Name: Grabación y modulación de la actividad epileptiforme en rebanadas de cerebro de roedor juntada a arreglos de microelectrodos (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-05-15T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 24 s
Description: Aprende a grabar y modular la actividad epileptiforme en rebanadas de cerebro de roedor usando arreglos de microelectrodos. Este método optimiza protocolos de estimulación para investigar tratamientos contra la epilepsia.

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G.P. es Marie Skłodowska-Curie Fellow financiado por el proyecto de Unión Europea MSCA-IF-2014 Re.B.Us, G.A. n.660689, bajo el programa marco del H2020. El mapMEA GUI está disponible gratuitamente bajo petición al autor ilaria.colombi@iit.it.

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Los autores no tienen nada que revelar.

AMUMA es una valiosa herramienta para las investigaciones de Neurofisiología y ha alcanzado la madurez en los últimos años gracias a décadas de exploración y desarrollo. En comparación con la grabación de potenciales de campo convencionales, MEAs ofrecen la gran ventaja de un mayor número de puntos de observación y conocida distancia entre electrodo, que son cruciales para identificar con precisión las interacciones de la red neuronal.
La técnica de grabación MEA también se puede acoplar a otros métodos de electrofisiología, como abrazadera del remiendo grabación15, para investigar a la relación entre una neurona y actividad de la red neuronal. Por otra parte, la posibilidad de visualizar potenciales de campo y la actividad de varias unidades al mismo tiempo puede proporcionar penetraciones precioso en la correlación entre la actividad de pequeños grupos neuronales y redes neuronales colectivas. La combinación con colorantes sensibles al voltaje, proyección de imagen de calcio y optogenetics29 permite inferir fenómenos Neurofisiología mediante aproximaciones poliédricas. Además de los estudios farmacológicos, la posibilidad de realizar grabación y estímulo con el mismo sistema hace que la técnica de grabación MEA muy potente y versátil: por ejemplo, es posible estudiar los fenómenos de plasticidad sináptica en la base de memoria formación30, utilizando los protocolos de neuromodulación presentados aquí, que son relevantes para DBS para tratar la epilepsia y una amplia variedad de trastornos cerebrales. La prueba reciente de que la técnica de grabación MEA puede aplicarse con éxito al cerebro epiléptico humano tejido16 demuestra su utilidad invaluable en la investigación de la epilepsia, tanto para comprender los mecanismos básicos subyacentes a esta devastadora enfermedad y algoritmos DBS para mejorarlo de afinar.
Sin embargo, MEAs fuerza la búsqueda de los experimentos de electrofisiología bajo condiciones de 'limitar' para rebanadas de cerebro, debido a la exigencia de una cámara de grabación sumergida y la necesidad de dejar el cerebro rebana el resto sobre el sustrato sólido donde los micro-electrodos están integrados. Así, el tejido cerebral no puede recibir suministro de oxígeno adecuado, que a su vez puede afectar la calidad de las grabaciones.
El protocolo aquí descrito permite registrar confiablemente y estudio ictogenesis en las redes límbicas roedores juntadas a MEAs utilizando el modelo agudo 4AP in vitro y épocas prolongadas de la estimulación eléctrica, que proporcionan información relevante para la evaluación de las políticas DBS.
Estudios anteriores realizados sobre neuromodulación eléctrica de epilépticas límbicas redes basadas en el uso de la grabación de potenciales de campo convencional han utilizado rodajas de cerebro de ratón o rata con similares resultados24,25; pero el uso de tejido cerebral de rata resultó más difícil, razonablemente debido a la conexión más débil en comparación con el tejido cerebral de ratones7. Con respecto a la técnica MEA, rodajas de cerebro de ratón son los más adecuados en virtud de su tamaño más pequeño. Por otra parte, dada la mayor tasa de ocurrencia de descargas ictal como en ratón versus tejido cerebral de rata, es posible probar más rebanadas de cerebro a lo largo de un día experimental, que a su vez hace la recopilación de datos más rápida y eficaz, y puede reducir el número de animales utilizados.
Importancia con respecto a los métodos existentes:
Grabado con la cámara de medida descrita aquí las descargas ictal parecen ser similares en duración y la frecuencia de ocurrencia a los observados con la cámara convencional de anillo MEA y el mismo tipo MEA (micro-electrodos planares, CF. 17). Sin embargo, debe ser acentuado que grosor de corte de cerebro debe reducirse significativamente cuando la cámara de grabación redondo convencional junto con un ritmo de perfusión baja (1 mL/min), que puede dificultar a la búsqueda exitosa de neuromodulación experimentos debido a la pobre conectividad.
En este protocolo, una cámara de grabación personalizada bajo volumen inspirada en abrazadera del remiendo grabación cámara diseño ofrece flujo de laminar estable y confiable que es crucial para la búsqueda exitosa de grabaciones MEA; también permite aumentar el grosor de corte de cerebro a 400 μm para alcanzar un justo equilibrio entre la viabilidad del tejido y la conectividad intrínseca. De hecho se reconoce que flujo laminar de la solución de grabación dentro de la cámara es altamente deseable para la electrofisiología de la rebanada del cerebro, ya que no es afectado por temperatura, oxígeno, y gradientes de pH que se observan en el flujo circular redondo de grabación cámaras de19,20,31 (como unos provistos con MEA comercialmente disponible). Tales gradientes introducen sesgo experimental y también son perjudiciales para la rebanada del cerebro. Cámaras de la grabación de un volumen relativamente pequeño (~1.5 mL) junto con una perfusión alta frecuencia (5-6 mL/min)16,31 permitan intercambio adecuado del medio