Explorar el microbioma de la raíz: extracción de datos de la comunidad bacteriana del suelo, rizosfera y raíz Endosphere

El objetivo general de este experimento es caracterizar tres compartimentos del microbioma de la raíz, el suelo, la rizosfera y la endosfera de la raíz, utilizando el perfil de la comunidad del gen de ARN ribosómico 16S. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en ecología microbiana, como los factores bióticos y abióticos que son los principales impulsores de la estructura del microbioma. La principal ventaja de esta técnica es que estandariza cada paso, desde la separación de la raíz y la rizosfera hasta la extracción del ADN y la preparación de una biblioteca de secuenciación.

La demostración de este procedimiento estará a cargo de Tuesday Simmons, estudiante graduado en el Laboratorio Coleman-Derr. Para comenzar el protocolo, recoja muestras de suelo a granel con un colector de núcleos de suelo esterilizado con etanol para obtener un suelo que esté libre de raíces de plantas. Recoja un núcleo de aproximadamente 23 a 30 centímetros de la base de la planta.

A continuación, transfiera el suelo a una bolsa de plástico, homogeneice el suelo agitando suavemente la bolsa, transfiera una alícuota de 600 miligramos de la muestra de suelo a un tubo de dos mililitros e inmediatamente coloque el tubo de dos mililitros en hielo seco hasta la extracción del ADN. Para recolectar la raíz y la rizosfera, use una pala esterilizada con etanol para desenterrar la planta, teniendo cuidado de obtener la mayor cantidad posible de la raíz. Sacuda suavemente el exceso de tierra de las raíces hasta que haya aproximadamente dos milímetros de tierra adherida a la superficie de la raíz.

Para plantas grandes, use tijeras estériles para cortar una subsección representativa de raíces y coloque un mínimo de 500 miligramos de tejido radicular en un vial cónico de 50 mililitros. Agregue suficiente tampón de eliminación de epífitas para cubrir las raíces, luego coloque inmediatamente la muestra en hielo seco. Para separar la rizosfera de las raíces, descongele la muestra de raíz en hielo, luego sonique las muestras de raíz.

Transfiera las raíces a un tubo limpio y refrigerado de 50 mililitros con pinzas estériles. No deseche el tubo original con tampón y tierra. Contiene la fracción de la rizosfera.

A continuación, centrifuga el tubo que contiene el tampón y la rizosfera. Decantar el sobrenadante y colocar la fracción de la rizosfera en hielo seco. Para lavar las raíces, agregue aproximadamente 20 mililitros de cuatro grados centígrados de agua estéril a la fracción de la raíz.

Lave la raíz agitándola vigorosamente durante 15 a 30 segundos, luego drene el agua. Use una espátula estéril para transferir rápidamente 250 miligramos de tierra y rizosfera a tubos de recolección separados provistos en un kit comercial de aislamiento de ADN para la extracción de suelo, luego proceda usando el protocolo del proveedor del kit. Después de la elución, almacene el ADN a menos 20 grados centígrados hasta que esté listo para proceder a la preparación de la biblioteca de amplicones, luego extraiga el ADN de las muestras de raíz.

Enfríe un mortero esterilizado con nitrógeno líquido. Mida de 600 a 700 miligramos de tejido radicular y coloque el tejido en el mortero y agregue con cuidado suficiente nitrógeno líquido para cubrir las raíces. Muele las raíces en trozos pequeños.

Continúe el proceso de agregar nitrógeno líquido y moler al menos dos veces, siendo consistente entre muestras, hasta que las raíces sean un polvo fino. Rápidamente, antes de que el polvo de raíz comience a descongelarse, use una espátula estéril para transferir el polvo de raíz a tubos de 1,5 mililitros previamente pesados en hielo. Registre el peso del tubo y el polvo.

Use una espátula estéril para transferir rápidamente 150 miligramos de polvo de raíz al tubo de recolección provisto en el kit comercial de aislamiento de ADN diseñado para la extracción del suelo, luego proceda con el aislamiento de ADN utilizando el protocolo del proveedor del kit. Prepare suficiente mezcla maestra de PCR para amplificar cada muestra de ADN por triplicado. Vierta la mezcla maestra en un depósito de pipeta multicanal estéril de 25 mililitros y distribuya 66 microlitros de mezcla maestra en cada pocillo de una nueva placa de PCR de 96 pocillos.

