Name: Explorar el microbioma de la raíz: extracción de datos de la comunidad bacteriana del suelo, rizosfera y raíz Endosphere (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-05-02T14:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 55 s
Description: Aprende a caracterizar el microbioma de raíces en suelo, rizosfera y endosfera mediante perfilado del gen 16S rRNA. Este protocolo estandarizado facilita el análisis de comunidades microbianas asociadas a plantas.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Este trabajo fue financiado por el USDA-ARS (CRIS 2030-21430-008-00D). TS es apoyado por el programa de becas de postgrado investigación de NSF.

1. recolección y separación de la raíz Endosphere, rizosfera y las muestras de suelo
<ol><li>Antes de entrar en el campo, agua ultrapura de autoclave (menos de 90 mL de agua por muestra) para esterilizar. Preparar el tampón de extracción epiphyte (por lo menos 25 mL por muestra) agregando 6,75 g de KH2PO4, 8,75 g de K2HPO4y 1 mL de Tritón X-100, a 1 L de agua estéril. Esterilizar el buffer con un filtro de vacío de tamaño de poro de 0,2 μm.<ol>
<li>Para pasos de 1.2 a 1.5, limpia guantes esterilizados con etanol en todo y cambiar los guantes entre cada muestra para evitar la contaminación. Esterilizar todo el equipo con etanol al 70% y limpie todo el equipo entre muestras. Antes de toma de muestras, determinar la profundidad de muestreo óptimo para su experimento y consistente con todas las colecciones de suelo y raíz.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Para recolectar muestras de suelo a granel, utilice un colector de base de suelo esterilizado de etanol para obtener suelo libre de raíces de la planta por la recogida de un núcleo de aproximadamente de 23 a 30 cm de la base de la planta.</li>
	<li>Transferir el suelo a una bolsa de plástico, homogeneizar el suelo agitando suave y transferir una alícuota de la muestra de suelo (aproximadamente 600 mg) para llenar un tubo de 2 mL. Inmediatamente Coloque el tubo de 2 mL en hielo seco o flash congele el tubo en el líquido N2 hasta que esté listo para proceder con la extracción de ADN (paso 2).<ol>
<li>En algunos entornos, el suelo circundante puede contener material vegetal. En este caso, utilizar un tamiz de 2 mm esterilizado para separar los restos vegetales del suelo antes de colocar en la bolsa de plástico.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Para recolectar las raíces y rizosfera, utilice una pala esterilizada de etanol para desenterrar la planta, cuidando de obtener tanto la raíz como sea posible. Profundidad depende de la planta. Mientras que pequeñas plantas como el trigo pueden ser quitadas por varios centímetros de excavación, plantas más grandes como el sorgo pueden requerir 30 cm o más. Suavemente sacuda el exceso de suciedad de las raíces hasta que hay aproximadamente 2 mm de suelo adheridas a la superficie de la raíz. Nota: tenga cuidado cuando se trabaja con plantas pequeñas, con raíces frágiles, o en suelos de contenido seco, alta-arcilla. Idealmente, sólo debería haber una capa delgada de suelo que queda en las raíces después de la sacudida. Si se mantienen grandes agregados de suelo, puede utilizarse un mazo de goma para desalojar la tierra golpeando suavemente la base del rodaje. Si la cantidad de suelo que queda después de este proceso excede o cae por debajo de 2 mm, el espesor aproximado debe señalarse.</li>
	<li>Para plantas grandes, uso estériles tijeras o Cizallas para cortar una subdivisión representativa de las raíces y colocar un mínimo de 500 mg de tejido de raíz en un frasco cónico de 50 mL. Para las hierbas más pequeñas, coloque todo el sistema de raíz en el frasco. Agregar suficiente buffer de remoción de epífitas para cubrir las raíces, luego coloque inmediatamente la muestra en hielo seco o flash congelar la muestra en líquido N2. Nota: tenga cuidado de no para sobrellenar el frasco cónico de 50 mL, como hará lavado de paso difícil. Debe haber suficiente espacio que el búfer de epífitas es capaz de fluir a la parte inferior, rodean las raíces en todo el frasco y la tapa. Debido a que algunas hierbas tienen más biomasa de la raíz que caben en un frasco cónico de 50 mL, una subdivisión de las raíces se debe recoger. Sin embargo, debe señalarse que corte las raíces podría conducir a bacterias endophytic ser lavadas fuera en la fracción de la rizosfera, rompiendo así las raíces debe reducirse al mínimo. Si las muestras no son procesadas inmediatamente después de regresar al laboratorio, puede conservarse a-80 ° C.</li>