de perfusión (≥ 3 veces / min). La cámara de medida puede ser fácilmente obtenidas de fuentes comerciales a un precio asequible o producidas internamente utilizando tecnología de impresión 3D. Otros estudios han divulgado grabaciones de MEA de 400 μm de espesor cerebro humano rodajas16 utilizando la cámara convencional de anillo MEA, mientras mantiene el volumen de la ACSF a 1 mL y aplicar una tasa de alta perfusión (5-6 mL/min) con la ayuda de una bomba peristáltica bajo nivel de ruido. Sin embargo, los autores han utilizado un modelo diferente de ictogenesis, es decir, el bajo Mg2 +, que es probable que menos influencia que el modelo 4AP ephaptic mecanismos que implican un aumento significativo en la concentración extracelular de K+ 11 , 22. hemos encontrado que una tasa alta de perfusión no es deseable en el modelo 4AP, posiblemente debido al rápido lavado fuera de K extracelular acumulado+, que puede necesitar ser aumentado significativamente en la grabación de la ACSF16. De hecho, acontecimientos ictales aparecieron más 'troceadas' cuando la velocidad de perfusión ASCF fue aumentado a 2-3 mL/min y la rebanada del cerebro fue sumergida por una capa gruesa de la ACSF, considerando que la descargas completos exhibiendo robustos componentes tónico-clónicas podrían restaurarse el regreso a una menor tasa de perfusión (1 mL/min) y un diluyente ACSF capa derecha en el nivel superficial del tejido (datos no mostrados). La cámara de grabación personalizada se describe en este protocolo permite intercambiar el medio de perfusión 3 - 5 veces / min a un flujo de 1 mL/min. Así, el suministro de oxígeno global a las rebanadas de cerebro es mejorado fuertemente incluso en tasas de perfusión relativamente baja, mientras que todavía garantiza una estable temperatura y alto cociente signal-to-noise de la grabación. Lo más importante, es posible mantener la concentración extracelular de K+ a un valor fisiológico.
El modelo 4AP de ictogenesis no requiere ninguna modificación significativa de la composición iónica de la ACSF, tales como descenso Mg2 + o mayor K+y ofrece la ventaja de mantener intacta las transmisiones tanto excitatorias como inhibitorias 12, un aspecto muy relevante en la investigación de la epilepsia a la luz el papel crucial de glutamatérgicos y GABAérgicos redes de sincronización epileptiformes (CF. 7). La ACSF 4AP utilizado en este protocolo contiene una concentración fisiológica de K+ (3,25 mM) y Mg2 + concentración ligeramente inferior que la explotación ACSF (1 mM versus 1,3 mM). Esta concentración todavía cae dentro de los valores fisiológicos reportados de concentración de Mg2 + en el roedor CSF y se utiliza en muchos laboratorios (véase por ejemplo17,18). El propósito del protocolo descrito, hemos hallado que este leve descenso es preferido para ayudar en el efecto de 4AP.
En trabajos anteriores, 4AP se ha aplicado a la rebanada del cerebro cuando ya se coloca dentro de la cámara de grabación17,18. A menos que el experimentador debe observar la latencia tiempo entre la aplicación 4AP y la aparición de patrones epileptiformes, encontramos que este enfoque es algo lento y no es conveniente seguir la grabación prolongada y sesiones de estimulación se describe en este protocolo. Preincubación de las rebanadas de cerebro en 4AP a 32 ° C permite ahorrar tiempo tanto experimental, desde rebanadas de cerebro pueden ser previamente tratados en la serie mientras el experimento utilizando otras secciones de tejido.
La prolongada viabilidad de rebanadas de cerebro puede ser útil para analizar características de la red a largo plazo. Además, su resistencia mejorada a la estimulación eléctrica repetitiva es de gran ventaja si el experimentador desea comparar varios protocolos de estimulación, que deben realizarse en el mismo segmento de cerebro de robustez estadística. En nuestras manos, cuando se prueba 3 protocolos de estimulación, cada uno precedido por una fase de control y seguido por una fase de recuperación, el experimento puede durar 3-5 h. En este contexto, mapeo de MEA vivo es fundamental para activar la vía correcta y suprimir en lugar de favorecer ictogenesis mediante la estimulación eléctrica. Nuestra GUI fácil de usar representa una herramienta rápida, sencilla y flexible para los electrodos de las estructuras cerebrales diferentes. Contrario a software comercial, es posible añadir diseños personalizados de MEA incluso con habilidades de programación básicas. Imágenes pueden ser adquiridas en campo brillante; así, cualquier cámara de propósito general que tiene buena resolución y se ajusta en un microscopio es conveniente. Un microscopio invertido es esencial visualizar la posición de microelectrodos en relación con la rebanada del cerebro, ya que estos se oculta debajo el tejido si se utiliza un microscopio vertical. Sin embargo, un estéreo microscopio se recomienda además del tipo invertido si el experimentador necesita realizar cortes de cuchillo para interrumpir las vías neuronales específicas.
Por último, otra ventaja del enfoque propuesto es el montaje barato y relativamente fácil de la mayoría de las herramientas necesarias, como la cámara de grabación personalizada y las cámaras de explotación, el baño caliente y el anclaje del sector, así como el uso innecesario de un costoso bomba peristáltica de bajo nivel de ruido.
Limitaciones de la técnica:
Grabación de MEA no permite visualizar las ondas muy lentas, es decir, cambios de DC en la señal. Tales desviaciones de la línea de base pueden ayudar asintótica medición de duración de la descarga ictal y, más importante, son fundamentales para el estudio de la depresión que se separa cortical (un fenómeno que se relaciona con muerte súbita inesperada en epilepsia32 y es compartida entre epilepsia y migraña33).
