Name: Identificar sitios de transcripción Factor Olig2 Unión genómica en agudo purificada PDGFRα + células por inmunoprecipitación de cromatina celular bajo análisis de la secuencia (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-04-16T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 29 s
Description: Aprenda a analizar la unión genómica de Olig2 en células precursoras de oligodendrocitos purificadas mediante ChIP de bajas células y secuenciación masiva. Este método permite estudiar regulación transcripcional y mecanismos epigenéticos en diferenciación celular.

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JQW, XD, RCDD y YY fueron apoyados por becas de los institutos nacionales de salud R01 NS088353; NIH grant 1R21AR071583-01; el Staman Ogilvie fondo-Memorial Hermann Foundation; la iniciativa de cerebro UTHealth y CTSA UL1 TR000371; y una beca de la Universidad de Texas sistema Neurociencia y Neurotecnología Research Institute (Grant #362469).

<ol><li>Wu, J. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tcf7+is+an+important+regulator+of+the+switch+of+self-renewal+and+differentiation+in+a+multipotential+hematopoietic+cell+line%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genet%22%5BJournal%5D)">Tcf7 is an important regulator of the switch of self-renewal and differentiation in a multipotential hematopoietic cell line.</a> PLoS Genet. 8 (3), e1002565(2012).</li>
<li>Zuchero, J. B., Barres, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intrinsic+and+extrinsic+control+of+oligodendrocyte+development%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Intrinsic and extrinsic control of oligodendrocyte development.</a> Curr Opin Neurobiol. 23 (6), 914-920 (2013).</li>
<li>Liu, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+oligodendrocyte+differentiation+by+Olig2+and+Sox10%3A+evidence+for+reciprocal+interactions+and+dosage-dependent+mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Induction of oligodendrocyte differentiation by Olig2 and Sox10: evidence for reciprocal interactions and dosage-dependent mechanisms.</a> Dev Biol. 302 (2), 683-693 (2007).</li>
<li>Dong, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comprehensive+Identification+of+Long+Non-coding+RNAs+in+Purified+Cell+Types+from+the+Brain+Reveals+Functional+LncRNA+in+OPC+Fate+Determination%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genet%22%5BJournal%5D)">Comprehensive Identification of Long Non-coding RNAs in Purified Cell Types from the Brain Reveals Functional LncRNA in OPC Fate Determination.</a> PLoS Genet. 11 (12), e1005669(2015).</li>
<li>Hilgenberg, L. G., Smith, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+dissociated+mouse+cortical+neuron+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Preparation of dissociated mouse cortical neuron cultures.</a> J Vis Exp. (10), e562(2007).</li>
<li>Emery, B., Dugas, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+of+oligodendrocyte+lineage+cells+from+mouse+cortices+by+immunopanning%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb+Protoc%22%5BJournal%5D)">Purification of oligodendrocyte lineage cells from mouse cortices by immunopanning.</a> Cold Spring Harb Protoc. 2013 (9), 854-868 (2013).</li>
<li>Cahoy, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+transcriptome+database+for+astrocytes%2C+neurons%2C+and+oligodendrocytes%3A+a+new+resource+for+understanding+brain+development+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">A transcriptome database for astrocytes, neurons, and oligodendrocytes: a new resource for understanding brain development and function.</a> J Neurosci. 28 (1), 264-278 (2008).</li>
<li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+RNA-sequencing+transcriptome+and+splicing+database+of+glia%2C+neurons%2C+and+vascular+cells+of+the+cerebral+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">An RNA-sequencing transcriptome and splicing database of glia, neurons, and vascular cells of the cerebral cortex.</a> J Neurosci. 34 (36), 11929-11947 (2014).</li>
<li>Cheng, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bone+morphogenetic+protein+signaling+and+olig1%2F2+interact+to+regulate+the+differentiation+and+maturation+of+adult+oligodendrocyte+precursor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Bone morphogenetic protein signaling and olig1/2 interact to regulate the differentiation and maturation of adult oligodendrocyte precursor cells.</a> Stem Cells. 25 (12), 3204-3214 (2007).</li>
<li>Andrews, S. FastQC: A quality control tool for high throughput sequencing data. , Available from:
 <a target="_blank" href="http://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/">http://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/</a> (2018).</li>
<li>Bolger, A. M., Lohse, M., Usadel, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trimmomatic%3A+a+flexible+trimmer+for+Illumina+sequence+data%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">Trimmomatic: a flexible trimmer for Illumina sequence data.</a> Bioinformatics. 30 (15), 2114-2120 (2014).</li>
<li>Langmead, B., Salzberg, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fast+gapped-read+alignment+with+Bowtie+2%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Fast gapped-read alignment with Bowtie 2.</a> Nat Methods. 9 (4), 357-359 (2012).</li>
<li>Li, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Sequence+Alignment%2FMap+format+and+SAMtools%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">The Sequence Alignment/Map format and SAMtools.</a> Bioinformatics. 25 (16), 2078-2079 (2009).</li>
<li>Heinz, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simple+combinations+of+lineage-determining+transcription+factors+prime+cis-regulatory+elements+required+for+macrophage+and+B+cell+identities%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">Simple combinations of lineage-determining transcription factors prime cis-regulatory elements required for macrophage and B cell identities.</a> Mol Cell. 38 (4), 576-589 (2010).</li>
<li>Team, R. C. <a target="_blank" href="https://www.gbif.org/tool/81287/r-a-language-and-environment-for-statistical-computing">A language and environment for statistical computing.</a> R Foundation for Statistical Computing. , (2015).</li>
