Grabación y modulación de la actividad epileptiforme en rebanadas de cerebro de roedor juntada a arreglos de microelectrodos

Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la neuromodulación para el tratamiento de la epilepsia, como qué área del cerebro y protocolo de estimulación son los más adecuados. La principal ventaja de esta técnica es que los cortes de cerebro de roedores representan un modelo simplificado y realista de los circuitos cerebrales, mientras que las matrices de microelectrodos permiten múltiples puntos de observación a una distancia conocida entre electrodos. Para preparar el MEA, extienda uniformemente el sellador elastomérico en la superficie inferior de la cámara de registro y asegúrese de que no haya burbujas.

A continuación, monte la cámara de grabación en el MEA con la ayuda de unas pinzas y aplique una presión suave. Extienda una capa de sellador alrededor del borde exterior de la cámara de grabación. A continuación, coloque el conjunto MEA/cámara en un ambiente cerrado y húmedo y déjelo curar a temperatura ambiente durante la noche.

Para preparar el banco de grabación, ajuste el baño tibio a 32 grados centígrados. A continuación, vierta el ACSF de retención en las cámaras de retención y precalentamiento. Burbujee las soluciones con una mezcla de 95 % de oxígeno y 5 % de dióxido de carbono, y elimine las burbujas atrapadas con una pipeta Pasteur invertida.

Mantenga la cámara de retención a temperatura ambiente y coloque la cámara de precalentamiento en el baño tibio. Prepare cortes horizontales de cerebro de hipocampo y corteza de acuerdo con los procedimientos estándar y déjelos recuperarse en la cámara de retención a temperatura ambiente durante al menos 60 minutos. Vierta 4AP ACSF en una cámara de incubación.

A continuación, burbujee con una mezcla de 95% de oxígeno y 5% de dióxido de carbono, y elimine las burbujas atrapadas con una pipeta Pasteur invertida. Posteriormente, cubra la cámara y transfiérala al baño tibio. Asegúrese de que las temperaturas ACSF de precalentamiento y ACSF 4AP sean de 30 a 32 grados centígrados.

Utilice una pipeta Pasteur de vidrio invertido para transferir un trozo de cerebro a la cámara de precalentamiento y deje reposar el tejido durante 25 a 30 minutos. Luego, transfiera el trozo de cerebro a la cámara de incubación 4AP ACSF y déjelo reposar durante 60 minutos. Deje que el 4AP ACSF fluya a través del tubo de perfusión hacia un vaso de precipitados hasta que no haya aire en el interior.

Luego, detenga el flujo de la solución. Coloque el chip MEA seco dentro del amplificador MEA y asegure el cabezal del amplificador. A continuación, utilice una pipeta Pasteur de plástico para transferir 4AP ACSF al depósito de entrada y salida de la cámara de registro.

Asegure la cánula calefactora a un soporte magnético y coloque su punta dentro del puerto de entrada de la cámara de grabación. A continuación, conecte el soporte magnético a una tira magnética en el cabezal del amplificador MEA. Conecte el tubo de perfusión a la cánula y la cánula al termostato.

Luego, coloque la aguja de succión en el depósito de salida. Verifique que haya presión negativa sumergiendo la aguja de succión en el ACSF y verifique si hay un ruido de succión constante de baja frecuencia. A continuación, configure el regulador de flujo para permitir un caudal de un mililitro por minuto y comience a perfundir.

Una vez que el 4AP ACSF esté fluyendo a través de la cánula, encienda el termostato. Ajuste la cánula de calentamiento a 37 grados centígrados y la base MEA a 32 grados centígrados para lograr una temperatura de 32 a 34 grados centígrados dentro de la cámara de registro. A continuación, coloque el electrodo de referencia externo en el depósito de entrada de la cámara de registro.

Una vez que el nivel de ACSF 4AP y la temperatura de registro se estabilicen según lo deseado, gire las llaves de paso de perfusión y succión a la posición de apagado para detenerlas temporalmente. Transfiera rápidamente un trozo de cerebro a la cámara de grabación MEA con una pipeta Pasteur de vidrio invertido. Ajuste su posición en el área de grabación MEA según sea necesario con una pipeta Pasteur rizada y pulida al fuego o un cepillo pequeño, suave y compacto.