Con respecto a la neuromodulación eléctrica, el protocolo descrito aquí permite la realización de varias sesiones de estimulación sin afectar la viabilidad del segmento de cerebro. Con éxito podríamos realizar hasta 3 sesiones de estimulación de 20-45 min, similar a lo reportado en el anterior trabajo25. Aunque probablemente, rebanadas de cerebro pueden soportar un mayor número de sesiones de estimulación o más protocolos de estimulación, no probamos rebanadas de cerebro en este sentido. Se recomienda limitar el número de protocolos de estimulación a 3 y evitar prolongadas sesiones de estimulación (≥60 minutos), que pueden tensionar mucho tejido cerebral mantenido bajo estas condiciones de límite, hasta la falta de recuperación sobre el retiro del estímulo.
Pasos críticos dentro del Protocolo:
Varios factores críticos pueden dificultar la búsqueda acertada de la grabación y la modulación de la actividad epileptiforme en rebanadas de cerebro juntada a MEA. Además de los roedores utilizados y la calidad de los cortes de cerebro, la tasa de perfusión durante la grabación y la dinámica del flujo ACSF (es decir., laminar versus circular) dentro de la cámara de grabación, hemos encontrado que las condiciones de recuperación y mantenimiento a largo plazo de las rebanadas de cerebro, así como el modo de aplicación 4AP son los pasos más críticos.
Cuando se utiliza una cámara espaciadora sumergida es crucial a guardar las rebanadas de cerebro a temperatura ambiente para preservar la actividad de red de tejido cerebral y favorecer la inducción de las descargas ictal como 4AP aplicación. En nuestras manos, recuperación y mantenimiento a 32 ° C deterioraron el tejido de cerebro dentro de 3-4 h de corte.
Incubación del cerebro rebana en 4AP ACSF a temperatura ambiente y grabación a 32 ° C, sin embargo, no deseable. Hemos encontrado muchas dificultades en la observación de descargas ictal recurrentes robustas en esta condición. De hecho, las bajas temperaturas en el rango de 20 – 24 ° C se han divulgado para humedecer o incluso prevenir ictogenesis 4AP-inducida ambos in vitro34 y en vivo35. Así, las temperaturas de incubación y grabación de 4AP deben caer dentro de los 30-34 ° C y deben coincidir. Para evitar poner el tejido cerebral bajo demasiado estrés debido a la inducción simultánea de hiperexcitabilidad por 4AP y la súbita exposición de rebanadas del cerebro de la temperatura ambiente a la tibia (32 ° C) 4AP-ACSF, es fundamental realizar un previo calentamiento intermedio paso y deje que las rebanadas de cerebro habituarse en la explotación ACSF a 32 º C durante 20-30 min saltando este paso pueden afectar la inducción de ictogenesis por 4AP.
Otro aspecto que debe mencionarse es la importancia de la concentración de d-glucosa en la ACSF después de rebanar. Una concentración de 25 mM conserva las rebanadas de cerebro mejores que la concentración de 10 mM utilizada en muchos laboratorios y también mejora la tasa de ocurrencia de la actividad ictal, que es 2 veces más rápido (por lo tanto, haciendo más fácil seguir una larga serie de experimental protocolos en varias rebanadas de cerebro cada día).
Por último, algunos detalles importantes durante el procedimiento de corte necesitan ser mencionado. En primer lugar, no permitir que el cerebro intacto y las rebanadas de cerebro para congelar en el frío corte ACSF. Enfriar el cerebro para < 2 min es suficiente Dado el pequeño tamaño del cerebro del ratón. Las secciones de tejido deben ser transferidas inmediatamente de la bandeja del buffer a los vasos enjuague a temperatura ambiente. Aclara la corte ACSF es muy importante, de lo contrario la concentración de sacarosa alta hará que el cerebro rebanadas se adhieren a la malla de nylon de la cámara de retención. Para enjuagar eficazmente el tejido, es importante minimizar el contenido de la ACSF de corte dentro de la pipeta para no contaminar la celebración ACSF excesivamente. El enjuague de 2 etapas ayuda a minimizar la contaminación. Al finalizar el procedimiento de corte, cortes de tejido deben transferirse inmediatamente de los vasos enjuague a la cámara de retención, donde el suave nylon de malla suspendida a medio camino en la explotación ACSF permite la oxigenación del tejido en ambos lados. El mismo principio debe aplicarse en todas las etapas siguiendo el procedimiento de corte: rodajas de cerebro nunca deben sentarse en la parte inferior del vaso, no deben estar en contacto con los lados de las cámaras de explotación, y nunca estén en contacto entre sí ni se superponen.
Modificaciones y resolución de problemas:
Composición de la ACSF podrá modificarse según las necesidades del experimentador. Por ejemplo, pueden agregarse medicamentos a diseccionar la contribución de determinados neurotransmisores o canales del ion para la eficacia de la neuromodulación eléctrica. Por otra parte, pirúvico y el ácido ascórbico (CF. tabla 2) pueden ser omitidos, aunque encontramos que ejercen un papel neuroprotector potente. Se presenta en la tabla 3 los problemas más comunes que se encuentran en este protocolo y cómo lidiar con ellos.
CONCLUSIONES:
Grabación de la MEA es sin duda una técnica inestimable para abordar las interacciones de redes neuronales en salud y enfermedad. Además de los estudios farmacológicos, también es posible evaluar protocolos de neuromodulación eléctrica que son relevantes para DBS aplicada a la epilepsia y otros desórdenes neurológicos. En este protocolo, hemos demostrado que es posible reproducir los experimentos de estimulación periódica típica con resultados similares a los obtenidos con la grabación de potenciales de campo extracelular convencional y estimulación de electrodos externos. La creciente disponibilidad de equipamiento comercial fácil de usar y herramientas de software avanzadas realizar la técnica de grabación MEA también conveniente para los experimentos de estimulación de circuito cerrado, que estimulará ad hoc para el tejido cerebral y investigar la contribución de los mecanismos de retroalimentación a las respuestas de la red neuronal.

