitudinal con una hoja de bisturí estéril o con dos pares de pinzas #5. Extraer los huesos temporales, que contienen los oídos interno19y colocarlos en 15 mL de solución salina equilibrada fría de Hank (HBSS) en caja Petri de 60 mm. Mantener el plato en el hielo. Nota: Embriones en una serie de etapas desde E13.5 E18.5 se han utilizado con éxito.</li>
	<li>(Opcional) Lavar los oídos interno agitando suavemente les en un tubo cónico de 50 mL que contenga 30 mL helado HBSS y reemplazar la HBSS tres o cuatro veces. Mantenga el tubo en hielo. Nota: Este paso limita la posible contaminación de la cultura de tejido y lleva rápidamente la temperatura a 4 ° C, que impide que el tejido la degradación y la muerte celular.</li>
	<li>Usando dos pares de Pinzas finas para #5, separar las orejas del interior del hueso temporal y transferir las orejas, tres o cuatro a la vez, en un plato de Petri de 60 mm con HBSS helada.</li>
	<li>Disecar los órganos sensoriales vestibulares.<ol>
<li>Orientar el lado medial de la orejas para arriba y busque el utrículo. Con dos pares de pinzas #5, quitar el cartílago que rodea los órganos vestibulares. Suavemente separa el nervio vestibular, la conexión entre el utrículo y el sáculo y los canales semicirculares, como se muestra en la figura 1. Tire el utrículo y el ámpula adjunta de los canales semicirculares superiores y horizontales de la oreja. Nota: Este método puede utilizarse en interior de etapas E16.5 - E18.5. Preservar los fragmentos de cartílago para la sección 3 más abajo.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Diseccionar la cóclea.<ol>
<li>Retire el tejido cartilaginoso que rodea el órgano de la audición con dos pares de pinzas #5. Suavemente separa la conexión entre la base coclear y el sáculo, como se muestra en la figura 1. Nota: Para etapas E13.5 - E14.5, suavizan el cartílago antes de la disección por el tratamiento interno oídos con colagenasa 0.25% I en solución salina tamponada con fosfato (PBS) por 5 min a temperatura ambiente. Preservar los fragmentos de cartílago para la sección 3 más abajo.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Utilizando una pipeta de 200 μL cabido con una punta ancha antiadherente, transferir a un plato de Petri de 30 mm con medio de cultivo compuesto por DMEM/F12 suplementado con 33 mM DGlucosa, bicarbonato de sodio de 19 mM, 15 mM 4(2hydroxyethyl) - el utricles y cócleas 1piperazineethanesulfonic ácido (HEPES), glutamina 1 mM, nicotinamida de 1 mM, 20 mg/L factor de crecimiento epidérmico, factor de crecimiento fibroblástico de 20 mg/L, 10 mg/L insulina, transferrina de 5.5 mg/L y selenito de sodio de 5 μg/L.</li>
	<li>Mantener los preparativos del utrículo de hasta 3 h a 37 ° C en una incubadora de cultivo de tejidos gaseada con 5% de dióxido de carbono para permitir la cicatrización de los cortes en el epitelio introducidas durante la disección. Preparaciones de cóclea deben ser transferidas al gel de colágeno 10 min después de la disección. Nota: Ya que la disección se realiza en HBSS helada, no hay ninguna necesidad de precalentar el medio de cultivo a 37 ° C.</li>
</ol>3. (opcional) ajuste colágeno Gel rigidez mediante la adición de concentraciones variables de condrocitos
Nota: Fue modificado el método para el aislamiento de condrocitos de Gosset et al. 20
<ol><li>Preparar una solución de 1% de colagenasa en estéril 1 x PBS y tienda 100-200 μL partes alícuotas a-80 ° C. Descongela el hielo cuando sea necesario, evitando múltiples ciclos de hielo-deshielo.</li>
	<li>Uso finas pinzas para recoger los pedazos de cartílago de la disección de los órganos vestibulares y auditivos de 10-12 orejas. Tejidos conectivos y del oído interno separados del cartílago. El cartílago de la transferencia a un plato de Petri de 30 mm y añadir 300 μL de medio de cultivo estéril.</li>
	<li>Utilice unas tijeras de hoja o iridectomía estéril de bisturí con puntas romas y curvadas para picar el tejido para lograr piezas de cartílago aproximadamente 0,5 mm de longitud.</li>
	<li>Añadir colagenasa I al medio con cartílago para lograr una concentración de la enzima final del 0,25%. Transferir el plato a una incubadora de cultivo de tejidos a 37 ° C gas 5% dióxido de carbono. Pipeta vigorosamente utilizando una pipeta de 1000 μl cada 20 min hasta pedazos de cartílago se disocian y no son distinguibles en la solución, luego incubar un 20 minutos adicionales. Nota: En el caso de las preparaciones del utrículo, aislamiento de condrocitos se puede realizar en el paso 2.9; tarda aproximadamente 2 horas (3-4 rondas de pipeteo).</li>
	<li>Recoge la suspensión de células en un tubo cónico de 15 mL y ajustar el volumen a 10 mL con PBS estéril 1 x. Centrifugar a 800 x g durante 5 min a 4 ° C. Quite el sobrenadante y resuspender las células en 10 mL de PBS estéril 1 x. Centrifugue a 800 x g durante 5 min a 4 ° C y eliminar el sobrenadante. Nota: Es importante lavar las células dos veces; cualquier restante colagenasa que digiero el colágeno que gel.</li>
