Un protocolo de aspiración de la ampolla para estudiar células de T humanas recordar respuestas en Vivo
11 de agosto de 2018
Presentamos una demostración del modelo de recuperación cutánea de ampolla de succión. El modelo permite un fácil acceso a estudiar humano en vivo respuesta inmune adaptativa, por ejemplo en el contexto del desarrollo de una vacuna.
El objetivo general de este vídeo es demostrar el método de recuerdo cutáneo de la ampolla de succión, que nos permite recolectar células T específicas de antígeno y citocinas representativas de la respuesta inmunitaria adaptativa in vivo. Este método se puede utilizar para estudiar las respuestas celulares y la inmunidad adaptativa en humanos. La principal ventaja de esta tecnología es que nos permite recolectar células T específicas de antígeno directamente del sitio de la reacción inmune utilizando un método relativamente no invasivo y seguro.
El principio básico de la memoria cutánea es depositar el antígeno en la capa dérmica de la piel. En los individuos con memoria inmunológica existente del antígeno, las células T migrarán al lugar de la reacción e inducirán una respuesta inmunitaria local en la que las células T específicas se expanden clonalmente y se diferencian in situ. La inducción de ampollas de succión sobre esta reacción nos permite cosechar estas células T específicas, así como las citoquinas producidas in vivo.
En esta demostración en video, usamos PPD como nuestro antígeno de recuerdo. La PPD se usa comúnmente para el diagnóstico de la infección por Mycobacterium tuberculosis. Pero, también induce reacciones cutáneas en personas previamente vacunadas con la vacuna BCG, como verás en este vídeo.
Los materiales para la prueba cutánea de la tuberculina incluyen hisopos con alcohol, una jeringa de un mililitro con una aguja corta de calibre 27 a 30 y una solución de PPD aprobada para uso humano. Use una solución de PPD de 20 unidades de tuberculina por mililitro. Desinfecte el vial con un hisopo con alcohol.
Y tenga en cuenta que la composición puede variar entre fabricantes. A continuación, localice el lugar de la inyección en el lado ventral del antebrazo del voluntario y desinfecte la zona con un hisopo con alcohol. Use una jeringa estéril de un mililitro con una aguja fija de 12 milímetros de calibre 29.
Mezcle suavemente y aspire 0,1 mililitros de la solución de PPD. Asegúrese de que no haya burbujas visibles. Estresa la piel y apunta la aguja en un ángulo de cinco a quince grados con el bisel hacia arriba.
Inserte la punta de la aguja en la capa dérmica de la piel y asegúrese de que la punta sea casi visible a través de la epidermis. Inyecte lentamente 0,1 mililitros de solución PPD. Si se administra correctamente, aparecerá inmediatamente una pápula de seis a diez milímetros.
La pápula desaparece después de aproximadamente diez minutos. Es posible que se realicen múltiples deposiciones de PPD, pero podrían requerir una aprobación ética adicional. Si se administran dos inyecciones, trate de lograr la máxima separación mientras se mantiene a una buena distancia del área del codo y la muñeca.
La reacción clínica de la piel aparece dentro de las primeras 24 horas y se acompaña de una sensación de picor. Mida el tamaño de la reacción cutánea de 48 a 72 horas después de la inyección. A la hora de evaluar la respuesta, es importante medir la induración y no el eritema.
Palpa la hinchazón del sombrero con el dedo. A continuación, marque los bordes de la induración con un bolígrafo. Finalmente, use una regla suave para medir el diámetro de induración y anote los resultados en milímetros.
Después de siete días, es el momento de inducir la ampolla de succión. Para la inducción de la ampolla de succión cutánea, utilice una bomba de vacío con una cámara de succión adjunta. Utilice un dispositivo disponible en el mercado o uno personalizado.
Es importante destacar que la bomba debe ser ajustable dentro del rango de menos 20 a menos 40 kilopascales y proporcionar una presión negativa constante y confiable. La parte inferior de la cámara de succión consiste en una placa con un pequeño orificio que está en contacto con la piel. Las placas pueden tener uno o varios orificios y se pueden aplicar diferentes tamaños para adaptarse a la reacción de la piel.