La epilepsia es un desorden progresivo mortal causando actividad incontrolada del cerebro1; lleva entre la mayor carga de enfermedad y estigma social significativo2,3. TLE es el síndrome más frecuente (40%) y más con frecuencia (~ 30%) resistente a medicamentos antiepilépticos4. Mientras que la ablación quirúrgica del tejido epileptogénico puede mejorar la condición del paciente, no es factible en todos los pacientes y no pueden garantizar una vida completamente libre de crisis5. Modulación de la epilepsia límbicas redes DBS eléctrico es un enfoque prometedor tratamiento farmacológico o Neurocirugía no son adecuados.
Rebanadas de cerebro de roedores son una valiosa herramienta para estudiar cómo neuronal función de redes en salud y la enfermedad6 mediante técnicas de electrofisiología en vitro , como conservar, al menos en parte, original arquitectura y Conectividad del cerebro regiones de interés (ROI). En particular, rodajas de corteza (hipocampo-CE) hipocampo combinado horizontal-entorrinal conforman las redes neuronales esenciales en TLE y por lo tanto se emplean rutinariamente en vitro TLE investigación7.
Actividad de asimiento-como puede ser agudo inducida en rebanadas de cerebro cambiando la composición iónica del líquido cefalorraquídeo artificial (ACSF), tales como disminución de magnesio aumentando potasio8,9,10, o mediante manipulaciones farmacológicas, como el bloqueo de la actividad inhibitoria GABAérgica (véase11 para una revisión exhaustiva). Sin embargo, estos modelos se basan en la alteración desbalanceada de excitación e inhibición; por lo tanto, no permiten el estudio de la interacción y contribución concertada de las redes inhibitorias y excitatorias a ictogenesis. Perfusión continua de rebanadas de cerebro con la droga convulsiva 4AP mejora la neurotransmisión tanto excitatoria como inhibitoria, permitiendo estudiar ictogenesis aguda manteniendo actividad sináptica general intacta12.
MEAs permiten registrar la actividad eléctrica generada por las redes neuronales de un mayor número de puntos de observación en comparación con grabación potencial campo extracelular convencional, donde las restricciones espaciales limitan el número de electrodos que pueden ser acomodan en la superficie de corte de cerebro. Por otra parte, MEA chips ofrecen la ventaja de la distancia entre electrodo conocida, que es muy útil para la propagación de seguimiento y evaluación la velocidad de viaje de señales grabadas. Aunque inicialmente se concibió para la grabación de las neuronas cultivadas13,14, MEAs ahora sirven también para caracterizar las características electrofisiológicas de rebanadas cerebrales agudas de roedores15 y seres humanos16. Así, en el contexto de la investigación en epilepsia, AMUMA representan una herramienta valiosa para identificar las interacciones de redes neuronales en el centro de ictogenesis16,17,18.
Sin embargo, la grabación de MEA lleva inherentemente desafíos técnicos en la obtención o el mantenimiento de un patrón epileptiforme estable a lo largo de los protocolos experimentales de largo (varias horas). En primer lugar, oxigenación tisular no puede ser adecuado dentro de la gran y redondo tipo sumergido grabación cámara19,20 típica de los AMUMA disponible comercialmente, mientras que pobres cociente signal-to-noise y la inestabilidad de la temperatura podrían afectar la calidad de la grabación cuando se utiliza una tasa de alta perfusión (6-10 mL/min) para mejorar el suministro de oxígeno a la rebanada del cerebro (véase por ejemplo las notas técnicas en equipos de calefacción y perfusión21). Descargas en segundo lugar, recurrentes, con componentes de alta frecuencia, como las descargas epileptiformes, apenas se observan al usar cámaras de grabación de tipo sumergido19; Esto es particularmente el caso cuando el patrón epileptiforme aguda es inducido químicamente e implica ephaptic mecanismos, como es el caso de la 4AP modelo22 (ver11 para una descripción completa). Para superar estas limitaciones, varias estrategias han sido propuestas por los investigadores. Por ejemplo, aumento de la tasa de perfusión19,20 reduciendo el grosor de corte de cerebro (≤300 μm) y zona17,18 es factores cruciales para lograr el suministro de oxígeno adecuado a los tejidos. Además, también puede lograrse cerebro mejor rebanada viabilidad utilizando MEAs perforadas (pMEAs), que inunda el tejido cerebral de ambos lados18.
Mientras que los enfoques descritos han mejorado significativamente la viabilidad de la grabación de la MEA de rebanadas de cerebro, no han sido probados contra prolongada (varias horas) grabación y eléctricos sesiones de estimulación, el último que representa a un importante estrés para el tejido cerebral. Las sesiones de grabación prolongada pueden ser requeridas para estudiar la evolución en el tiempo de características específicas de patrones epileptiformes que no sería posibles desenmascarar por medidas a corto plazo. En el contexto de la investigación DBS, se requiera prolongados protocolos experimentales para evaluar y comparar los efectos de varios paradigmas de estimulación en el mismo segmento del cerebro.
Cuando sólo la actividad eléctrica espontánea debe grabarse, mapeo de los electrodos en relación con el retorno de la inversión se realiza a posteriori, es decir, durante el análisis de los datos; en cambio, el estudio de las respuestas evocadas o paradigmas de neuromodulación eléctrica requiere que estímulo entregarse a ROI(s) específicas, dictan la necesidad de asignación de electrodo vivo rápida y fácil durante el experimento.
Aquí ilustramos un sencillo protocolo experimental que permite la inducción y el mantenimiento de un patrón epileptiforme inducida por 4AP estable en rebanadas de cerebro de roedores adultos. La actividad observada reproduce fielmente las características electrofisiológicas de este modelo como caracterizado mediante técnicas de electrofisiología extracelular convencional. Persiste durante varias horas y dura más tiempo sostenida estimulación eléctrica para repetidas épocas prolongadas. Las cámaras usadas para mantener e incubar las rebanadas de cerebro se pueden montar fácilmente con suministros de laboratorio estándar (figura 1A), mientras que una cámara de grabación personalizada permitiendo la solución óptima el tipo de cambio y de flujo laminar (figura 1B) puede obtenerse de fuentes comerciales o utilizando tecnología de impresión 3D a un precio asequible. Asignación rápida de la ROI(s) para monitoreo en tiempo real y para la selección de electrodos estimulantes es hecha posible por un GUI fácil de usar personalizado denominado mapMEA, libremente disponible bajo petición.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57548/57548fig1.jpg"> Figura 1: equipo de medida utilizado para este protocolo. (A) la tenencia de cámaras de recuperación, precalentamiento y preincubación en 4AP son ensambladas con un vaso y un plato de Petri. El plato de Petri debe ser más pequeño en diámetro que el interruptor y se lleva a cabo en lugar por medio de un émbolo de la jeringa. La parte inferior de la caja Petri se sustituye por una malla de nylon (de medias suaves) pegada con cianocrilato en el borde de la placa de Petri. Oxígeno es suministrado a través de una aguja espinal doblada (22 G), insertada entre las paredes de la caja Petri y el vaso de precipitados. Burbujas deben estar surgiendo desde el lado del vaso y nunca alcance la malla de nylon para evitar el desplazamiento de corte de cerebro. La parte superior de una placa de Petri puede utilizarse como una tapa para evitar evaporación ACSF y mantener la saturación de oxígeno. (B) cámara de grabación personalizada. en: Reserva de entrada para la cánula de la calefacción y el electrodo de referencia. salida: embalse de salida para acomodar la aguja de aspiración. REC: grabación cámara. Pipeta Pasteur de cristal (C), encrespado por el fuego-pulido, utilizado para manejar el tejido y ajustar su posición dentro de la cámara de grabación. Ancla de sujeción (D) Custom rebanada. Montaje Final (E) de la cámara de grabación montado en el chip MEA. Un trozo de cerebro se apoya en la parte inferior sujeta por el ancla. La flecha roja indica el tubo de PTFE cubriendo la cánula de la calefacción, mientras que el círculo rojo indica que el electrodo de referencia de un pellet de KCl saturado por ACSF en el depósito de entrada. La flecha azul indica la aguja de aspiración en el depósito de salida. <a href="/files/ftp_upload/57548/57548fig1large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>