Coloque el anclaje de sujeción en la rebanada de cerebro. Reinicie la perfusión y la succión girando sus llaves de paso a la posición de encendido. Tome una fotografía del corte de cerebro con una cámara montada en una platina de microscopio invertido.

A continuación, ejecute el script mapMEA en el software del ordenador para iniciar la GUI para mapear los electrodos. Haga clic en el botón Examinar para cargar la imagen del corte de cerebro. Asegúrese de que el electrodo de referencia aparezca en la columna superior de la mitad izquierda del MEA.

A continuación, haga clic en el botón Activar puntero. Seleccione los electrodos superior e inferior en la columna más a la izquierda de la matriz para marcar las coordenadas XY para el enderezamiento de la imagen y el mapeo de electrodos. En el menú desplegable Tipo de sector, seleccione Horizontal.

Marque la casilla de verificación Estructuras predeterminadas. Usando los botones numerados debajo de la imagen del corte de cerebro, seleccione los electrodos correspondientes al ROI y haga clic en los botones correspondientes en el panel de estructura para asignarlos. Repita este paso para cada ROI.

Luego, presione el botón Guardar. El software generará una carpeta de resultados que contiene una tabla que informa de los electrodos seleccionados y los ROI. Para el estudio electrofisiológico, encienda la unidad de estímulo al menos 10 minutos antes del protocolo de estimulación para permitir la autocalibración y estabilización.

Luego, inicie el software de control de estímulos y verifique que el estimulador y el amplificador MEA estén conectados correctamente, como lo indica un LED verde en el panel principal del software de control de estímulos. Configura la estimulación en configuración bipolar. Conecte la unidad de estímulo a tierra.

A continuación, conecte los pares de electrodos en contacto con la capa de celda piramidal del CA1/subículo proximal entre los mapeados con el script mapMEA. Para adquirir datos, presione el botón de reproducción en el panel principal del software de grabación. Registre al menos cuatro secreciones ictales.

A continuación, ejecute una prueba rápida de entrada/salida para identificar la mejor intensidad de estímulo. Para ello, utilice el panel principal para diseñar un pulso de corriente positivo-negativo bifásico cuadrado con una duración de 100 microsegundos por fase. En la pestaña Amplitud de pulso, introduzca una amplitud de pulso inicial de 100 microamperios por fase.

Ajuste el pulso de estimulación a 0,2 hercios o menos añadiendo un intervalo entre pulsos de cinco segundos o más. Aumente la amplitud del estímulo en pasos de 50 a 100 microamperios en cada ensayo hasta que la estimulación pueda evocar de manera confiable eventos similares a interictales en las cortezas parahipocampales. Para la modulación eléctrica de la ictogénesis límbica, programe la unidad de estímulo para que entregue el protocolo de estimulación de interés y utilice la amplitud del estímulo identificada durante la prueba de entrada/salida.

Después de que se detenga la estimulación, verifique la recuperación de la red a la condición previa al estímulo registrando al menos cuatro descargas ictales. Esta figura muestra los registros de la actividad ictal inducida por 4AP en la corteza entorrinal y la corteza perirrinal durante la condición de control, la estimulación periódica a un hercio y durante la recuperación tras la retirada del estímulo. Este gráfico muestra la cuantificación del efecto de la estimulación periódica a un hercio, lo que indica una reducción significativa del tiempo total de agarre durante la estimulación.

Una vez dominada, esta técnica se puede realizar en tres o cuatro horas si se realiza correctamente. Al intentar este procedimiento, es importante recordar que debe colocar rápida y correctamente el corte de cerebro en el MEA. Siguiendo este procedimiento, se pueden realizar otros métodos, como la manipulación farmacológica, para responder a preguntas adicionales sobre la contribución de los neurotransmisores o los canales iónicos a la actividad epileptiforme y al efecto de la neuromodulación.

Después de su desarrollo, esta técnica allanó el camino para que los investigadores en el campo de la neurociencia exploraran la interacción de la red neuronal en la salud y la enfermedad en neuronas cultivadas, así como en cortes de cerebro. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo registrar y modular eléctricamente la actividad epileptiforme inducida por la cuatro aminopiridina en cortes de cerebro de roedores acoplados a MEA.