La parte superior de la cámara debe permitir el control visual de la ampolla. Antes de la inducción, desinfecte la piel y la placa de la cámara. Asegúrese de que el brazo descanse cómodamente.
Fije y asegure la cámara, aquí mediante el uso de correas ajustables. El centro de la reacción cutánea debe ser visible a través del orificio de la placa inferior. Encienda el dispositivo de succión y ajuste la presión negativa a menos 20 kilopascales.
Después de treinta minutos, aumente la presión a menos 25 kilopascales. Después de 60 minutos, aumente aún más la presión a menos 30 kilopascales. Y mantenga la presión aquí hasta que se forme completamente una sola ampolla.
La fase de inducción de la ampolla suele durar entre una y tres horas. Con la formación real de ampollas ocurriendo gradualmente en los últimos 30 minutos, como se demuestra aquí a alta velocidad. Si hay signos de rotura de ampollas o hemorragia, se recomienda liberar lentamente la presión y detener la inducción antes de tiempo.
Las ampollas pueden aparecer como ampollas de fusión simples o múltiples. El proceso a menudo se asocia con una sensación de picazón. Una vez que la ampolla esté completamente formada, libere la presión y retire con cuidado la cámara de succión.
En las ampollas correctamente inducidas, la capa epidérmica se separa completamente de la capa dérmica de la piel, dejando una cavidad llena de líquido. Proteja la ampolla aplicando un apósito suave en el área circundante de la piel y colocando una tapa dura sobre la ampolla, en este caso de un tubo de plástico de 15 mililitros. Asegure la tapa con una cinta adhesiva no alergénica seguida de un vendaje suave y elástico.
Indique al voluntario que guarde el vendaje protector durante la noche. Al día siguiente, retire con cuidado el apósito y desinfecte el área de la ampolla con aerosol. Use una jeringa estéril de 2 mililitros con una aguja de calibre 23 para recolectar el contenido del blíster.
Inserte la aguja en la parte lateral superior del techo de la ampolla y aspire lentamente el líquido. Evite tocar el suelo de la cavidad, pero asegúrese de recolectar todo el líquido, ya que el volumen de la ampolla puede ser bajo, como en este ejemplo. La ampolla colapsada sanará sin dejar cicatrices.
Agrega un vendaje protector sobre la ampolla. A continuación, transfiera el líquido del blíster a un tubo estéril. Centrifugar durante cuatro minutos a 600 g con una centrífuga de sobremesa.
Después, coseche el sobrenadante y vuelva a suspender el pellet de celda en 500 microlitros de medio celular. Las células frescas ya están listas para el recuento y el análisis posterior. Las células blíster de succión se pueden utilizar para análisis in vitro, como la citometría de flujo.
En este experimento con voluntarios vacunados con BCG, el rendimiento celular osciló entre 15.000 y más de 200.000 células por blíster. Aquí, aislamos células de un solo blíster de succión y estimulamos las células con PPD in vitro, seguido de una tinción y citometría de flujo. A modo de comparación, hicimos un análisis paralelo de las PBMC del mismo voluntario vacunado con PCG.
En los paneles, se ven poblaciones de linfocitos T CD4 positivos teñidos para la producción intercelular de TNF-alfa, interferón-gamma e IL2. En este voluntario, más del 30% de las células T CD4 positivas aisladas de la piel eran específicas del antígeno. Además, los perfiles de citocinas individuales de las células blíster fueron representativos tanto de las células T de memoria central como de las células T efectoras, lo que ilustra cómo este método nos permite estudiar las respuestas de memoria de larga duración generadas in vivo.