	<li>Utilizando una pipeta de 200 μL, añada 100 μl de medio de cultivo al pellet celular y pipetee suavemente para resuspender. Contar las células usando un hemocitómetro y mantenerlas en antes hielo.</li>
	<li>Para aumentar la rigidez del gel, agregar condrocitos para el colágeno neutralizado gel solución (sección 1) y mezclar rápidamente para distribuir las células en el gel antes de la solidificación. Nota: El módulo de elasticidad del colágeno (una medida de la rigidez) del gel, aumenta linealmente con el número de condrocitos agregó11. La relación es descrita por la función lineal determinada experimentalmente E = 206· NC + 15, en la que E es el módulo elástico en pascales y Nc es el número de condrocitos en millones. Para un protocolo detallado para gel medidas de rigidez consulte el original artículo11.</li>
</ol>4. Coloque el órgano sensorial Vestibular o auditivo en un colágeno que gel
<ol><li>En un tubo de 1,5 mL estéril, preparación de colágeno I solución de polimerización mediante la mezcla de 160 μl de PBS de x 10 con indicador de pH rojo de fenol, 133 μl 0,34 M de hidróxido de sodio, 70 μl 0,9 M de bicarbonato de sodio y 40 μl de 1 M HEPES. Mantenga el tubo en hielo. Nota: Esta receta proporciona la solución de polimerización necesaria para preparar 2 mL de colágeno gel, pero puede ampliarse según sea necesario.</li>
	<li>Mezclar 100 μl de solución de polimerización y 400 μL de colágeno I solución sobre hielo transfiriendo suavemente hacia arriba y hacia abajo en un tubo de 1,5 mL refrigerado. Para aumentar la rigidez del gel, agregar 50 μl de medio de cultivo que contiene condrocitos y mezclar suavemente como se describe en la sección 3.</li>
	<li>Transferir 500 μl del colágeno neutralizado solución a un plato de Petri de 30 mm enfriada con un relleno de fondo de cristal de 10 mm o a un pozo de una placa de la pozo cuatro. Nota: Es fundamental guardar todos los reactivos en el hielo para evitar una polimerización rápida y desigual del colágeno I.</li>
	<li>Transferir rápidamente las cócleas o utricles al colágeno neutralizado solución y ajustar los órganos a la posición deseada con un pelo estéril cuchillo18 o un par de Pinzas finas. Nota: Colágeno la polimerización se hace perceptible después de 1-2 min como la solución se vuelve turbia.</li>
	<li>Después de la solución alrededor del tejido ha polimerizado, coloque el plato de Petri o la placa de la pozo cuatro por 20 min a 37 ° C en una incubadora de cultivo de tejidos gaseada con 5% de dióxido de carbono para asegurar la polimerización completa.</li>
	<li>Añadir 3 mL de medio de cultivo suplementado con suero bovino fetal (FBS) de 0,5% por caja de Petri o 500 μl del mismo medio por pozo de una placa de la pozo cuatro. Mantener el cultivo a 37 ° C en una incubadora de cultivo de tejidos gaseada con 5% de dióxido de carbono. Si lo desea, complementar el medio de cultivo con 10 μm 5-ethynyl-2´-desoxiuridina (EdU) para etiquetar las células proliferantes. Nota: Concentraciones más altas de FBS se pueden utilizar si se desea.</li>
</ol>5. virales inyecciones en cultivos tridimensionales de órganos sensoriales vestibulares y auditivos
<ol><li>Descongelar el virus deseado en el hielo y mezclar con solución de azul tripán en un tubo cónico de 0,5 mL para alcanzar una concentración del tinte final de 0.05%. Utilizar tintura de 10-20 x para evitar la dilución sustancial del virus. Mantener en hielo. Nota: Adenovirus serotipo 5 trabajos mejores para infectar células de soporte en el utrículo19, mientras que virus adeno-asociado Anc80 puede infectar las células de pelo y células de apoyo en el utrículo y la cóclea21.</li>
	<li>Romper la punta de una aguja de vidrio preparada en un tirador de la micropipeta con pinzas limpias bien observando en el máximo aumento de un binocular microscopio de disección. Nota: Es importante optimizar la configuración del extractor de aguja. Agujas con caña del 9 - 12 mm y 20 - 30 μm aberturas funcionan mejor.</li>
	<li>Eliminar la cultura de una órgano sensorial de la incubadora. Conecte la aguja a la microinyectora y rellene con 2-3 μl de mezcla de tinte y virus. Avanzar la aguja en el órgano sensorial mientras observa con binoculares microscopio de disección.</li>
	<li>Conduce suavemente la punta de la aguja a través de capas epiteliales y mesenquimales de la azotea de una cultura utricular tridimensional. Inyectar la mezcla viral hasta llenan las cavidades del utrículo y ámpula con colorante azul. Nota: Ya que permite fácil acceso a los órganos sensoriales, un plato de Petri de fondo de cristal de 10 mm es óptimo para las inyecciones.</li>
	<li>Incubar a 37 ° C en una incubadora de cultivo de tejidos gaseada con 5% de dióxido de carbono. Nota: Cuando la proteína fluorescente verde o roja es utilizada en la estructura viral, la fluorescencia es evidente 24 h después de transducción viral.</li>
</ol>