	<li>Para separar la rizosfera de las raíces, descongelar la muestra de raíz en el hielo, luego someter a ultrasonidos las muestras de raíz a 4 ° C por 10 min con pulsos de 160 W por 30 s, separadas por 30 s. transferencia las raíces en una fría (4 ° C), limpiar 50 tubo mL utilizando pinzas estériles. No deseche el tubo original con buffer y suelo, que es la fracción de la rizosfera (figura 1).</li>
	<li>Centrifugar el tubo con tampón y rizosfera para flash 10 min a 4 ° C, 4.000 x g. decantar el sobrenadante, congelar el tubo que contiene la fracción de la rizosfera en líquido N2y almacenar la fracción de la rizosfera a-80 ° C hasta que esté listo para proceder con el ADN extracción (paso 2).</li>
	<li>Para lavar las raíces, añadir aproximadamente 20 mL de agua estéril fría (4 ° C) a la fracción de raíz. Lavar la raíz agitando vigorosamente (a mano o batidora, para 15-30 s) y luego drenar el agua.</li>
	<li>Repita este paso por lo menos dos veces, hasta que no suelo permanece en la superficie de la raíz. Si la extracción de ADN (paso 2) no se realiza inmediatamente, envuelva las raíces en papel de aluminio estéril, flash congelar las raíces en líquido N2y tienda las muestras a-80 ° C hasta listo para proceder con la extracción de ADN.</li>
</ol>2. extracción de ADN
Nota: A lo largo de los pasos 2 y 3, guantes limpios, esterilizados con etanol deben llevarse en todo momento y todo el trabajo debe realizarse sobre una superficie esterilizada con etanol.
<ol><li>Extraer el ADN de las muestras de suelo y rizósfera.<ol>
<li>Uso una espátula estéril para transferir rápidamente 250 mg del suelo y la rizosfera de los pasos 1.3 y 1.7 en los tubos de recogida proporciona en un kit de aislamiento de ADN comercial diseñado para la extracción del suelo, luego proceder con el aislamiento de ADN utilizando el proveedor de kit Protocolo.</li>
		<li>Después de liberador de la DNA en el tampón de elución proporcionada por el kit de aislamiento de DNA, guardar el ADN a-20 ° C hasta que esté listo para proceder con el paso 3.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Extraer el ADN de las muestras de raíz.<ol>
<li>Enfriar un mortero esterilizado y Maja usando líquido N2. Mida 600 a 700 mg de raíz tejido y coloque el tejido en el mortero. Cuidadosamente, agregue suficiente líquido N2 para cubrir las raíces.</li>
		<li>Moler las raíces en trozos pequeños. Continuar con el proceso de agregar líquido N2 y pulido (por lo menos dos veces, ser coherente entre las muestras), hasta que las raíces son un polvo fino. Asegúrese de que el tejido de la raíz no descongelar durante este paso. PRECAUCIÓN: Use equipo de protección personal (bata, gafas protectoras y Guantes criogénicos) cuando trabajan con líquido N2. Nota: Para una extracción de ADN de baja calidad, puede ser beneficioso moler raíces exceso en polvo y guardar el polvo a-80 ° C.</li>
		<li>Rápidamente, antes de la raíz en polvo comienza a descongelar, utilizar una espátula estéril para transferir el polvo de la raíz en tubos de 1,5 mL previamente pesado en el hielo. Registrar el peso del tubo y el polvo. Por lo general, se transfiere 300-400 mg de polvo.</li>
		<li>Uso una espátula estéril para transferir rápidamente 150 mg de polvo de la raíz para el tubo de la colección en un kit de aislamiento de ADN comercial diseñado para la extracción del suelo, luego proceder con el aislamiento de la DNA usando el protocolo del proveedor de kit. Nota: Para algunas muestras de raíz, puede haber una alta concentración de materia orgánica remanente en el pellet de ADN, lo que impide la amplificación de la DNA durante PCR, especialmente cuando un protocolo de extracción de ADN diferente (por ej., extracción CTAB) se utiliza. Si es necesario, limpie el ADN siguiendo las instrucciones proporcionadas en el kit de limpieza ambiental de ADN.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Medir la concentración de todas las muestras de ADN con un fluorómetro de sobremesa de alta sensibilidad.<ol>