<table><tbody><tr><td>Poly-D-Lisina &nbsp;</td><td>Sigma-Adrich</td><td>P7886</td><td>necesario para el recubrimiento MEA</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma-Adrich</td><td>S9888</td><td>Químico</td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma-Adrich</td><td>P9541</td><td>Químico</td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>Sigma-Adrich</td><td>795488</td><td>Químico</td></tr><tr><td>CaCl2*2 H2O</td><td>Sigma-Adrich</td><td>C3306</td><td>Químico</td></tr><tr><td>D-Glucosa</td><td>Sigma-Adrich</td><td>RDD016</td><td>Químico</td></tr><tr><td>NaHCO3</td><td>Sigma-Adrich</td><td>S5761</td><td>Químico</td></tr><tr><td>MgCl2*6 H2O</td><td>Sigma-Adrich</td><td>M2670</td><td></td></tr><tr><td>Químico MgSO4*6 H2O</td><td>Sigma-Adrich</td><td>M5921</td><td>Químico</td></tr><tr><td>Sacarosa</td><td>Sigma-Adrich</td><td>RDD023</td><td></td></tr><tr><td>Ácido pirúvico químico, 98%&nbsp;</td><td>Sigma-Adrich</td><td>107360</td><td>Químico</td></tr><tr><td>4-aminopiridina</td><td>Sigma-Adrich</td><td>A78403</td><td>Fármaco convulsivo</td></tr><tr><td>STG-2004</td><td>Sistema multicanal</td><td>STG4004-1.6mA</td><td>Generador de estímulo de 4 canales con voltaje (&plusmn; 8 V) y salida de corriente (&plusmn; 1,6 mA)</td></tr><tr><td>MEA1060</td><td>Sistema multicanal</td><td>N/A</td><td>Amplificador MEA</td></tr><tr><td>plano</td><td>Sistema multicanal</td><td>MEA 60MEA500/30iR-Ti sin anillo</td><td>Debe estar sin anillo para permitir el uso de la cámara de grabación personalizada</td></tr><tr>Sistema <td></td><td>multicanal</td><td>McRack</td><td>Software de grabación</td></tr><tr>Sistema multicanal<td>McStimulus II</td><td>Software de control STG4004</td><td>de</td><td></td> sistema</tr><tr><td>multicanal TC02</td><td>Sistema multicanal</td><td>TC02</td><td>Termostato de 2 canales</td></tr><tr><td>PH01</td><td>Sistema multicanal</td><td>PH01</td><td>Cánula de perfusión de calefacción</td></tr><tr><td>MPH&nbsp;</td><td>Sistema multicanal</td><td>MPH&nbsp;</td><td>Soporte magnético para PH01 y aguja de succión</td></tr><tr><td>Elastostil E43</td><td>Wacker</td><td>E43</td><td>Sellador elastomérico utilizado para montar la cámara de grabación personalizada en la MEA</td></tr><tr><td>MEA Cámara personalizada</td><td>Crisel Instrument</td><td>SKE-chamber MEA</td><td>Cámara de registro personalizada</td></tr><tr><td>Electrodo de Ag/AgCl, pellet, 1,0 mm&nbsp;</td><td>Crisel Instrument</td><td>64-1309</td><td>Electrodo de referencia para la cámara de grabación personalizada</td></tr><tr><td>Tergazyme</td><td>Sigma-Adrich</td><td>Z273287-1EA</td><td>Limpiador enzimático</td></tr><tr><td>MATLAB</td><td>Entorno</td> de <td>programación de Mathworks</td><td></td> para electromapeo</tr><tr><td>VT1000S</td><td>Leica Biosystems</td><td>VT1000S</td><td>Vibratome</td></tr><tr><td></td><td>Warner Instruments</td><td>64-1309</td><td>Electrodo Ag-AgCl Pellet 1.0 mm (E205). Electrodo de referencia.</td></tr></tbody></table>