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</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

Las señales moleculares que medie crecimiento y la diferenciación en el oído interno durante el desarrollo se han estudiaron extensivamente5,6,7,8,9,10. Sin embargo, la evidencia obtenida desde el sistema utricular modelo sugiere que señales mecánicas, detectados a través de uniones celulares y la activación de la señalizació...

El estudio de la mayoría de los aspectos del desarrollo del órgano de los mamíferos ha sido facilitado por sistemas in vitro . Ahora se utilizan dos métodos principales para el cultivo de órganos sensoriales vestibulares: flotante1 y adherente2 preparados. Ambos métodos permiten la investigación de la célula de pelo vulnerabilidades3 regeneración1,4 y in vitro. Además, el papel del desarrollo de la muesca5,67,de Wnt8y factor de crecimiento epidérmico receptor (EGFR)9,10 señalización cascadas en el oído interno tiene se ha establecido, en parte, mediante el uso de cultivos en vitro de epitelio sensorial. Sin embargo, se controlan la diferenciación y crecimiento celular, no sólo a través de la señalización por morfógenos, sino también a través de estímulos físicos y mecánicos como contactos intercelulares, la rigidez de la matriz extracelular y mecánicos de estiramiento o constricción. El papel de tales estímulos mecánicos es un desafío para investigar en el desarrollo del oído interno en vivo. Por otra parte, los métodos existentes de cultura libre-flotación y adherentes no son adecuados para estos estudios in vitro. Aquí describimos un método de cultura organotypic tridimensional de colágeno geles de rigidez variable. En gran parte, este método conserva la arquitectura en vivo de los órganos sensoriales vestibulares y cocleares y permite la investigación de los efectos de la fuerza mecánica en el crecimiento y la diferenciación11.
Debido a estímulos mecánicos son conocidos para activar eventos moleculares posteriores, como el hipopótamo señalización vía12,13,14,15, es importante ser capaz de combinar la estimulación mecánica con manipulaciones bioquímicas y genéticas. El método de cultivo que se describe aquí permite la entrega de genes mediada por virus y puede ser utilizado para el estudio de mecánicos y moleculares de señalización durante el desarrollo de oído interno11.