<li>Añadir 1-20 μl de cada muestra de ADN eluída en tubos en el kit de ensayo de alta sensibilidad de dsDNA. Añadir solución de trabajo de Fluorímetro (tinte: tampón de 1: 200) hasta 200 μl.</li>
		<li>Preparar dos tubos adicionales con 10 μl de ADN estándar 1 (0 ng/μl de ADN) o 10 μl de estándar 2 (100 ng/μL) y añadir 190 μl de solución de trabajo de Fluorímetro a cada estándar.</li>
		<li>Medir la concentración de cada muestra y los estándares. Si no se realiza automáticamente, calcular la concentración de ADN de la salida de la absorbancia de una regresión lineal de los dos estándares.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. productos biblioteca preparación y presentación
<ol><li>Crear materiales para la reacción de amplificación.<ol>
<li>Descongelar las muestras de ADN a 4 º C y mantenerse en hielo en el paso 3. Aleatorizar el orden de las muestras de ADN para minimizar el sesgo debido a la ubicación de la placa PCR (tabla 2).</li>
		<li>En una placa PCR de 96 pocillos, Diluya el ADN de cada muestra de agua molecular grado a 5 ng/μL en un volumen total de 20 μl. agregar 20 μl de agua de grado molecular a los pozos de cuatro esquinas como controles negativos para la amplificación (espacios en blanco) (tabla 2).</li>
		<li>Organizar los cebadores con código de barras (10 μm) en tubos PCR tira o en una placa de 96 pocillos que se puede añadir con una pipeta multicanal (figura 2).</li>
		<li>Preparar suficiente mezcla maestra de PCR para amplificar cada muestra de ADN por triplicado. Preparar 1,5 μl de BSA (20 mg/mL), 37.5 μl de prefabricadas 2 x master mix (compuesto de buffer PCR, dNTPs, MgCl2y Taq ADN polimerasa), 0.57 μl de cloroplasto PNA (100 μm), 0.57 μl de ANP mitocondrial (100 μm) y 25.86 μl de agua de grado molecular.</li>
		<li>Vierta la mezcla principal en un estéril 25 mL del reservorio de la pipeta multicanal y distribuir 66 μl de la master mix a cada pocillo de una placa PCR de 96 pocillos nueva utilizando una pipeta multicanal. Nota: Al calcular los volúmenes de reactivo para la mezcla principal, asegúrese de incluir también los pocillos del blanco 4 por placa.</li>
		<li>Usando una pipeta multicanal, añadir 6 μl de 5 ng/μl de ADN (de la placa normalizada de ADN) a la placa de mezcla principal. Luego añadir a la placa principal 1,5 μl del primer avance de 10 μm que cada columna tiene un diferente código de barras hacia delante y 1,5 μl de 10 μm inversa primer tal que cada fila tiene un código de barras diferentes inversa (figura 2). Nota: Antes de la adición de iniciadores, las placas al azar y mezcla principal podrían utilizarse para amplificar los genes de hongos ITS o ITS2 si se agregaron diferentes cartillas. Si este es el caso, puede utilizarse un diseño similar de la cartilla.</li>
		<li>Giro de la placa brevemente a 3.000 x g. Utilice una pipeta de varios canales para mezclar suavemente, luego se dividen en tres placas con 25 μl de mezcla de reacción. Nota: Aunque no son estrictamente necesarios tres repeticiones, disminuye el impacto de la variabilidad técnica.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Amplificar el ADN en cada placa utilizando un termociclador a las siguientes condiciones: 180 s a 98 ° C, 30 ciclos de: 98 ° C por 45 s (desnaturalización), 78 ° C durante 10 s (PNA recocido), 55 ° C durante 60 s (primer recocido) y 72 ° C durante 90 s (extensión) , entonces 600 s a 72 ° C seguido de un 4 ° C mantener paso. Después de la amplificación, la piscina las tres placas replicadas en una sola placa de 96 pocillos.</li>
	<li>Cuantificar el ADN utilizando los reactivos de alta sensibilidad Fluorímetro en un lector de placa de 96 pocillos.<ol>
<li>Añadir 2 μl de cada producto PCR a una microplaca de 96 pozos, junto con 98 μl de solución de trabajo de Fluorímetro (tinte: tampón de 1: 200). Incluyen 4 pozos como estándares: 5 μl de ADN estándar 1 (0 ng/μl de ADN), 1 μl de estándar 2 (10 ng/μL), 2 μl de estándar 2 (20 ng/μL) y 5 μl de estándar de 2 (50 ng/μL). A continuación Agregar solución de trabajo de Fluorímetro para un volumen final de 100 μl. Nota: Cada muestra puede medirse con un fluorómetro de sobremesa como se describe en el paso 2.3, si no hay un lector de placas.</li>