<li>Kharchenko, P. V., Tolstorukov, M. Y., Park, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Design+and+analysis+of+ChIP-seq+experiments+for+DNA-binding+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Design and analysis of ChIP-seq experiments for DNA-binding proteins.</a> Nat Biotechnol. 26 (12), 1351-1359 (2008).</li>
<li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="https://genomebiology.biomedcentral.com/articles/10.1186/gb-2008-9-9-r137">Model-based analysis of ChIP-Seq (MACS).</a> Genome Biol. 9 (9), R137(2008).</li>
<li>Quinlan, A. R., Hall, I. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BEDTools%3A+a+flexible+suite+of+utilities+for+comparing+genomic+features%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">BEDTools: a flexible suite of utilities for comparing genomic features.</a> Bioinformatics. 26 (6), 841-842 (2010).</li>
<li>Robinson, J. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrative+genomics+viewer%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Integrative genomics viewer.</a> Nat Biotechnol. 29 (1), 24-26 (2011).</li>
<li>Bailey, T. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MEME+SUITE%3A+tools+for+motif+discovery+and+searching%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">MEME SUITE: tools for motif discovery and searching.</a> Nucleic Acids Res. 37 (Web Server issue), W202-W208 (2009).</li>
<li>Sims, D., Sudbery, I., Ilott, N. E., Heger, A., Ponting, C. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sequencing+depth+and+coverage%3A+key+considerations+in+genomic+analyses%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Genet%22%5BJournal%5D)">Sequencing depth and coverage: key considerations in genomic analyses.</a> Nat Rev Genet. 15 (2), 121-132 (2014).</li>
<li>Landt, S. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ChIP-seq+guidelines+and+practices+of+the+ENCODE+and+modENCODE+consortia%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Res%22%5BJournal%5D)">ChIP-seq guidelines and practices of the ENCODE and modENCODE consortia.</a> Genome Res. 22 (9), 1813-1831 (2012).</li>
<li>Consortium, E. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+integrated+encyclopedia+of+DNA+elements+in+the+human+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">An integrated encyclopedia of DNA elements in the human genome.</a> Nature. 489 (7414), 57-74 (2012).</li>
<li>Mazzoni, E. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Embryonic+stem+cell-based+mapping+of+developmental+transcriptional+programs%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Embryonic stem cell-based mapping of developmental transcriptional programs.</a> Nat Methods. 8 (12), 1056-1058 (2011).</li>
<li>Kheradpour, P., Kellis, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematic+discovery+and+characterization+of+regulatory+motifs+in+ENCODE+TF+binding+experiments%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Systematic discovery and characterization of regulatory motifs in ENCODE TF binding experiments.</a> Nucleic Acids Res. 42 (5), 2976-2987 (2014).</li>
<li>Dugas, J. C., Tai, Y. C., Speed, T. P., Ngai, J., Barres, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+genomic+analysis+of+oligodendrocyte+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Functional genomic analysis of oligodendrocyte differentiation.</a> J Neurosci. 26 (43), 10967-10983 (2006).</li>
<li>Gilfillan, G. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Limitations+and+possibilities+of+low+cell+number+ChIP-seq%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Genomics%22%5BJournal%5D)">Limitations and possibilities of low cell number ChIP-seq.</a> BMC Genomics. 13, 645(2012).</li>
<li>Raskatov, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modulation+of+NF-kappaB-dependent+gene+transcription+using+programmable+DNA+minor+groove+binders%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Modulation of NF-kappaB-dependent gene transcription using programmable DNA minor groove binders.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (4), 1023-1028 (2012).</li>
<li>Cheneby, J., Gheorghe, M., Artufel, M., Mathelier, A., Ballester, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ReMap+2018%3A+an+updated+atlas+of+regulatory+regions+from+an+integrative+analysis+of+DNA-binding+ChIP-seq+experiments%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">ReMap 2018: an updated atlas of regulatory regions from an integrative analysis of DNA-binding ChIP-seq experiments.</a> Nucleic Acids Res. , (2017).</li>
<li>Yevshin, I., Sharipov, R., Valeev, T., Kel, A., Kolpakov, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GTRD%3A+a+database+of+transcription+factor+binding+sites+identified+by+ChIP-seq+experiments%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">GTRD: a database of transcription factor binding sites identified by ChIP-seq experiments.</a> Nucleic Acids Res. 45 (D1), D61-D67 (2017).</li>
<li>Kulakovskiy, I. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HOCOMOCO%3A+a+comprehensive+collection+of+human+transcription+factor+binding+sites+models%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">HOCOMOCO: a comprehensive collection of human transcription factor binding sites models.</a> Nucleic Acids Res. 41 (Database issue), D195-D202 (2013).</li>
<li>Jain, D., Baldi, S., Zabel, A., Straub, T., Becker, P. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Active+promoters+give+rise+to+false+positive+%27Phantom+Peaks%27+in+ChIP-seq+experiments%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Active promoters give rise to false positive 'Phantom Peaks' in ChIP-seq experiments.</a> Nucleic Acids Res. 43 (14), 6959-6968 (2015).</li>
<li>Gerstein, M. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Architecture+of+the+human+regulatory+network+derived+from+ENCODE+data%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Architecture of the human regulatory network derived from ENCODE data.</a> Nature. 489 (7414), 91-100 (2012).</li>
</ol>

Los autores declaran que no tienen intereses financieros que compiten.