A continuación, agregue seis microlitros de cinco nanogramos por microlitro de ADN de la placa de ADN normalizada a la placa de mezcla maestra. A continuación, añada a la placa maestra 1,5 microlitros de cebador delantero de 10 micromolares, de modo que cada columna tenga un código de barras directo diferente, y 1,5 microlitros de cebador inverso de 10 micromolares, de modo que cada fila tenga un código de barras inverso diferente. Cubra la placa con una película y gire la placa brevemente a 3, 000 RCF.

Utilice una pipeta multicanal para mezclar suavemente el contenido, luego divídalos en tres placas con 25 microlitros de mezcla de reacción y cubra las placas con una película de PCR. Amplifique el ADN en cada placa usando un termociclador. Después de la amplificación, agrupe las tres placas replicadas en una sola placa de 96 pocillos.

Usando una hoja de cálculo de computadora, calcule el volumen de 100 nanogramos de cada muestra, así como el volumen promedio de todas las muestras. Para cada producto de PCR en blanco, agregue el volumen promedio calculado en un solo tubo de 1,5 mililitros. Para las muestras amplificadas con éxito, agrupe 100 nanogramos de cada muestra en el mismo tubo, luego mida la concentración del producto agrupado con un fluorómetro de sobremesa y eluya 600 nanogramos de ADN en agua de grado molecular hasta un volumen final de 100 microlitros en un tubo de 1,5 mililitros.

Almacene el producto restante a menos 20 grados centígrados. Antes de purificar la alícuota de ADN de 600 nanogramos, prepare 600 microlitros de etanol fresco al 70%. Siga el proceso de purificación por PCR establecido utilizando perlas paramagnéticas.

Agite el tubo de cuentas magnéticas para volver a suspender las cuentas que se depositan en la parte inferior. Agregue 1x volumen, 100 microlitros, de solución de perlas a la alícuota de 600 nanogramos de ADN. Mezcle bien la solución y las perlas pipeteando 10 veces.

Después de mezclar bien, incube la mezcla durante cinco minutos a temperatura ambiente. Coloque el tubo en el soporte magnético durante dos minutos o hasta que la solución esté clara para separar las perlas de la solución. Mantenga el tubo en el soporte, aspire el sobrenadante transparente con cuidado sin tocar las perlas magnéticas y deséchelo.

Deje el tubo en el soporte, agregue 300 microlitros de etanol al 70% al tubo e incube las perlas a temperatura ambiente durante 30 segundos. Aspire el etanol y deséchelo. Repita este proceso y elimine todo el etanol después del segundo lavado.

Retire el tubo del soporte magnético y seque el contenido al aire durante cinco minutos. Agregue 30 microlitros de agua de grado molecular a las perlas secas y mezcle pipeteando 10 veces. Incubar a temperatura ambiente durante dos minutos.

Regrese el tubo al soporte magnético durante un minuto para separar las perlas de la solución. Transfiera el eluido a un tubo nuevo. Mida la concentración final del ADN limpio y agrupado utilizando un fluorómetro de sobremesa.

Diluir una alícuota a 10 nanomolares en un volumen final de 30 microlitros o a la concentración y el volumen preferidos por la instalación de secuenciación. Después de la etapa de amplificación, se realizó la secuenciación para determinar la composición de la comunidad bacteriana de cada muestra. Una alineación de la secuencia de PNA con cada cloroplasto y el gen de ARN ribosómico mitocondrial 16S para la planta huésped investigada no debería revelar ninguna discrepancia.

Un solo desajuste con la secuencia de PNA de 13 pares de bases puede reducir drásticamente la efectividad, como en el caso de la secuencia de PNA de cloroplasto proporcionada y el gen de ARN ribosómico del cloroplasto 16S de Lactuca sativa o lechuga. Dado que se agrupó una cantidad igual de ADN amplificado por muestra, se obtuvo un número par de lecturas, que coinciden con los taxones bacterianos, por muestra después de la secuenciación, ordenadas en función de su índice de código de barras. Una vez dominada, esta técnica se puede realizar para ocho plantas en aproximadamente ocho horas.

Al intentar este procedimiento, es importante ser coherente entre los experimentos. Los pequeños detalles, como los cambios en el método de extracción de ADN y la mezcla maestra de PCR, pueden introducir sesgos. Siguiendo este procedimiento, se pueden utilizar otros métodos, como la metatranscriptómica, para responder a preguntas adicionales, como qué microbios están activos y qué genes están expresando.

No olvide que trabajar con nitrógeno líquido puede ser extremadamente peligroso y siempre se deben tomar precauciones como el uso de EPP adecuado al realizar este procedimiento.