		<li>Calcular la concentración de ADN de la salida de la absorbancia de una regresión lineal de los cuatro estándares.</li>
		<li>Para el código de barras con éxito amplificado productos (aquellos que tienen una concentración mayor de 15 ng/μL), piscina 100 ng de cada muestra en un tubo de 1,5 mL sola (tabla 2).</li>
		<li>Calcular el volumen promedio de muestras de agregado a la piscina mediante la función =AVERAGE() en un programa de hoja de cálculo. Añadir el volumen de los productos PCR "en blanco" a las muestras agrupadas. Nota: Puesto que los productos PCR "en blanco" tienen sus propias combinaciones de código de barras único, puede secuenciados para verificar cualquier contaminante de laboratorio.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Medir la concentración del producto combinado con un fluorómetro de sobremesa como se describe en el paso 2.3 y tomar 600 ng de ADN y diluir en agua grado molecular a un volumen final de 100 μL en un tubo de 1,5 mL. Almacenar el producto combinado restantes a-20 ° C.</li>
	<li>Lavar el ADN ng 600 alícuota siguiendo el proceso establecido de purificación PCR con granos de purificación paramagnética en un formato de 96 pocillos con unas pocas excepciones.<ol>
<li>Hacer un fresco 600 μl alícuota de etanol al 70%. Agite la botella de bolas magnéticas para resuspender los granos que se colocan en la parte inferior.</li>
		<li>Agregar 1 volumen x (100 μL) de solución de grano a la 600 alícuota ng de ADN. Mezclar bien mediante pipeteo 10 veces. Incubar por 5 min a temperatura ambiente.</li>
		<li>Coloque el tubo en el soporte magnético de 2 minutos (o hasta que la solución esté clara) para separar los granos de la solución. Mientras el tubo está en el soporte magnético, aspirar el sobrenadante con cuidado sin tocar las bolas magnéticas y descartar el sobrenadante. Nota: en este punto, los productos de productos están limitados a las bolas magnéticas. Cualquier granos que son perturbada o perdida durante la aspiración resultará en una pérdida de ADN.</li>
		<li>Dejar el tubo en el soporte magnético y añadir 300 μL de etanol al 70% al tubo; incubar a temperatura ambiente durante 30 s. aspirado el etanol y el descarte. Repita este proceso y etanol todos después del segundo lavado. Retire el tubo del soporte magnético y aire seco durante 5 minutos.</li>
		<li>Añadir 30 μl de agua molecular grado a los granos secos y mezclar mediante pipeteo 10 veces. Incubar a temperatura ambiente durante 2 min vuelta el tubo al soporte magnético durante 1 minuto para separar los granos de la solución. Transferir el efluente a un tubo nuevo. Nota: Granos magnéticos no afectará las reacciones posteriores.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Medir la concentración final de limpiar, ADN combinado con un fluorómetro de sobremesa como se describe en el paso 2.3. Diluir una alícuota de 10 nM en un volumen final de 30 μL, o a la concentración y volumen preferido por la facilidad de la secuencia.</li>
	<li>Utilizar los servicios de un establecimiento de secuencia a secuencia de la DNA en una plataforma NGS, 2 x 300 bp final emparejado la secuencia.</li>
</ol>

<ol><li>Goodwin, S., McPherson, J. D., McCombie, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coming+of+age%3A+ten+years+of+next-generation+sequencing+technologies%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Genet%22%5BJournal%5D)">Coming of age: ten years of next-generation sequencing technologies.</a> Nat Rev Genet. 17 (6), 333-351 (2016).</li>
<li>Soergel, D. A. W., Dey, N., Knight, R., Brenner, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selection+of+primers+for+optimal+taxonomic+classification+of+environmental+16S+rRNA+gene+sequences%5BTitle%5D)+AND+%22ISME+J%22%5BJournal%5D)">Selection of primers for optimal taxonomic classification of environmental 16S rRNA gene sequences.</a> ISME J. 6 (7), 1440-1444 (2012).</li>
