Identificar sitios de transcripción Factor Olig2 Unión genómica en agudo purificada PDGFRα + células por inmunoprecipitación de cromatina celular bajo análisis de la secuencia

El objetivo general de este experimento es analizar la unión a todo el genoma del factor de transcripción dos de oligodendrocitos en células precursoras de oligodendrocitos cerebrales agudamente purificadas mediante la realización de inmunopanning, inmunoprecipitación de cromatina de baja célula, secuenciación de alto rendimiento y análisis de datos bioinformáticos. Este método es una poderosa herramienta para estudiar la regulación transcripcional de todo el genoma y los mecanismos epigenéticos, que desempeñan un papel importante en la diferenciación y el desarrollo celular. La principal ventaja de esta técnica es que es ampliamente aplicable en ChIP-seq de otros factores de transcripción con cualquier tipo de célula de número limitado, incluyendo células primarias agudamente purificadas sin proliferación in vitro.

La demostración del procedimiento estará a cargo de Yanan You, un postdoc de mi laboratorio. Es coautora de este artículo. Para seleccionar las células PDGFR-alfa positivas, prepare una placa para la inmunopanificación.

Prepare otras dos placas para las células endoteliales y el agotamiento de la microglía. Luego, cubra una placa de Petri de 10 centímetros con 30 microlitros de inmunoglobulina anti-ratas de cabra. Luego, agite la placa para asegurarse de que toda la superficie de la placa esté cubierta uniformemente con la solución de recubrimiento.

Deje la placa de Petri durante la noche a cuatro grados centígrados. A continuación, diluir 40 microlitros de anticuerpo anti-PDGFR-alfa de rata con 12 mililitros de DPBS que contengan 0,2% de albúmina sérica bovina. A continuación, lave la placa recubierta de inmunoglobulina G con 10 mililitros de 1X DPBS durante tres veces consecutivas.

A continuación, incubar la placa recubierta de inmunoglobulina G con solución de anticuerpos PDGFR-alfa a temperatura ambiente durante cuatro horas. Después de cuatro horas, agregue con cuidado DPBS a lo largo de la pared lateral de la placa para lavar la placa recubierta de anticuerpos anti-PDGFR-alfa para ratas tres veces. No moleste la superficie recubierta de la placa.

A continuación, utilice 20 mililitros de DPBS con 2,3 microgramos por mililitro de BSL-1 para recubrir dos placas de Petri de 15 centímetros durante dos horas. Después de la incubación, agregue con cuidado 20 mililitros de DPBS a lo largo de la pared lateral de la placa para lavar la placa BSL-1 tres veces. No moleste la superficie recubierta.

Después del lavado, centrifugar la suspensión unicelular a 300 veces g durante 10 minutos a temperatura ambiente. Después de la centrifugación, agregue 15 mililitros de tampón de inmunopanning al pellet de la célula. A continuación, incubar las suspensiones unicelulares de dos cerebros de ratón de forma secuencial en dos placas de Petri recubiertas de BSL-1.

Luego, deje los platos durante 15 minutos a temperatura ambiente. Agite la placa cada cinco minutos durante la incubación. Luego, agite suavemente la placa para recoger todas las células no adherentes de la suspensión celular.

A continuación, siembre las células en la placa recubierta de anticuerpos PDGFR-alfa de rata. Incubar la placa durante 45 minutos a temperatura ambiente. Al final de los 45 minutos, vuelva a girar el plato.

Luego, deseche la suspensión de celdas. A continuación, enjuague la placa con DPBS ocho veces para eliminar las células no adherentes. Examine la placa bajo un microscopio.

A continuación, agregue la solución de desprendimiento de células en la placa recubierta de anticuerpos PDGFR-alfa de rata. Luego, incuba la placa a 37 grados centígrados durante 10 minutos. Mientras tanto, agite la placa para desalojar las células adherentes y examínela bajo el microscopio.

A continuación, centrifugar las células a 300 veces g a temperatura ambiente. Después de la centrifugación, vuelva a suspender el pellet celular con un mililitro de medio de cultivo celular OPC. Luego, cuente las células utilizando el método de exclusión de azul de tripano en un hemocitómetro.

Después de contar en un hemocitómetro, agregue 20, 000 OPC purificadas en un mililitro de medio de cultivo celular OPC para la reacción ChIP. A continuación, añade 27 microlitros de formaldehído al 36,5% a temperatura ambiente durante 10 minutos. Esto arreglará las celdas.

Después de 10 minutos, agregue 50 microlitros de glicina 2.5 molar en las celdas fijas durante cinco minutos a temperatura ambiente. La adición de glicina detendrá la reticulación del ADN y las proteínas. A continuación, lavar las células reticuladas con un mililitro de tampón HBSS con cóctel de inhibidores de la proteasa.