grabación y modulación de la actividad epileptiforme en rebanadas de cerebro de roedor juntada a arreglos de microelectrodos

Recording and Modulation of Epileptiform Activity in Rodent Brain Slices Coupled to Microelectrode Arrays

Epilepsia del lóbulo temporal (ELT) es el síndrome epiléptico complejo parcial más común y menos sensible a los medicamentos. Estimulación cerebral profunda (DBS) es un enfoque prometedor cuando falla el tratamiento farmacológico o Neurocirugía no se recomienda. Rebanadas de cerebro agudo juntados a arreglos de microelectrodos (MEAs) representan una herramienta valiosa para el estudio de las interacciones de la red neuronal y su modulación por el estímulo eléctrico. En comparación con técnicas convencionales de grabación extracelular, que proporcionan las ventajas agregadas de un número mayor de puntos de observación y conocida distancia entre electroda, que permite estudiar la trayectoria de la propagación y velocidad de electrofisiológicos señales. Sin embargo, oxigenación tisular puede reducirse considerablemente durante el MEA de grabación, que requieren una tasa alta de perfusión, que viene a costa de disminución cociente signal-to-noise y mayores oscilaciones en la temperatura experimental. Estimulación eléctrica más destaca el tejido cerebral, lo que hace difícil seguir épocas de grabación/estimulación prolongada. Además, modulación eléctrica de actividad de la rebanada del cerebro necesita atacar estructuras/vías específicas dentro de la rebanada del cerebro, que requieren que asignación de electrodo ser rápidamente y fácilmente interpretada en directo durante el experimento. Aquí ilustramos cómo llevar a cabo la modulación grabación y eléctrica de la 4-aminopiridina (4AP)-inducida por la actividad epileptiforme en rebanadas de cerebro de roedor con MEAs planares. Nos muestran que el tejido cerebral de ratones supera a tejido cerebral de rata y por lo tanto es más adecuado para los experimentos MEA. Este protocolo garantiza la generación y el mantenimiento de un patrón epileptiforme estable que fielmente reproduce las características electrofisiológicas observadas con la grabación de potenciales de campo convencional, persiste durante varias horas y dura más tiempo sostenido estimulación eléctrica para épocas prolongadas. Viabilidad del tejido durante todo el experimento se logra gracias al uso de una cámara de grabación personalizada de pequeño volumen teniendo en cuenta flujo laminar y de intercambio de solución rápida incluso en baja (1 mL/min) las tasas de perfusión. Rápida asignación de MEA para monitoreo en tiempo real y selección de electrodos de estimulación se realiza mediante una interfaz de usuario gráfica (GUI).