<li>Takahashi, S., Tomita, J., Nishioka, K., Hisada, T., Nishijima, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+Prokaryotic+Universal+Primer+for+Simultaneous+Analysis+of+Bacteria+and+Archaea+Using+Next-Generation+Sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Development of a Prokaryotic Universal Primer for Simultaneous Analysis of Bacteria and Archaea Using Next-Generation Sequencing.</a> PLoS One. 9 (8), e105592(2014).</li>
<li>Poretsky, R., Rodriguez-R, L. M., Luo, C., Tsementzi, D., Konstantinidis, K. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Strengths+and+Limitations+of+16S+rRNA+Gene+Amplicon+Sequencing+in+Revealing+Temporal+Microbial+Community+Dynamics%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Strengths and Limitations of 16S rRNA Gene Amplicon Sequencing in Revealing Temporal Microbial Community Dynamics.</a> PLoS One. 9 (4), e93827(2014).</li>
<li>Sharpton, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+introduction+to+the+analysis+of+shotgun+metagenomic+data%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Plant+Sci%22%5BJournal%5D)">An introduction to the analysis of shotgun metagenomic data.</a> Front Plant Sci. 5, 209(2014).</li>
<li>Jiao, J. -Y., Wang, H. -X., Zeng, Y., Shen, Y. -M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enrichment+for+microbes+living+in+association+with+plant+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22J+Appl+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Enrichment for microbes living in association with plant tissues.</a> J Appl Microbiol. 100 (4), 830-837 (2006).</li>
<li>Richter-Heitmann, T., Eickhorst, T., Knauth, S., Friedrich, M. W., Schmidt, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+Strategies+to+Separate+Root-Associated+Microbial+Communities%3A+A+Crucial+Choice+in+Rhizobiome+Research%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Evaluation of Strategies to Separate Root-Associated Microbial Communities: A Crucial Choice in Rhizobiome Research.</a> Front Microbiol. 7, 773(2016).</li>
<li>Mahmoudi, N., Slater, G. F., Fulthorpe, R. R., Mahmoudi, N., Slater, G. F., Fulthorpe, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+commercial+DNA+extraction+kits+for+isolation+and+purification+of+bacterial+and+eukaryotic+DNA+from+PAH-contaminated+soils%5BTitle%5D)+AND+%22Can+J+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Comparison of commercial DNA extraction kits for isolation and purification of bacterial and eukaryotic DNA from PAH-contaminated soils.</a> Can J Microbiol. 5709, 623-628 (2011).</li>
<li>Vishnivetskaya, T. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Commercial+DNA+extraction+kits+impact+observed+microbial+community+composition+in+permafrost+samples%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS+Microbiol+Ecol%22%5BJournal%5D)">Commercial DNA extraction kits impact observed microbial community composition in permafrost samples.</a> FEMS Microbiol Ecol. 87 (1), 217-230 (2014).</li>
<li>Busby, P. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Research+priorities+for+harnessing+plant+microbiomes+in+sustainable+agriculture%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biol%22%5BJournal%5D)">Research priorities for harnessing plant microbiomes in sustainable agriculture.</a> PLoS Biol. 15 (3), e2001793(2017).</li>
<li>Thompson, L. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+communal+catalogue+reveals+Earth%27s+multiscale+microbial+diversity%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A communal catalogue reveals Earth's multiscale microbial diversity.</a> Nature. , (2017).</li>
<li>Caporaso, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultra-high-throughput+microbial+community+analysis+on+the+Illumina+HiSeq+and+MiSeq+platforms%5BTitle%5D)+AND+%22ISME+J%22%5BJournal%5D)">Ultra-high-throughput microbial community analysis on the Illumina HiSeq and MiSeq platforms.</a> ISME J. 6 (8), 1621-1624 (2012).</li>