A continuación, centrifugar las células en una máquina centrífuga preenfriada a 300 veces g a cuatro grados centígrados. Después de la reticulación de las OPC purificadas, las células reticuladas deben lavarse con una solución helada de HBSS, y los pasos restantes de ChIP deben llevarse a cabo a cuatro grados, de lo contrario, el anticuerpo no puede precipitar el ADN genómico correctamente. Luego, agregue 25 microlitros de tampón de lisis completo al pellet celular y déjelo en hielo durante cinco minutos.

A continuación, pipetee 75 microlitros de tampón HBSS helado con cóctel de inhibidores de la proteasa. A continuación, cizallar la cromatina del lisado celular en un sistema de sonicación preenfriado con cinco ciclos de 30 segundos de encendido y 30 segundos de apagado. Una vez cortada la cromatina, centrifugar el lisado celular a 14.000 veces g durante 10 minutos a cuatro grados centígrados.

Al final de la centrifugación, recoja el sobrenadante. A continuación, diluir 100 microlitros de la cromatina cortada con un volumen igual de tampón ChIP helado con inhibidor de la proteasa. A continuación, agregue un microlitro de anticuerpo anti-Olig2 de conejo a 180 microlitros de la cromatina cortada diluida.

Incubar los tubos en una rueda giratoria durante 16 horas a cuatro grados centígrados a 40 revoluciones por minuto. A continuación, añada 10 microlitros de perlas recubiertas de proteína A prelavadas al tubo de reacción ChIP en una cámara frigorífica. De nuevo, incube los tubos ChIP a cuatro grados centígrados durante otras dos horas en la rueda giratoria.

Después de dos horas, deje el tubo de reacción ChIP en la rejilla magnética durante un minuto. A continuación, lave el pellet de perlas con 100 microlitros de cuatro tampones de lavado cada uno durante cuatro minutos en una rueda giratoria a cuatro grados centígrados. A continuación, añada 200 microlitros de tampón de elución al pellet de perlas.

Incubar el tubo de reacción a 65 grados centígrados durante cuatro horas. Una vez que el ADN bicatenario se desnaturaliza, desfosforila el extremo de tres primos del ADN monocatenario añadiendo fosfatasa alcalina de camarón. A continuación, se añade la cola de poli-T al ADN monocatenario utilizando la desoxinucleotidil transferasa terminal.

A continuación, recoche el cebador de ADN poly-dA en la plantilla de ADN monocatenario. A continuación, amplifique la biblioteca de secuencias ChIP utilizando cebadores directos e inversos para la indexación. El número de ciclos de PCR para la preparación de la biblioteca depende de la cantidad de ADN inicial.

Una buena preparación de la biblioteca requiere una cuantificación precisa de la cantidad de ADN de entrada. Demasiados o muy pocos ciclos de PCR pueden influir en la concentración de la biblioteca, así como en la complejidad, lo que da lugar a artefactos de PCR. Utilice perlas paramagnéticas para seleccionar los fragmentos que van de 250 a 500 pares de bases de la biblioteca de secuencias ChIP amplificadas por PCR.

Utilice un dispositivo de electroforesis capilar de chip microfluídico para examinar la calidad de la biblioteca de secuencias ChIP seleccionada. Para evaluar la pureza de las OPC inmunopanificadas, se realizan estudios de inmunotinción. Al utilizar el anticuerpo NG2 del marcador de linaje OPC, se muestra que la mayoría de las células inmunopanificadas con el anticuerpo PDGFR-alfa son NG2 positivas.

A continuación, se realiza una PCR cuantitativa para verificar el enriquecimiento de PDGFR-alfa. El gráfico obtenido muestra poca expresión de Tuj1, un marcador neuronal que indica un enriquecimiento significativo de PDGFR-alfa en comparación con las células cerebrales disociadas. Se obtienen resultados similares que muestran poca expresión para todos los demás marcadores, como GFAP, Mog y Mbp, lo que indica un enriquecimiento de PDGFR-alfa.

A continuación, se analiza la calidad de la biblioteca de secuencias ChIP. El electroferograma representa un pico claro para el factor de transcripción Olig2 que oscila entre 250 y 500 pares de bases después de la selección del tamaño del producto de PCR de la biblioteca. Aquí, el histograma muestra la clonalidad de la etiqueta, para verificar las métricas de control de calidad obtenidas antes de la llamada máxima.

La barra indica que más del 90% de las lecturas se asignan a una sola ubicación genómica. A continuación, se obtiene un gráfico de correlación de hebras, que representa un pico enriquecido correspondiente a la longitud del fragmento predominante. En el gráfico, las líneas rojas representan la longitud de lectura a 50 pares de bases y la longitud del fragmento a 130 pares de bases, respectivamente, lo que indica datos de alta calidad.

Una vez dominada, esta técnica se puede realizar en tres días si se realiza correctamente. Después de su desarrollo, esta técnica allanó el camino para que los investigadores exploraran el sitio de unión al ADN de todo el genoma de los factores de transcripción y otras proteínas en células primarias o células raras. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo purificar OPC primarias del cerebro de ratón mediante inmunopaneo y cómo realizar el experimento ChIP-seq utilizando un número bajo de células.