Ilustramos cómo realizar grabación y eléctrica de la modulación de la actividad epileptiforme inducida por 4-aminopiridina en rebanadas de cerebro de roedores utilizando microelectrodos. Una cámara de grabación personalizada mantiene la viabilidad del tejido a lo largo de prolongadas sesiones experimentales. Asignación de electrodo en vivo y selección de pares estimulantes son realizados por una interfaz de usuario gráfica personalizada.

Grabación y modulación de la actividad epileptiforme en rebanadas de cerebro de roedor juntada a arreglos de microelectrodos

Temporal lobe epilepsy (TLE) is the most common partial complex epileptic syndrome and the least responsive to medications. Deep brain stimulation (DBS) ...

Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la neuromodulación para el tratamiento de la epilepsia, como qué área del cerebro y protocolo de estimulación son los más adecuados. La principal ventaja de esta técnica es que los cortes de cerebro de roedores representan un modelo simplificado y realista de los circuitos cerebrales, mientras que las matrices de microelectrodos permiten múltiples puntos de observación a una distancia conocida entre electrodos. Para preparar el MEA, extienda uniformemente el sellador elastomérico en la superficie inferior de la cámara de registro y asegúrese de que no haya burbujas.A continuación, monte la cámara de grabación en el MEA con la ayuda de unas pinzas y aplique una presión suave. Extienda una capa de sellador alrededor del borde exterior de la cámara de grabación. A continuación, coloque el conjunto MEA/cámara en un ambiente cerrado y húmedo y déjelo curar a temperatura ambiente durante la noche.Para preparar el banco de grabación, ajuste el baño tibio a 32 grados centígrados. A continuación, vierta el ACSF de retención en las cámaras de retención y precalentamiento. Burbujee las soluciones con una mezcla de 95 % de oxígeno y 5 % de dióxido de carbono, y elimine las burbujas atrapadas con una pipeta Pasteur invertida.Mantenga la cámara de retención a temperatura ambiente y coloque la cámara de precalentamiento en el baño tibio. Prepare cortes horizontales de cerebro de hipocampo y corteza de acuerdo con los procedimientos estándar y déjelos recuperarse en la cámara de retención a temperatura ambiente durante al menos 60 minutos. Vierta 4AP ACSF en una cámara de incubación.A continuación, burbujee con una mezcla de 95% de oxígeno y 5% de dióxido de carbono, y elimine las burbujas atrapadas con una pipeta Pasteur invertida. Posteriormente, cubra la cámara y transfiérala al baño tibio. Asegúrese de que las temperaturas ACSF de precalentamiento y ACSF 4AP sean de 30 a 32 grados centígrados.Utilice una pipeta Pasteur de vidrio invertido para transferir un trozo de cerebro a la cámara de precalentamiento y deje reposar el tejido durante 25 a 30 minutos. Luego, transfiera el trozo de cerebro a la cámara de incubación 4AP ACSF y déjelo reposar durante 60 minutos. Deje que el 4AP ACSF fluya a través del tubo de perfusión hacia un vaso de precipitados hasta que no haya aire en el interior.Luego, detenga el flujo de la solución. Coloque el chip MEA seco dentro del amplificador MEA y asegure el cabezal del amplificador. A continuación, utilice una pipeta Pasteur de plástico para transferir 4AP ACSF al depósito de entrada y salida de la cámara de registro.Asegure la cánula calefactora a un soporte magnético y coloque su punta dentro del puerto de entrada de la cámara de grabación. A continuación, conecte el soporte magnético a una tira magnética en el cabezal del amplificador MEA. Conecte el tubo de perfusión a la cánula y la cánula al termostato.Luego, coloque la aguja de succión en el depósito de salida. Verifique que haya presión negativa sumergiendo la aguja de succión en el ACSF y verifique si hay un ruido de succión constante de baja frecuencia. A continuación, configure el regulador de flujo para permitir un caudal de un mililitro por minuto y comience a perfundir.Una vez que el 4AP ACSF esté fluyendo a través de la cánula, encienda el termostato. Ajuste la cánula de calentamiento a 37 grados centígrados y la base MEA a 32 grados centígrados para lograr una temperatura de 32 a 34 grados centígrados dentro de la cámara de registro. A continuación, coloque el electrodo de referencia externo en el depósito de entrada de la cámara de registro.Una vez que el nivel de ACSF 4AP y la temperatura de registro se estabilicen según lo deseado, gire las llaves de paso de perfusión y succión a la posición de apagado para detenerlas temporalmente. Transfiera rápidamente un trozo de cerebro a la cámara de grabación MEA con una pipeta Pasteur de vidrio invertido. Ajuste su posición en el área de grabación MEA según sea necesario con una pipeta Pasteur rizada y pulida al fuego o un cepillo pequeño, suave y compacto.Coloque el anclaje de sujeción en la rebanada de cerebro. Reinicie la perfusión y la succión girando sus llaves de paso a la posición de encendido. Tome una fotografía del corte de cerebro con una cámara montada en una platina de microscopio invertido.A continuación, ejecute el script mapMEA en el software del ordenador para iniciar la GUI para mapear los electrodos. Haga clic en el botón Examinar para cargar la imagen del corte de cerebro. Asegúrese de que el electrodo de referencia aparezca en la columna superior de la mitad izquierda del MEA.A continuación, haga clic en el botón Activar puntero. Seleccione los electrodos superior e inferior en la columna más a la izquierda de la matriz para marcar las coordenadas XY para el enderezamiento de la imagen y el mapeo de electrodos. En el menú desplegable Tipo de sector, seleccione Horizontal.Marque la casilla de verificación Estructuras predeterminadas. Usando los botones numerados debajo de la imagen del corte de cerebro, seleccione los electrodos correspondientes al ROI y haga clic en los botones correspondientes en el panel de estructura para asignarlos. Repita este paso para cada ROI.Luego, presione el botón Guardar. El software generará una carpeta de resultados que contiene una tabla que informa de los electrodos seleccionados y los ROI. Para el estudio electrofisiológico, encienda la unidad de estímulo al menos 10 minutos antes del protocolo de estimulación para permitir la autocalibración y estabilización.Luego, inicie el software de control de estímulos y verifique que el estimulador y el amplificador MEA estén conectados correctamente, como lo indica un LED verde en el panel principal del software de control de estímulos. Configura la estimulación en configuración bipolar. Conecte la unidad de estímulo a tierra.A continuación, conecte los pares de electrodos en contacto con la capa de celda piramidal del CA1/subículo proximal entre los mapeados con el script mapMEA. Para adquirir datos, presione el botón de reproducción en el panel principal del software de grabación. Registre al menos cuatro secreciones ictales.A continuación, ejecute una prueba rápida de entrada/salida para identificar la mejor intensidad de estímulo. Para ello, utilice el panel principal para diseñar un pulso de corriente positivo-negativo bifásico cuadrado con una duración de 100 microsegundos por fase. En la pestaña Amplitud de pulso, introduzca una amplitud de pulso inicial de 100 microamperios por fase.Ajuste el pulso de estimulación a 0,2 hercios o menos añadiendo un intervalo entre pulsos de cinco segundos o más. Aumente la amplitud del estímulo en pasos de 50 a 100 microamperios en cada ensayo hasta que la estimulación pueda evocar de manera confiable eventos similares a interictales en las cortezas parahipocampales. Para la modulación eléctrica de la ictogénesis límbica, programe la unidad de estímulo para que entregue el protocolo de estimulación de interés y utilice la amplitud del estímulo identificada durante la prueba de entrada/salida.Después de que se detenga la estimulación, verifique la recuperación de la red a la condición previa al estímulo registrando al menos cuatro descargas ictales. Esta figura muestra los registros de la actividad ictal inducida por 4AP en la corteza entorrinal y la corteza perirrinal durante la condición de control, la estimulación periódica a un hercio y durante la recuperación tras la retirada del estímulo. Este gráfico muestra la cuantificación del efecto de la estimulación periódica a un hercio, lo que indica una reducción significativa del tiempo total de agarre durante la estimulación.Una vez dominada, esta técnica se puede realizar en tres o cuatro horas si se realiza correctamente. Al intentar este procedimiento, es importante recordar que debe colocar rápida y correctamente el corte de cerebro en el MEA. Siguiendo este procedimiento, se pueden realizar otros métodos, como la manipulación farmacológica, para responder a preguntas adicionales sobre la contribución de los neurotransmisores o los canales iónicos a la actividad epileptiforme y al efecto de la neuromodulación.Después de su desarrollo, esta técnica allanó el camino para que los investigadores en el campo de la neurociencia exploraran la interacción de la red neuronal en la salud y la enfermedad en neuronas cultivadas, así como en cortes de cerebro. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo registrar y modular eléctricamente la actividad epileptiforme inducida por la cuatro aminopiridina en cortes de cerebro de roedores acoplados a MEA.