<table><tbody><tr><td>#10 Cuchillas quirúrgicas</td><td>Miltex</td><td>4-110</td><td></td></tr><tr><td>#5 Pinzas</td><td>Dumont</td><td>11252-20</td><td></td></tr><tr><td>Placa de Petri de 100 mm</td><td>Sigma</td><td>P5856-500EA</td><td></td></tr><tr><td>250 uL puntas de pipeta de orificio grande</td><td>USA Scientific</td><td>1011-8406</td><td></td></tr><tr><td>Placa de Petri con fondo de vidrio de 30 mm</td><td>Matsunami Glass USA Corporation</td><td>D35-14-1.5-U</td><td></td></tr><tr><td>4 pocillos placa</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>176740</td><td></td></tr><tr><td>4-Hidroxitamoxifeno&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>H7904</td><td></td></tr><tr><td>60&nbsp; mm Placa de Petri</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>123TS1</td><td></td></tr><tr><td>Ácido acético&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>537020</td><td></td></tr><tr><td>Ad-GFP</td><td>Vector Biolabs</td><td>1060</td><td></td></tr><tr><td>Anti-GFP, fracción IgY de pollo</td><td>Invitrogen</td><td>A10262&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Myo7A</td><td>Proteus Biosciences</td><td>25-6790</td><td></td></tr><tr><td>Anticuerpo anti-Sox2 (Y-17)</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-17320</td><td></td></tr><tr><td>Ensayo de ácido bicinconínico</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>23225</td><td></td></tr><tr><td>Click-iT EdU Alexa Fluor 647 Kit de imágenes</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>C10340</td><td></td></tr><tr><td>Colagenasa I</td><td>Gibco</td><td>17100017</td><td></td></tr><tr><td>D-glucosa</td><td>Sigma</td><td>G8270</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F12&nbsp;</td><td>Gibco</td><td>11320033</td><td></td></tr><tr><td>Factor de crecimiento epidérmico</td><td>Sigma</td><td>E9644</td><td></td></tr><tr><td>Suero fetal bovino (FBS)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>16140063</td><td></td></tr><tr><td>Factor de crecimiento de fibroblastos</td><td>Sigma</td><td>F5392</td><td></td></tr><tr><td>Tirador de micropipetas Flaming/Brown</td><td>Sutter Instrument</td><td>P-97</td><td></td></tr><tr><td>Glutamina</td><td>Sigma</td><td>G8540</td><td></td></tr><tr><td>HBSS</td><td>Gibco</td><td>14025092</td><td></td></tr><tr><td>Hemocitómetro&nbsp;</td><td>Daigger</td><td>EF16034F</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma</td><td>H4034</td><td></td></tr><tr><td>Insulina</td><td>Sigma</td><td>I3536</td><td></td></tr><tr><td>Tijeras de iridictomía&nbsp;</td><td>Zepf Instrumentos Médicos</td><td>08-1201-10&nbsp; &nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Microinyector</td><td>Narishige</td><td>IM-6</td><td></td></tr><tr><td>Nicotinamida</td><td></td><td>Sigma N0636</td><td></td></tr><tr><td>PBS (10X), pH 7.4</td><td>Gibco</td><td>70011044</td><td></td></tr><tr><td>PBS (1X), pH 7.4</td><td>Gibco</td><td>10010023</td><td></td></tr><tr><td>Rojo de Fenol Indicador de pH&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>P4633&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Etanol puro, 200 pruebas Decon Labs</td><td>&nbsp;</td><td>2716</td><td></td></tr><tr><td>RFP anticuerpo</td><td>ChromoTek</td><td>&nbsp; 5F8</td><td></td></tr><tr><td>Bicarbonato de sodio</td><td>Sigma</td><td>S5761</td><td></td></tr><tr><td>Hidróxido de sodio</td><td>Sigma</td><td>S8045</td><td></td></tr><tr><td>Selenito de sodio</td><td>Sigma</td><td>S5261</td><td></td></tr><tr><td>Vórtice de sobremesa&nbsp;</td><td>VWR</td><td>97043-562</td><td></td></tr><tr><td>Transferrin</td><td>Sigma</td><td>T8158</td><td></td></tr><tr><td>Azul tripano&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>T6146</td><td></td></tr></tbody></table>

culturas organotypic tridimensionales de órganos sensoriales vestibulares y auditivas