Redes de regulación genética mamíferos son muy complejas. ChIP-seq es un potente método para investigar las interacciones de la proteína del genoma-ADN. Este protocolo incluye cómo se realiza Olig2 ChIP-seq con una cantidad baja de OPC purificada de cerebro de ratón (tan bajo como 20 mil células por reacción). El primer paso clave de este protocolo es la purificación de OPC de cerebro de ratón por immunopanning con el anticuerpo PDGFRα. Para la selección positiva de OPC con placas PDGFRα revestido, atan a menudo débil OP...

Es importante para el estudio de la proteína (o complejo de la proteína) enlaces de ADN y las marcas epigenéticas para construir redes de regulación transcripcionales implicados en varios procesos biológicos. En particular, la fijación de factores de transcripción al ADN genómico puede jugar un papel importante en la regulación de los genes, la diferenciación celular y el desarrollo de tejido. Una poderosa herramienta para el estudio de la regulación transcripcional y mecanismos epigenéticos es inmunoprecipitación de cromatina (ChIP). Debido a los rápidos avances en la tecnología de secuenciación de última generación, juntada con la secuencia de la DNA de alto rendimiento (ChIP-seq) la viruta se utiliza para el análisis de enlaces de proteínas de ADN y marcas epigenéticas1. Sin embargo, un protocolo estándar de ChIP-seq requiere unos 20 millones de células por reacción, lo que dificulta la aplicación de esta técnica cuando el número de células, como células primarias aisladas y poblaciones celulares raros.
Oligodendrocyte células de linaje como oligodendrocitos células de precursor del oligodendrocyte (OPC) se encuentran ampliamente distribuidas por todo el cerebro y son esenciales para el desarrollo y función del cerebro. Como un tipo de células precursoras, OPCs son capaces de auto renovación y diferenciación. OPC no sólo sirve como progenitores de oligodendrocitos sino también juega un papel importante en la propagación de la señalización neuronal mediante la comunicación con otros tipos de células de cerebro2. Estudios previos han sugerido que el desarrollo de oligodendrocyte está regulada por factores de transcripción específicos del linaje como Olig2 y Sox103,4. Estos factores de transcripción fueron encontrados para enlazar las regiones promotor o potenciador de algunos genes cruciales para influenciar su expresión durante la diferenciación y especificación de oligodendrocyte. Sin embargo, es difícil identificar el atascamiento de la DNA de proteína o complejo de la proteína de interés en OPC primario agudo purificada con un número muy limitado de las células.
Este protocolo describe cómo investigar sistemáticamente la immunoprecipitated de ADN genómico por Olig2 en OPCs de ratón purificado a escala del genoma utilizando la técnica de ChIP-seq. OPC de cerebro de ratón fueron purificado por immunopanning agudo y utilizado en un experimento de ChIP sin proliferación in vitro. Un número limitado de OPC puede obtenerse por immunopanning y es insuficiente para los experimentos estándar de ChIP-seq. En este documento, un protocolo de baja celular ChIP-seq con tan bajo como 20 mil células por reacción de ChIP para factores de transcripción se describe. En Resumen, reticuladas células fueron lisadas y sonicadas por un dispositivo de sonicación para esquilar la cromatina. La cromatina esquilada se incubó con anticuerpos Olig2 como proteína granos A cubierto para precipitar el ADN genómico del anticuerpo enlazado de Olig2. Después de la elución de perlas de proteína A cubierto y cross-linking inversa, se purificó ADN genómico precipitado por anticuerpos Olig2 por extracción con fenol-cloroformo. El producto resultante fue cuantificado y sometido a T-tailing, primer recocido cambio de plantilla y extensión, además de adaptadores y amplificación, selección de tamaño de la biblioteca y depuración los pasos para la construcción de la biblioteca de ChIP-seq.
Después de la secuencia, se analizó la calidad de la materia prima Lee de la muestra preparada con anticuerpo de factor de transcripción Olig2 y la muestra de control. Baja calidad de pares de bases y que contienen adaptador leen fragmentos fueron recortados. Lee a continuación, recortado fueron alineado con el genoma de referencia de ratón. Las regiones genómicas que se enriquecieron significativamente para Lee ChIP, en comparación con la muestra de control, se detectaron como picos. Picos significativos, que representan potenciales sitios de unión de factores de transcripción, se filtra y visualizados en un navegador de genoma.
En particular, el método descrito en el presente Protocolo puede ser ampliamente utilizado para ChIP-seq de otros factores de transcripción con cualquier tipo de celular de un número limitado.