Aquí, la figura A ilustra que el fluido obtenido de las ampollas de succión se puede analizar para las citocinas producidas in vivo. En la figura B, cultivamos células obtenidas de ampollas de succión durante cuatro días en presencia de Mycobacterium tuberculosis, lo que ilustra cómo las células de ampollas de succión son capaces de producir interferón-gamma y TNF alfa ex vivo. Después de ver este video, debe tener una buena comprensión de cómo inducir y recolectar células de ampollas de succión después de la deposición de antígenos cutáneos.
En esta demostración se utilizó un antígeno de especial relevancia dentro del campo de la investigación de la tuberculosis. Sin embargo, los principios básicos de esta metodología pueden ser de utilidad en los campos de la inmunidad adaptativa o en ensayos que investigan agentes dirigidos a las células T. Además, recuerde que la ética y la seguridad son una primera prioridad cuando se trabaja con voluntarios humanos.
También recuerde que trabajar con muestras humanas puede ser peligroso y que siempre se deben seguir las precauciones de seguridad en el laboratorio.
Descripción general
Este video demuestra el método cutáneo de recuerdo por ampollas de succión, que permite la obtención in vivo de linfocitos T específicos para antígenos y citocinas. Esta técnica es particularmente útil para estudiar las respuestas inmunitarias adaptativas humanas, como en el desarrollo de vacunas.
Componentes Clave del Estudio
Área de la ciencia
- Inmunología
- Respuesta inmunitaria adaptativa
- Desarrollo de vacunas
Antecedentes
- El método de la ampolla por succión proporciona una manera no invasiva de estudiar las respuestas inmunitarias.
- Permite la recolección de linfocitos T directamente desde el sitio de la reacción inmunitaria.
- La PPD se utiliza como antígeno de memoria para evaluar la memoria inmunitaria.
- Este método puede ayudar a comprender los mecanismos celulares de la inmunidad.
Objetivo del estudio
- Demostrar la técnica de ampollas por succión para la obtención de células inmunitarias.
- Analizar las respuestas de linfocitos T específicas frente a antígenos en humanos.
- Proporcionar una guía práctica para implementar este método en la investigación.
Métodos Utilizados
- Inyección de PPD en la capa dérmica de la piel.
- Inducción de ampollas por succión para recoger linfocitos T y citocinas.
- Medición de las reacciones cutáneas tras la inyección.
- Recolección del líquido de las ampollas para su posterior análisis.
Resultados principales
- Inducción exitosa de ampollas por succión demostrada.
- Los linfocitos T y citocinas recolectados pueden analizarse in vitro.
- Metodología clara para medir respuestas inmunitarias establecida.
- Seguridad y eficacia de la técnica de ampollas por succión demostradas.
Conclusiones
- El método de ampollas por succión es eficaz para estudiar la inmunidad adaptativa.
- Esta técnica puede contribuir a la investigación y el desarrollo de vacunas.
- Proporciona una herramienta valiosa para estudios inmunológicos en humanos.
Preguntas frecuentes
Relevancia Ejecutiva para la Industria
El estudio de las respuestas de memoria de los linfocitos T humanos in vivo proporciona información mecanicista fundamental para el desarrollo de vacunas y la validación de dianas en inmunoterapia. El método cutáneo de recuerdo mediante ampollas por succión permite el acceso directo a linfocitos T específicos para antígenos y a microentornos de citocinas en el sitio de la reacción inmunitaria, lo que apoya la reducción de riesgos preclínicos de agentes dirigidos contra linfocitos T. Este enfoque mejora la confianza predictiva en las fases iniciales del descubrimiento al vincular hallazgos ex vivo con la biología humana in vivo.
Aplicaciones Estratégicas en I+D de Biotecnología Farmacéutica
Descubrimiento Temprano y Validación de Blancos
- Valor científico: Permite la evaluación de hipótesis terapéuticas mediante el aislamiento directo de linfocitos T CD4+ polifuncionales específicos del antígeno a partir de tejido humano.
- Valor operativo: Apoya la reducción del riesgo biológico mediante la validación funcional de dianas de linfocitos T en un sistema relevante para la enfermedad.