<li>Kozich, J. J., Westcott, S. L., Baxter, N. T., Highlander, S. K., Schloss, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+Dual-Index+Sequencing+Strategy+and+Curation+Pipeline+for+Analyzing+Amplicon+Sequence+Data+on+the+MiSeq+Illumina+Sequencing+Platform%5BTitle%5D)+AND+%22Appl+Environ+Microb%22%5BJournal%5D)">Development of a Dual-Index Sequencing Strategy and Curation Pipeline for Analyzing Amplicon Sequence Data on the MiSeq Illumina Sequencing Platform.</a> Appl Environ Microb. 79 (17), 5112-5120 (2013).</li>
<li>Degnan, P. H., Ochman, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Illumina-based+analysis+of+microbial+community+diversity%5BTitle%5D)+AND+%22ISME+J%22%5BJournal%5D)">Illumina-based analysis of microbial community diversity.</a> ISME J. 6 (1), 183-194 (2012).</li>
<li>Naylor, D., DeGraaf, S., Purdom, E., Coleman-Derr, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drought+and+host+selection+influence+bacterial+community+dynamics+in+the+grass+root+microbiome%5BTitle%5D)+AND+%22ISME+J%22%5BJournal%5D)">Drought and host selection influence bacterial community dynamics in the grass root microbiome.</a> ISME J. , (2017).</li>
<li>Desgarennes, D., Garrido, E., Torres-Gomez, M. J., Peña-Cabriales, J. J., Partida-Martinez, L. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diazotrophic+potential+among+bacterial+communities+associated+with+wild+and+cultivated+Agave+species%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS+Microbiol+Ecol%22%5BJournal%5D)">Diazotrophic potential among bacterial communities associated with wild and cultivated Agave species.</a> FEMS Microbiol Ecol. 90 (3), 844-857 (2014).</li>
<li>Coleman-Derr, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plant+compartment+and+biogeography+affect+microbiome+composition+in+cultivated+and+native+Agave+species%5BTitle%5D)+AND+%22New+Phytol%22%5BJournal%5D)">Plant compartment and biogeography affect microbiome composition in cultivated and native Agave species.</a> New Phytol. 209 (2), 798-811 (2016).</li>
<li>De Tender, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamics+in+the+Strawberry+Rhizosphere+Microbiome+in+Response+to+Biochar+and+Botrytis+cinerea+Leaf+Infection%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Dynamics in the Strawberry Rhizosphere Microbiome in Response to Biochar and Botrytis cinerea Leaf Infection.</a> Front Microbiol. 7, 2062(2016).</li>
<li>Kapp, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Variation+in+pre-PCR+processing+of+FFPE+samples+leads+to+discrepancies+in+BRAF+and+EGFR+mutation+detection%3A+a+diagnostic+RING+trial%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Pathol%22%5BJournal%5D)">Variation in pre-PCR processing of FFPE samples leads to discrepancies in BRAF and EGFR mutation detection: a diagnostic RING trial.</a> J Clin Pathol. 68 (2), 111-118 (2015).</li>
<li>Simbolo, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+qualification+workflow+for+next+generation+sequencing+of+histopathological+samples%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">DNA qualification workflow for next generation sequencing of histopathological samples.</a> PLoS One. 8 (6), e62692(2013).</li>
<li>O'Neill, M., McPartlin, J., Arthure, K., Riedel, S., McMillan, N. <a target="_blank" href="http://iopscience.iop.org/article/10.1088/1742-6596/307/1/012047/meta">Comparison of the TLDA with the Nanodrop and the reference Qubit system.</a> J Phys Conf Ser. 307 (1), 012047(2011).</li>
<li>Callahan, B. J., McMurdie, P. J., Rosen, M. J., Han, A. W., Johnson, A. J. A., Holmes, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DADA2%3A+High-resolution+sample+inference+from+Illumina+amplicon+data%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">DADA2: High-resolution sample inference from Illumina amplicon data.</a> Nat Methods. 13 (7), 581-583 (2016).</li>
<li>Amir, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deblur+Rapidly+Resolves+Single-Nucleotide+Community+Sequence+Patterns%5BTitle%5D)+AND+%22mSystems%22%5BJournal%5D)">Deblur Rapidly Resolves Single-Nucleotide Community Sequence Patterns.</a> mSystems. 2 (2), e00191-e00116 (2017).</li>
<li>Edgar, R. C. <a target="_blank" href="https://www.biorxiv.org/content/early/2016/10/15/081257">UNOISE2: improved error-correction for Illumina 16S and ITS amplicon sequencing.</a> bioRxiv. , 081257(2016).</li>