<table><tbody><tr><td><fuerte>Reactivo/ Equipo</fuerte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Banderiaea simplicifolia lectina 1</td><td>Vector Laboratories</td><td># L-1100</td><td></td></tr><tr><td>Rata anticuerpo anti-PDGFRa</td><td>BD Bioscience</td><td># 558774</td><td></td></tr><tr><td>Kit de disociación de tejido neural (P)</td><td>MACS Miltenyi Biotec</td><td># 130-092-628</td><td></td></tr><tr><td>Tecnologías</td><td></td> <td>Accutase STEMCELL# 07920</td><td></td></tr><tr><td>TRIzol</td><td>Thermo Fisher</td><td># 15596026</td><td></td></tr><tr><td>Anti-NG2 Sulfato de Condroitina Anticuerpo Proteoglicano</td><td>Millipore</td><td># AB5320</td><td></td></tr><tr><td>Dispositivo de sonicación Bioruptor Pico</td><td>Diagenode</td><td># B01060001</td><td></td></tr><tr><td>True MicroChIP</td><td>kit Diagenode</td><td># C01010130</td><td></td></tr><tr><td>Fenol:Cloroformo:Alcohol isoamílico (25:24:1, v/v)</td><td>Thermo Fisher</td><td># 15593031</td><td></td></tr><tr><td>NucleoSpin Gel y kit de limpieza de PCR</td><td>MACHEREY-NAGEL #</td> <td>740609</td><td></td></tr><tr><td>Quant-iT PicoGreen dsDNA Kit</td><td>Thermo Fisher</td><td># P11496</td><td></td></tr><tr><td>DNA SMART ChIP-Seq</td><td>kit Clontech Laboratories</td><td># 634865</td><td></td></tr><tr><td>Agencourt AMPure XP</td><td>Beckman Voulter</td><td># A63880</td><td></td></tr><tr><td>GlycoBlue</td><td>Thermo Fisher</td><td># AM9516</td><td></td></tr><tr><td>pico-verde</td><td>Thermo Fisher</td><td># P11496</td><td></td></tr><tr><td>D-PBS</td><td>Thermo Fisher</td><td># 14190-144</td><td></td></tr><tr><td>SYBR Mezcla maestra verde</td><td>Bio-Rad Laboratories</td><td># 1725124</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F12</td><td>Fisher Scientific</td><td># 11-320-033</td><td></td></tr><tr><td>Penicilina-Estreptomicina (P/S)</td><td>Fisher Scientific</td><td># 15140122</td><td></td></tr><tr><td>Suplemento N-2</td><td>Fisher Scientific</td><td># 17502048</td><td></td></tr><tr><td>B-27 Suplemento</td><td>Fisher Scientific</td><td># 17504044</td><td></td></tr><tr><td>insulina</td><td>Sigma</td><td># I6634</td><td>Prepare una solución de insulina de 0,5 mg/ml disolviendo 5 mg de insulina en 10 ml de agua y 50 &mu; l de 1 N HCl.</td></tr><tr><td>Albúmina sérica bovina, apta para cultivo celular (BSA)</td><td>Sigma</td><td># A4161</td><td>Prepare una solución de BSA al 4% disolviendo 4 g de BSA en 100 ml de D-PBS y ajuste el pH a 7,4</td></tr><tr><td>Proteína básica del factor de crecimiento de fibroblastos, recombinante humano (bFGF)</td><td>EMD Millipore</td><td># GF003</td><td></td></tr><tr><td>PDGF-AA</td><td>VWR</td><td># 102061-188</td><td></td></tr><tr><td>poli-D-lisina</td><td>VWR</td><td># IC15017510</td><td>Prepare 1 mg/ml de solución de poli-D-lisina disolviendo 10 mg de poli-D-lisina en 10 ml de agua y diluya 100 veces cuando lo use.</td></tr><tr><td>Placas de Petri Desechables Falcon, Estériles, Corning, 100x15mm</td><td>VWR</td><td># 25373-100</td><td></td></tr><tr><td>Placas de Petri Desechables Falcon, Estériles, Corning, 150x15mm</td><td>VWR</td><td># 25373-187</td><td></td></tr><tr><td>HBSS, 10X, sin Calcio, sin Magnesio, sin Fenol</td><td>Red Fisher Scientific</td><td># 14185-052</td><td></td></tr><tr><td>Trypan Blue</td><td>Stemcell Technologies</td><td># 07050</td><td></td></tr><tr><td>Cóctel de inhibidores de proteasa</td><td>Sigma</td><td># 11697498001</td><td></td></tr><tr><td>Software</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>FastQC</td><td>[10] http://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/</td><td></td> <td>Obtención de métricas de control de calidad de lecturas sin procesar y recortadas</td></tr><tr><td>Trimmomatic 0.33</td><td>[11] http://www.usadellab.org/cms/?page=trimmomatic</td><td></td><td>Recorte y filtrado de lecturas</td></tr> <tr><td>sin procesarGENCODE mm10</td><td>ftp://ftp.sanger.ac.uk/pub/gencode/Gencode_mouse/release_M15/GRCm38.primary_assembly.genome.fa.gz</td><td></td><td>Genoma de referencia del ratón</td></tr><tr><td>Bowtie2 2.2.4</td><td>[12] http://bowtie-bio.sourceforge.net/bowtie2/index.shtml</td><td></td><td>Alineación de lecturas a un genoma de referencia</td></tr><tr><td>SAMTools 1.5</td><td>[13] http://samtools.sourceforge.net/</td><td></td> <td>Convertir un archivo SAM a formato BAM</td></tr><tr><td>HOMER 4.9.1</td><td>[14] http://homer.ucsd.edu/homer/</td><td></td> <td>Creación de un directorio de etiquetas y anotación de regiones genómicas enriquecidas con símbolos genéticos</td></tr><tr><td>R 3.2.2</td><td>[15] https://www.R-project.org/</td><td></td> <td>Programación de scripts y ejecución de funciones</td></tr><tr><td>SPP 1.13</td><td>[16] https://github.com/hms-dbmi/spp</td><td></td><td>Creación de un gráfico de correlación cruzada de hebras</td></tr><tr><td>MACS2 2.2.4</td><td>[17] https://github.com/taoliu/MACS</td><td></td><td>Encontrar regiones de enriquecimiento de ChIP sobre el control</td></tr><tr><td>BEDTools 2.25</td><td>[18] http://bedtools.readthedocs.io/en/latest/</td><td></td> <td>Aritmética del genoma</td></tr><tr><td>bedGraphToBigWig</td><td>http://hgdownload.cse.ucsc.edu/admin/exe/</td><td></td> <td>Convertir el archivo bedGraph en</td></tr><tr><td>un navegador IGV bigwig 2.3.58</td><td>[19] http://software.broadinstitute.org/software/igv/</td><td></td> <td>Visualización y navegación de picos significativos de ChIP-seq Microsoft</td></tr><tr><td>Excel</td><td></td><td></td><td>Programa Spreasheet</td></tr><tr><td>Lista negra de ENCODE</td><td>https://sites.google.com/site/anshulkundaje/projects/blacklists</td><td></td><td>Picos de filtrado</td></tr><tr><td>mm10.chrom.sizes</td><td>http://hgdownload.cse.ucsc.edu/goldenPath/mm10/bigZips/mm10.chrom.sizes.</td><td></td><td>Conversión del archivo bedGraph en la</td></tr><tr><td>base de datos de motivos de ENCODE</td><td>[25] http://compbio.mit.edu/encode-motifs/</td><td></td> <td>Se requiere una base de datos completa de motivos para el enriquecimiento de motivos</td></tr><tr><td>MEME-ChIP</td><td>[20] http://meme-suite.org/index.html</td><td></td><td>Análisis de enriquecimiento de motivos y descubrimiento</td></tr> <tr><td>de motivosNombres de cebadores utilizados para qPCR</td><td></td><td></td><td><secuencias > cebadores fuertes utilizadas para qPCR</td></tr><tr><td>Mbp-F:</td><td></td><td></td><td>CTATAAATCGGCTCACAAGG</td></tr><tr><td>Mbp-R:</td><td></td><td></td><td>AGGCGGTTATTAAGAAGC</td></tr><tr><td>Iba1-F:</td><td></td><td></td><td>ACTGCCAGCCTAAGACAACC</td></tr><tr><td>Iba1-R:</td><td></td><td></td><td>GCTTTTCCTCCCTGCAAATCC</td></tr><tr><td>Mog-F:</td><td></td><td></td><td>GGCTTCTTGGAGGAAGGGAC</td></tr><tr><td>Mog-R:</td><td></td><td></td><td>TGAATTGTCCTGCATAGCTGC</td></tr><tr><td>GAPDH-F</td><td></td><td></td><td>ATGACATCAAGAAGGTGGTG</td></tr><tr><td>GAPDH-R</td><td></td><td></td><td>CATACCAGGAAATGAGCTTG</td></tr><tr><td>Tuj1-F</td><td></td><td></td><td>TTTTCGTCTCTAGCCGCGTG</td></tr><tr><td>Tuj1-R</td><td></td><td></td><td>GATGACCTCCCAGAACTTGGC</td></tr><tr><td>PDGFR&alpha;-F</td><td></td><td></td><td>AGAGTTACACGTTTGAGCTGTC</td></tr><tr><td>PDGFR&alpha;-R</td><td></td><td></td><td>GTCCCTCCACGGTACTCCT</td></tr></tbody></table>