recording-modulation-epileptiform-activity-rodent-brain-slices

Research

Investigación

JoVE Journal

Neuroscience

Neurociencia

Este video describe la técnica para registrar la actividad epileptiforme de cortes organotípicos de la corteza rinal y el hipocampo ex vivo utilizando electrofisiología o configuración de EEG. Esto ayuda a estudiar la dinámica y la progresión de la epileptogénesis y a detectar posibles dianas terapéuticas para tratar la epilepsia.

Técnica de registro basada en electroencefalografía para registrar la actividad epileptiforme

Este protocolo implica el uso de una matriz de microelectrodos (MEA) para registrar la actividad eléctrica en un corte de cerebro expuesto a una droga inductora de convulsiones. El procedimiento incluye la colocación del corte de cerebro en una cámara de registro MEA, la aplicación de estimulación eléctrica para inducir convulsiones artificiales y el análisis de las señales resultantes.

Monitorización de la actividad eléctrica neuronal inducida por convulsiones en cortes de cerebro mediante matrices de microelectrodos

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Actividad similar a las convulsiones de alta calidad a partir de cortes agudos de cerebro utilizando un sistema complementario de matriz de microelectrodos de alta densidad de semiconductores de óxido metálico

Este protocolo tiene como objetivo platear de manera estable ensamblajes fusionados dorsal-ventral en matrices de electrodos múltiples para modelar la epilepsia in vitro.

Una plataforma de matriz de electrodos múltiples para modelar la epilepsia utilizando ensamblajes cerebrales derivados de células madre pluripotentes humanas

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Aprende a grabar y modular la actividad epileptiforme en rebanadas de cerebro de roedor usando arreglos de microelectrodos. Este método optimiza protocolos de estimulación para investigar tratamientos contra la epilepsia.

Grabación y modulación de la actividad epileptiforme en rebanadas de cerebro de roedor juntada a arreglos de microelectrodos

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