- Valor estratégico: Facilita la identificación de candidatos líderes al proporcionar células específicas del antígeno con alta fracción para cribados mecanicistas.
Desarrollo de Pruebas y Cribado
- Valor científico: Prepara sistemas biológicos validados para la estandarización de ensayos posteriores mediante lecturas multiplex y citometría de flujo.
- Valor operativo: Proporciona salidas cuantitativas y reproducibles de la producción de citoquinas y la funcionalidad de las células T ex vivo.
- Valor estratégico: Permite la reutilización escalable de una plataforma para evaluar los efectos de compuestos sobre las respuestas de linfocitos T de memoria humana.
Investigación Traductacional y Preclínica
- Valor científico: Demuestra relevancia para la enfermedad mediante un modelo humano vacunado con BCG de respuesta al tuberculina, alineado con estrategias traslacionales de biomarcadores.
- Valor operativo: Garantiza la continuidad desde el descubrimiento hasta la validación preclínica al capturar perfiles de linfocitos T de memoria central y efector generados in vivo.
- Valor estratégico: Apoya decisiones de avance ajustadas al riesgo al reducir la ambigüedad mecanicista en estudios de inmunidad celular.
Integración de la tubería y flujo de trabajo
El método se integra en el continuo de descubrimiento, desde la prueba de hipótesis en las primeras etapas del descubrimiento hasta la identificación de compuestos prometedores y la validación preclínica, particularmente para terapias moduladoras de linfocitos T y candidatos a vacunas.
- Biología del Descubrimiento: Apoya la verificación de hipótesis y la aclaración de vías al obtener linfocitos T diferenciados y clonalmente expandidos del sitio de la reacción inmunitaria.
- Selección: Permite la preparación para ensayos mediante protocolos estandarizados de inducción de ampollas y recolección de líquido, que proporcionan una viabilidad celular constante para análisis posteriores.
- Análisis: Ofrece mediciones cuantitativas de la frecuencia de linfocitos T específicos para antígenos y perfiles polifuncionales de citocinas (por ejemplo, IFN-γ, TNF-α, IL-2) para la evaluación comparativa entre condiciones.
- Investigación Traslacional: Conecta con la continuidad preclínica al demostrar cómo las células obtenidas de ampollas por succión reflejan respuestas de memoria de larga duración generadas in vivo.
- Reutilización Empresarial: Establece una capacidad reutilizable para estudiar la inmunidad adaptativa humana en programas de vacunas y terapias inmunológicas.
Impacto Operativo y Empresarial
- Valor científico: Confianza predictiva, validación de objetivos y reducción de ambigüedad mecanicista en las respuestas inmunitarias humanas.
- Valor operativo: Normalización, reproducibilidad y escalabilidad del aislamiento de linfocitos T específicos de antígeno a partir de la piel humana.
- Valor estratégico: Mejores decisiones de avance o interrupción, eficiencia del capital y reducción del riesgo biológico en fases tardías del desarrollo de inmunoterapias.
- Impacto en la cartera: Priorización y toma de decisiones de avance ajustadas al riesgo, basadas en datos de respuesta inmunitaria relevantes para el ser humano.
Consideraciones de Implementación
- Requiere experiencia en estudios con voluntarios humanos, administración cutánea de antígenos y técnicas de inducción de ampollas por succión.
- Necesita una bomba de vacío ajustable (–20 a –40 kPa), jeringas estériles, antígeno PPD y equipos de centrifugación para el procesamiento celular.
- Exige una estandarización conjunta entre equipos en las mediciones de las ampollas, recolección y transferencia del líquido, entre grupos de inmunología y clínicos.
- Implica consideraciones de adaptación para distintos modelos de antígenos y sitios de reacción en la piel, manteniendo gradientes de presión negativa consistentes.
- Incluye limitaciones prácticas, como el rendimiento variable de células (15 000–200 000 células/ampolla) y la dependencia de la memoria inmunológica preexistente en los voluntarios.