identificar sitios de transcripción factor olig2 unión genómica en agudo purificada pdgfrα + células por inmunoprecipitación de cromatina celular bajo análisis de la secuencia

Identifying Transcription Factor Olig2 Genomic Binding Sites in Acutely Purified PDGFR&#945;+ Cells by Low-cell Chromatin Immunoprecipitation Sequencing Analysis

En células de mamífero, transcripción genética está regulado de una forma específica de tipo celular por las interacciones de los factores transcripcionales con DNA genómico. Factores de transcripción específicos del linaje se consideran que desempeñan un papel esencial en la diferenciación durante el desarrollo y especificación de la célula. ChIP, juntada con la secuencia de la DNA de alto rendimiento (ChIP-seq) es ampliamente utilizado para analizar los sitios de unión de todo el genoma de los factores de transcripción (o su complejo asociado) para extracción de ADN genómico. Sin embargo, un gran número de células se requiere para una reacción estándar de ChIP, que dificulta el estudio del número limitado de células primarias aisladas o poblaciones celulares raros. Para entender el mecanismo de regulación de transcripción específicos del linaje de oligodendrocyte factor Olig2 en el ratón agudo purificado OPC, un método detallado usando ChIP-seq para identificar los sitios de unión de todo el genoma de Olig2 (o Olig2 complejo) se muestra. En primer lugar, el protocolo explica cómo purificar el alfa del receptor de factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGFRα) OPC positiva de cerebro de ratón. A continuación, Olig2 anticuerpo mediada por ChIP y se llevan a cabo la construcción de la biblioteca. La última parte describe el software de Bioinformática y procedimientos utilizados para el análisis de Olig2 ChIP-seq. En Resumen, este papel divulga un método para analizar los enlaces de todo el genoma del factor transcripcional Olig2 en cerebro agudo purificada OPC.