Three-dimensional Organotypic Cultures of Vestibular and Auditory Sensory Organs

Los órganos sensoriales del oído interno son desafiantes para estudiar en los mamíferos debido a su inaccesibilidad a la manipulación experimental y observación óptica. Por otra parte, aunque las técnicas de cultivo existentes permiten perturbaciones bioquímicas, estos métodos no proporcionan un medio para estudiar los efectos de fuerza mecánica y rigidez del tejido durante el desarrollo de los órganos sensoriales del oído interno. Aquí se describe un método de cultura organotypic tridimensional del utrículo murino intacto y cóclea que supera estas limitaciones. La técnica para el ajuste de una rigidez de la matriz tridimensional que se describe aquí permite la manipulación de la fuerza elástica contra crecimiento del tejido. Por lo tanto, este método puede utilizarse para estudiar el papel de las fuerzas mecánicas durante el desarrollo del oído interno. Además, las culturas permiten entrega de genes mediada por virus, que puede ser utilizada para experimentos de ganancia y pérdida de función. Este método de cultivo conserva innata de las células ciliadas y las células y sirve como una alternativa potencialmente superior a la tradicional cultura bidimensional de órganos sensoriales vestibulares y auditivos.

Órganos sensoriales vestibulares y auditivos de oídos embrionarios, cultivadas en 40 Pa colágeno geles mímico rigidez bajo condiciones embrionarias11, retener relativamente normales estructuras tridimensionales (figura 1) y mantener las células de pelo y apoyo a las células (figura 2 y figura 3). Aunque apoyo la densidad celular disminuye en más del 30% (prueba tde St...

Culturas organotypic tridimensional del utrículo murino y cóclea en ópticamente claro colágeno geles preservar tejido natural morfología, permiten estimulación mecánica mediante ajuste de la rigidez de la matriz y permitan de genes mediada por virus.

Culturas Organotypic tridimensionales de órganos sensoriales vestibulares y auditivas

The sensory organs of the inner ear are challenging to study in mammals due to their inaccessibility to experimental manipulation and optical observation. ...