Fue realizada bajo celular ChIP-seq y bioinformáticas de análisis se realizaron para investigar las posibles interacciones del factor transcripcional Olig2 con ADN genómico purificado agudo cerebro OPC. La figura 1 muestra un flujo de trabajo general de la experimental y los procedimientos de análisis de datos. En este protocolo, cerebros de ratones postnatales se disocian en una suspensión unicelular. Después de la disociación del tejido, immunopanning reali...

Aquí presentamos un protocolo que está diseñado para analizar la Unión de todo el genoma del oligodendrocyte del factor de transcripción 2 (Olig2) en células de cerebro agudo purificada oligodendrocyte precursoras (OPC) por la realización de inmunoprecipitación de cromatina baja-celular (ChIP) , preparación de biblioteca, alto rendimiento secuenciación y análisis Bioinformático de los datos.

Identificar sitios de transcripción Factor Olig2 Unión genómica en agudo purificada PDGFRα + células por inmunoprecipitación de cromatina celular bajo análisis de la secuencia

In mammalian cells, gene transcription is regulated in a cell type specific manner by the interactions of transcriptional factors with genomic DNA. ...

El objetivo general de este experimento es analizar la unión a todo el genoma del factor de transcripción dos de oligodendrocitos en células precursoras de oligodendrocitos cerebrales agudamente purificadas mediante la realización de inmunopanning, inmunoprecipitación de cromatina de baja célula, secuenciación de alto rendimiento y análisis de datos bioinformáticos. Este método es una poderosa herramienta para estudiar la regulación transcripcional de todo el genoma y los mecanismos epigenéticos, que desempeñan un papel importante en la diferenciación y el desarrollo celular. La principal ventaja de esta técnica es que es ampliamente aplicable en ChIP-seq de otros factores de transcripción con cualquier tipo de célula de número limitado, incluyendo células primarias agudamente purificadas sin proliferación in vitro.La demostración del procedimiento estará a cargo de Yanan You, un postdoc de mi laboratorio. Es coautora de este artículo. Para seleccionar las células PDGFR-alfa positivas, prepare una placa para la inmunopanificación.Prepare otras dos placas para las células endoteliales y el agotamiento de la microglía. Luego, cubra una placa de Petri de 10 centímetros con 30 microlitros de inmunoglobulina anti-ratas de cabra. Luego, agite la placa para asegurarse de que toda la superficie de la placa esté cubierta uniformemente con la solución de recubrimiento.Deje la placa de Petri durante la noche a cuatro grados centígrados. A continuación, diluir 40 microlitros de anticuerpo anti-PDGFR-alfa de rata con 12 mililitros de DPBS que contengan 0,2% de albúmina sérica bovina. A continuación, lave la placa recubierta de inmunoglobulina G con 10 mililitros de 1X DPBS durante tres veces consecutivas.A continuación, incubar la placa recubierta de inmunoglobulina G con solución de anticuerpos PDGFR-alfa a temperatura ambiente durante cuatro horas. Después de cuatro horas, agregue con cuidado DPBS a lo largo de la pared lateral de la placa para lavar la placa recubierta de anticuerpos anti-PDGFR-alfa para ratas tres veces. No moleste la superficie recubierta de la placa.A continuación, utilice 20 mililitros de DPBS con 2,3 microgramos por mililitro de BSL-1 para recubrir dos placas de Petri de 15 centímetros durante dos horas. Después de la incubación, agregue con cuidado 20 mililitros de DPBS a lo largo de la pared lateral de la placa para lavar la placa BSL-1 tres veces. No moleste la superficie recubierta.Después del lavado, centrifugar la suspensión unicelular a 300 veces g durante 10 minutos a temperatura ambiente. Después de la centrifugación, agregue 15 mililitros de tampón de inmunopanning al pellet de la célula. A continuación, incubar las suspensiones unicelulares de dos cerebros de ratón de forma secuencial en dos placas de Petri recubiertas de BSL-1.Luego, deje los platos durante 15 minutos a temperatura ambiente. Agite la placa cada cinco minutos durante la incubación. Luego, agite suavemente la placa para recoger todas las células no adherentes de la suspensión celular.A continuación, siembre las células en la placa recubierta de anticuerpos PDGFR-alfa de rata. Incubar la placa durante 45 minutos a temperatura ambiente. Al final de los 45 minutos, vuelva a girar el plato.Luego, deseche la suspensión de celdas. A continuación, enjuague la placa con DPBS ocho veces para eliminar las células no adherentes. Examine la placa bajo un microscopio.A continuación, agregue la solución de desprendimiento de células en la placa recubierta de anticuerpos PDGFR-alfa de rata. Luego, incuba la placa a 37 grados centígrados durante 10 minutos. Mientras tanto, agite la placa para desalojar las células adherentes y examínela bajo el microscopio.A continuación, centrifugar las células a 300 veces g a temperatura ambiente. Después de la centrifugación, vuelva a suspender el pellet celular con un mililitro de medio de cultivo celular OPC. Luego, cuente las células utilizando el método de exclusión de azul de tripano en un hemocitómetro.Después de contar en un hemocitómetro, agregue 20, 000 OPC purificadas en un mililitro de medio de cultivo celular OPC para la reacción ChIP. A continuación, añade 27 microlitros de formaldehído al 36,5% a temperatura ambiente durante 10 minutos. Esto arreglará las celdas.Después de 10 minutos, agregue 50 microlitros de glicina 2.5 molar en las celdas fijas durante cinco minutos a temperatura ambiente. La adición de glicina detendrá la reticulación del ADN y las proteínas. A continuación, lavar las células reticuladas con un mililitro de tampón HBSS con cóctel de inhibidores de la proteasa.A continuación, centrifugar las células en una máquina centrífuga preenfriada a 300 veces g a cuatro grados centígrados. Después de la reticulación de las OPC purificadas, las células reticuladas deben lavarse con una solución helada de HBSS, y los pasos restantes de ChIP deben llevarse a cabo a cuatro grados, de lo contrario, el anticuerpo no puede precipitar el ADN genómico correctamente. Luego, agregue 25 microlitros de tampón de lisis completo al pellet celular y déjelo en hielo durante cinco minutos.A continuación, pipetee 75 microlitros de tampón HBSS helado con cóctel de inhibidores de la proteasa. A continuación, cizallar la cromatina del lisado celular en un sistema de sonicación preenfriado con cinco ciclos de 30 segundos de encendido y 30 segundos de apagado. Una vez cortada la cromatina, centrifugar el lisado celular a 14.000 veces g durante 10 minutos a cuatro grados centígrados.Al final de la centrifugación, recoja el sobrenadante. A continuación, diluir 100 microlitros de la cromatina cortada con un volumen igual de tampón ChIP helado con inhibidor de la proteasa. A continuación, agregue un microlitro de anticuerpo anti-Olig2 de conejo a 180 microlitros de la cromatina cortada diluida.Incubar los tubos en una rueda giratoria durante 16 horas a cuatro grados centígrados a 40 revoluciones por minuto. A continuación, añada 10 microlitros de perlas recubiertas de proteína A prelavadas al tubo de reacción ChIP en una cámara frigorífica. De nuevo, incube los tubos ChIP a cuatro grados centígrados durante otras dos horas en la rueda giratoria.Después de dos horas, deje el tubo de reacción ChIP en la rejilla magnética durante un minuto. A continuación, lave el pellet de perlas con 100 microlitros de cuatro tampones de lavado cada uno durante cuatro minutos en una rueda giratoria a cuatro grados centígrados. A continuación, añada 200 microlitros de tampón de elución al pellet de perlas.Incubar el tubo de reacción a 65 grados centígrados durante cuatro horas. Una vez que el ADN bicatenario se desnaturaliza, desfosforila el extremo de tres primos del ADN monocatenario añadiendo fosfatasa alcalina de camarón. A continuación, se añade la cola de poli-T al ADN monocatenario utilizando la desoxinucleotidil transferasa terminal.A continuación, recoche el cebador de ADN poly-dA en la plantilla de ADN monocatenario. A continuación, amplifique la biblioteca de secuencias ChIP utilizando cebadores directos e inversos para la indexación. El número de ciclos de PCR para la preparación de la biblioteca depende de la cantidad de ADN inicial.Una buena preparación de la biblioteca requiere una cuantificación precisa de la cantidad de ADN de entrada. Demasiados o muy pocos ciclos de PCR pueden influir en la concentración de la biblioteca, así como en la complejidad, lo que da lugar a artefactos de PCR. Utilice perlas paramagnéticas para seleccionar los fragmentos que van de 250 a 500 pares de bases de la biblioteca de secuencias ChIP amplificadas por PCR.Utilice un dispositivo de electroforesis capilar de chip microfluídico para examinar la calidad de la biblioteca de secuencias ChIP seleccionada. Para evaluar la pureza de las OPC inmunopanificadas, se realizan estudios de inmunotinción. Al utilizar el anticuerpo NG2 del marcador de linaje OPC, se muestra que la mayoría de las células inmunopanificadas con el anticuerpo PDGFR-alfa son NG2 positivas.A continuación, se realiza una PCR cuantitativa para verificar el enriquecimiento de PDGFR-alfa. El gráfico obtenido muestra poca expresión de Tuj1, un marcador neuronal que indica un enriquecimiento significativo de PDGFR-alfa en comparación con las células cerebrales disociadas. Se obtienen resultados similares que muestran poca expresión para todos los demás marcadores, como GFAP, Mog y Mbp, lo que indica un enriquecimiento de PDGFR-alfa.A continuación, se analiza la calidad de la biblioteca de secuencias ChIP. El electroferograma representa un pico claro para el factor de transcripción Olig2 que oscila entre 250 y 500 pares de bases después de la selección del tamaño del producto de PCR de la biblioteca. Aquí, el histograma muestra la clonalidad de la etiqueta, para verificar las métricas de control de calidad obtenidas antes de la llamada máxima.La barra indica que más del 90% de las lecturas se asignan a una sola ubicación genómica. A continuación, se obtiene un gráfico de correlación de hebras, que representa un pico enriquecido correspondiente a la longitud del fragmento predominante. En el gráfico, las líneas rojas representan la longitud de lectura a 50 pares de bases y la longitud del fragmento a 130 pares de bases, respectivamente, lo que indica datos de alta calidad.Una vez dominada, esta técnica se puede realizar en tres días si se realiza correctamente. Después de su desarrollo, esta técnica allanó el camino para que los investigadores exploraran el sitio de unión al ADN de todo el genoma de los factores de transcripción y otras proteínas en células primarias o células raras. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo purificar OPC primarias del cerebro de ratón mediante inmunopaneo y cómo realizar el experimento ChIP-seq utilizando un número bajo de células.