El objetivo general de este procedimiento es establecer cultivos organotípicos tridimensionales de los órganos sensoriales vestibulares y auditivos murinos. Este método puede ayudar a responder las preguntas clave en el campo de investigación del oído interno, como por ejemplo, cuáles son las funciones de la fuerza mecánica y la rigidez del tejido durante el desarrollo de los órganos sensoriales del oído interno. La principal ventaja de esta técnica es que conserva en gran medida la arquitectura innata de la cóclea vestibular y nos permite estudiar la señalización molecular y mecánica durante el desarrollo del oído interno.El Dr. Hudspeth y yo tuvimos la idea de este método cuando nos dimos cuenta de que los cultivos tridimensionales pueden proporcionar condiciones morfisiológicas para estudiar el crecimiento de órganos vestibulares in vitro. Primero, use etanol al 70% para limpiar y desinfectar el área de trabajo y todos los instrumentos de disección necesarios, incluidas las pinzas número cinco y un cuchillo para el cabello. A continuación, utiliza una hoja de bisturí estéril para hacer un corte longitudinal, divide la cabeza del ratón en dos mitades y extrae los huesos temporales.Transfiera 15 mililitros de tampón HBSS en una placa de Petri de 60 milímetros sobre hielo. A continuación, utilice dos pares de pinzas finas del número cinco para aislar los oídos internos de los huesos temporales. Luego, transfiera de tres a cuatro mazorcas a la vez en una placa de Petri de 60 milímetros que contenga tampón HBSS helado.A continuación, orienta las orejas con el lado medial hacia arriba para localizar el utrículo. Utilice los dos pares de pinzas del número cinco para extraer el cartílago que rodea los órganos vestibulares. A continuación, corte el nervio vestibular, la conexión entre el utrículo y el sáculo, y los canales semicirculares para liberar el utrículo y las ampollas adjuntas de las orejas.Recorte el exceso de canales semicirculares si es necesario. Alternativamente, use los dos pares de pinzas del número cinco para eliminar el tejido cartilaginoso que rodea el órgano auditivo. Luego, aísla la cóclea.A continuación, utilice una pipeta de 200 microlitros equipada con una punta ancha antiadherente para transferir la cóclea y los utrículos a una placa de Petri de 30 milímetros llena de medio de crecimiento basado en DMEM/F12. A continuación, transfiera las preparaciones cocleares y de utrículo a una incubadora de cultivo de tejidos, gaseada con un 5% de dióxido de carbono a 37 grados centígrados. Esto es para lograr cultivos de órganos con lúmenes cerrados.Prepare 100 microlitros de la solución de polimerización de colágeno uno en un tubo estéril de 1,5 mililitros. Luego, deje el tubo en hielo. A continuación, retire las preparaciones cocleares y de utrículo de la incubadora de cultivo de tejidos.Prepare la solución de colágeno neutralizado. Para ello, añade 400 microlitros de colágeno a un tubo refrigerado de 1,5 mililitros con 100 microlitros de solución de polimerización pipeteando varias veces con hielo. Transfiera 500 microlitros de la solución de colágeno neutralizado a una placa de Petri refrigerada de 30 milímetros con un inserto de fondo de vidrio de 10 milímetros.Transfiera inmediatamente la cóclea o los utrículos a la solución de colágeno neutralizado utilizando una pipeta de 200 microlitros equipada con una punta ancha antiadherente. Use un cuchillo de cabello estéril o un par de pinzas finas para ajustar los órganos a sus posiciones deseadas bajo un microscopio de disección binocular. Para asegurar una polimerización completa, incube la placa de Petri a 37 grados centígrados durante 20 minutos.Después de 20 minutos, agregue tres mililitros de medio de crecimiento, complementado con 0,5% de suero bovino fetal en cada placa de Petri. Después de agregar el medio de crecimiento, incube el cultivo a 37 grados centígrados. Primero, descongele el virus en hielo.Luego, mezcle la suspensión viral con la solución de azul de tripano en un tubo cónico de 0,5 mililitros para ajustar la concentración final de tinte de 0,05%Después de mezclar la solución de azul de tripano, deje las partículas virales en hielo. A continuación, utilice un microscopio de disección binocular para observar la rotura de la punta de la aguja de vidrio, preparada en un extractor de micropipetas con pinzas limpias y finas. Primero, retire el cultivo de órganos sensoriales de la incubadora.Conecte la aguja al microinyector. Llena la aguja con dos o tres microlitros de tinte y mezcla viral. Mire a través del microscopio de disección binocular mientras coloca la aguja en el órgano sensorial.Siga avanzando la punta de la aguja a través de las capas mesenquimal y epitelial del techo de un cultivo utricular tridimensional. Siga inyectando la mezcla viral hasta que las cavidades del utrículo y las ampollas se llenen con el tinte azul. Luego, incube el cultivo de órganos en una incubadora de cultivo de tejidos a 37 grados centígrados gaseada con 5% de dióxido de carbono.Estas son las imágenes microscópicas de luz del cultivo de utrículo y coclear incrustadas en el gel tridimensional de colágeno uno. El utrículo y la cóclea se obtienen a partir de embriones de 17,5 y 14,5 días de edad, respectivamente, y se cultivan durante 48 horas. Estas imágenes microscópicas confocales muestran un utrículo embrionario de 18,5 días de edad justo antes y después de la explantación en el gel de colágeno 40PA.Después de tres días en el cultivo, casi el 80% de las células ciliadas positivas para Myo7A permanecen intactas. La densidad celular de soporte disminuye en más del 30% y la densidad de células ciliadas disminuye en un 60% después de tres días en cultivos uticulares. Estas imágenes microscópicas confocales muestran una cóclea embrionaria de 14,5 días de edad justo antes y después de la explantación en el gel de colágeno 40PA.Después de tres días en cultivo, las células ciliadas internas y externas Myo7A y Sox2 positivas se distinguen morfológicamente y se organizan en unas cuatro o cinco filas. Aquí, las imágenes muestran una infección viral exitosa de las células de soporte en la base de la cóclea y a través de los cultivos tridimensionales utriculares obtenidos a partir de 15,5 y 17,5 días de embriones, respectivamente. Después de ver este video, debe tener una buena comprensión de cómo diseccionar órganos sensoriales intactos del oído interno, establecer cultivos tridimensionales de utrículo y cóclea y colágeno tipo uno, y realizar transfecciones virales en esos cultivos tridimensionales.Recuerde que trabajar con partículas virales, dependiendo de la carga de genes, puede ser peligroso. Siempre se deben practicar precauciones, como el uso de equipo de protección personal y la eliminación viral adecuada.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Developmental Biology

Biología del Desarrollo

Este procedimiento describe un método para el aislamiento y la cultura del órgano de Corti murino con o sin el limbo espiral y las neuronas del ganglio espiral. También demostramos un método para la expresión de un gen reportero exógenos en el órgano de Corti explante de la electroporación.