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Neurociencia

Aquí estamos presentando una inmunoprecipitación de cromatina (CHIP) Procedimiento para el análisis de localización en todo el genoma de las isoformas de la proteína que se diferencian en un dominio de unión a las histonas. Estamos aplicando a CHIP-Seq análisis para identificar los objetivos de la histona desmetilasa KDM5A/JARID1A/RBP2.

Análisis de todo el genoma con chip para identificar objetivos específicos para cada isoforma Gene

Chirp es una técnica novedosa y rápida a los sitios de unión del Mapa del Genoma de los ARNs no codificantes de largo (lncRNAs). El método tiene la ventaja de la especificidad de los oligonucleótidos antisentido baldosas para permitir la enumeración de los sitios genómicos lncRNA enlazados.

Aislamiento de la cromatina mediante la purificación de ARN (chirp)

Este video describe el protocolo para el ensayo de inmunoprecipitación de cromatina (ChIP), que es una técnica clásica para demostrar las interacciones proteína-ADN. Esta técnica se utiliza para identificar genes diana en células de leucemia linfocítica crónica humana.

Ensayo de inmunoprecipitación de cromatina: una técnica para estudiar las interacciones proteína-ADN en células

En este video, demostramos la técnica de inmunoprecipitación de cromatina para identificar sitios de unión a proteínas en regiones específicas del ADN genómico de células precursoras de oligodendrocitos a través de la inmunoprecipitación selectiva de fragmentos de cromatina unidos a proteínas. Este método ayuda a estudiar la interacción de varias proteínas reguladoras, incluidos los factores de transcripción implicados en la regulación génica.

Inmunoprecipitación de cromatina para identificar sitios de unión a proteínas diana en el ADN genómico

Se describe un método robusto para la inmunoprecipitación de la cromatina utilizando células T primarias. El método se basa en los enfoques estándar, pero utiliza un conjunto específico de condiciones y reactivos que mejoran la eficiencia de unas cantidades limitadas de células. Es importante destacar que, se presenta una descripción detallada de la fase de análisis de datos.

Immunoprecipitation cromatina eficiente utilizando limitación de las cantidades de biomasa

La combinación de inmunoprecipitación de la cromatina y la secuenciación de ultra-alto rendimiento (chip-ss) puede identificar y mapear las interacciones proteína-ADN en un tejido o línea celular dada. Contorno es cómo generar una plantilla de chip de alta calidad para la posterior secuenciación, utilizando la experiencia con el factor de transcripción TCF7L2 como un ejemplo.

Generación de Plantilla ADN Immunoprecipitation cromatina alta calidad para la secuenciación de alto rendimiento (chip-ss)

En este trabajo proporcionamos un flujo de trabajo experimental de cómo se pueden identificar y validar experimentalmente los potenciadores activos.

Predicción y validación de los elementos reguladores de genes activados durante ácido retinoico inducida por la diferenciación de células madre embrionarias

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Análisis en tiempo real del Factor de transcripción vinculante, transcripción, traducción y rotación para mostrar los eventos globales durante la activación celular

Leucemia linfocítica crónica (LLC) es la leucemia más común en el mundo occidental. Factores de transcripción NFAT son importantes reguladores del desarrollo y activación de numerosos tipos de células. Aquí, presentamos un protocolo para el uso de inmunoprecipitación de cromatina (ChIP) en las células CLL humanas para identificar los genes de la nueva diana de NFAT2.

Un ensayo de inmunoprecipitación de cromatina para identificar los Genes Diana de novela NFAT2 en leucemia linfocítica crónica

Informamos de la aplicación de la captura cuantitativa de conformación cromosómica seguida de la secuenciación de alto rendimiento en cuerpos embrionarios generados a partir de células madre embrionarias. Esta técnica permite identificar y cuantificar los contactos entre potenciadores putativos y regiones promotoras de un gen dado durante la diferenciación de células madre embrionarias.

Identificación de contactos potenciadores-promotores en cuerpos embrionarios por captura cuantitativa de conformación cromosómica (4C)

Los dominios intrínsecamente desordenados son importantes para la función del factor de transcripción de fusión oncogénica. Para dirigirse terapéuticamente a estas proteínas, se requiere una comprensión más detallada de los mecanismos reguladores empleados por estos dominios. Aquí, utilizamos transcriptómica para mapear características estructurales importantes del dominio EWS intrínsecamente desordenado en el sarcoma de Ewing.

Mapeo de las relaciones estructura-función de los factores de transcripción oncogénicos desordenados utilizando el análisis transcriptómico

Aprenda a analizar la unión genómica de Olig2 en células precursoras de oligodendrocitos purificadas mediante ChIP de bajas células y secuenciación masiva. Este método permite estudiar regulación transcripcional y mecanismos epigenéticos en diferenciación celular.

Identificar sitios de transcripción Factor Olig2 Unión genómica en agudo purificada PDGFRα + células por inmunoprecipitación de cromatina celular bajo análisis de la secuencia (Video) | JoVE Journal

Identificar sitios de transcripción Factor Olig2 Unión genómica en agudo purificada PDGFRα + células por inmunoprecipitación de cromatina celular bajo análisis de la secuencia

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