Cultura primaria y electroporación plásmido del órgano de Corti murino.

Un procedimiento simple de vibratome seccionar el órgano de Corti, seguido por microscopía confocal de inmunohistoquímica y se describe. Este procedimiento permite una mejor conservación de la citoarquitectura fino del órgano de Corti de mamíferos, y por lo tanto permite la cuantificación exacta de los tipos de células.

Vibratome seccionamiento para la Preservación de Mejora de la citoarquitectura del órgano de Corti mamíferos

Este video muestra el proceso para aislar explantes de ganglios espirales del oído interno y co-cultivarlos con el órgano de Corti en una matriz de electrodos múltiples. Los ganglios espirales se extraen cuidadosamente y se seccionan en secciones de tejido más pequeñas o explantes. Estos explantes se cultivan en el área activa de la matriz de electrodos múltiples para promover el crecimiento del proceso neuronal.

Cultivo de explantes de neuronas espirales murinas en matrices de electrodos múltiples

Análisis de la función de las células ciliadas vestibulares se complica por su ubicación en lo profundo de la parte más dura del cráneo, hueso temporal pétreo. La mayoría de los estudios de células pilosas funcionales han utilizado intensamente células ciliadas aislados. A continuación se describe una preparación semi-intacta de ratón epitelio vestibular para estudios electrofisiológicos y de microscopía de dos fotones.

Una preparación semi-intacta aislada del ratón epitelio sensorial vestibular de Electrofisiología y de alta resolución de la microscopía de dos fotones

Presentamos un protocolo para cultivar explantes primarios de ganglios espirales murinos en matrices de electrodos múltiples para estudiar los perfiles de respuesta neuronal y optimizar los parámetros de estimulación. Dichos estudios tienen como objetivo mejorar la interfaz neurona-electrodo de los implantes cocleares para beneficiar la audición de los pacientes, así como el consumo de energía del dispositivo.

Ganglio espiral neurona explante cultura y Electrofisiología de multi electrodos matrices

En este estudio, presentamos un método de la proyección de imagen en tiempo real usando microscopia confocal para observar las células que se mueven hacia el tejido dañado por la incubación ex vivo con el epitelio coclear que contiene el órgano de Corti.

In vitro Time-lapse live-cell imaging para explorar la migración celular hacia el órgano de Corti

El pollito es un organismo modelo rentable, accesible y ampliamente disponible para una variedad de estudios. Aquí, se detalla una serie de protocolos para comprender los mecanismos moleculares que subyacen al desarrollo y la regeneración del oído interno aviar.

Métodos In Ovo y Ex Ovo para estudiar el desarrollo del oído interno aviar

A continuación se presentan métodos que proporcionan instrucciones detalladas para la disección, la disociación, el cultivo y el registro de pinzas de parche de las neuronas ganglionares vestibulares y ganglionares espirales del oído interno.

Aislamiento y cultivo de somas vestibulares y ganglionares espirales de roedores neonatales para registros de patch-clamp

El protocolo actual actualiza los protocolos anteriores e incorpora enfoques relativamente sencillos para el cultivo de explantes cocleares de alta calidad. Esto proporciona una adquisición de datos fiable e imágenes de alta resolución en células vivas y fijas. Este protocolo apoya la tendencia actual de estudiar las células del oído interno.

Explantes cocleares neonatales enteros como modelo in vitro

En este artículo, presentamos un protocolo detallado para aislar y cultivar células ciliadas cocleares primarias de ratones. Inicialmente, el órgano de Corti se diseccionó de cócleas murinas neonatales (de 3 a 5 días de edad) bajo un microscopio. Posteriormente, las células se digierieron enzimáticamente en una suspensión unicelular y se identificaron mediante inmunofluorescencia después de varios días en cultivo.

Aislamiento y cultivo de células ciliadas cocleares primarias de ratones neonatos

En este trabajo describimos una técnica para la extracción de órganos terminales vestibulares humanos en condiciones fisiológicas durante la laberintectomía y su análisis mediante inmunotinción.

Extracción de órganos terminales vestibulares en condiciones fisiológicas durante la laberintectomía

Aprende a establecer cultivos organotípicos tridimensionales de órganos vestibulares y auditivos murinos. Este método preserva la arquitectura tisular innata y permite estudiar señalización molecular y mecánica durante el desarrollo del oído interno.

Culturas Organotypic tridimensionales de órganos sensoriales vestibulares y auditivas

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