<li>Nguyen, N. -P., Warnow, T., Pop, M., White, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+perspective+on+16S+rRNA+operational+taxonomic+unit+clustering+using+sequence+similarity%5BTitle%5D)+AND+%22NPJ+Biofilms+Microbiomes%22%5BJournal%5D)">A perspective on 16S rRNA operational taxonomic unit clustering using sequence similarity.</a> NPJ Biofilms Microbiomes. 2, 16004(2016).</li>
<li>Callahan, B. J., McMurdie, P. J., Holmes, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exact+sequence+variants+should+replace+operational+taxonomic+units+in+marker-gene+data+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22ISME+J%22%5BJournal%5D)">Exact sequence variants should replace operational taxonomic units in marker-gene data analysis.</a> ISME J. , (2017).</li>
<li>Lundberg, D. S., Yourstone, S., Mieczkowski, P., Jones, C. D., Dangl, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Practical+innovations+for+high-throughput+amplicon+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Practical innovations for high-throughput amplicon sequencing.</a> Nat Methods. 10 (10), 999-1002 (2013).</li>
<li>O'Brien, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatial+scale+drives+patterns+in+soil+bacterial+diversity%5BTitle%5D)+AND+%22Environ+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Spatial scale drives patterns in soil bacterial diversity.</a> Environ Microbiol. 18 (6), 2039-2051 (2016).</li>
<li>Fierer, N., Lennon, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+generation+and+maintenance+of+diversity+in+microbial+communities%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Bot%22%5BJournal%5D)">The generation and maintenance of diversity in microbial communities.</a> Am J Bot. 98 (3), 439-448 (2011).</li>
<li>Fierer, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Embracing+the+unknown%3A+disentangling+the+complexities+of+the+soil+microbiome%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Embracing the unknown: disentangling the complexities of the soil microbiome.</a> Nat Rev Microbiol. 15 (10), 579-590 (2017).</li>
<li>Buckley, D. H., Schmidt, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diversity+and+dynamics+of+microbial+communities+in+soils+from+agro-ecosystems%5BTitle%5D)+AND+%22Environ+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Diversity and dynamics of microbial communities in soils from agro-ecosystems.</a> Environ Microbiol. 5 (6), 441-452 (2003).</li>
<li>Salter, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reagent+and+laboratory+contamination+can+critically+impact+sequence-based+microbiome+analyses%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Biol%22%5BJournal%5D)">Reagent and laboratory contamination can critically impact sequence-based microbiome analyses.</a> BMC Biol. 12, 87(2014).</li>
<li>Weiss, S., Amir, A., Hyde, E. R., Metcalf, J. L., Song, S. J., Knight, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tracking+down+the+sources+of+experimental+contamination+in+microbiome+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biol%22%5BJournal%5D)">Tracking down the sources of experimental contamination in microbiome studies.</a> Genome Biol. 15 (12), 564(2014).</li>
<li>Sutlović, D., Definis Gojanović, M., Andelinović, S., Gugić, D., Primorac, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Taq+polymerase+reverses+inhibition+of+quantitative+real+time+polymerase+chain+reaction+by+humic+acid%5BTitle%5D)+AND+%22Croat+Med+J%22%5BJournal%5D)">Taq polymerase reverses inhibition of quantitative real time polymerase chain reaction by humic acid.</a> Croat Med J. 46 (4), 556-562 (2005).</li>
<li>Sutlovic, D., Gamulin, S., Definis-Gojanovic, M., Gugic, D., Andjelinovic, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interaction+of+humic+acids+with+human+DNA%3A+proposed+mechanisms+and+kinetics%5BTitle%5D)+AND+%22Electrophoresis%22%5BJournal%5D)">Interaction of humic acids with human DNA: proposed mechanisms and kinetics.</a> Electrophoresis. 29 (7), 1467-1472 (2008).</li>
<li>Aleklett, K., Leff, J. W., Fierer, N., Hart, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wild+plant+species+growing+closely+connected+in+a+subalpine+meadow+host+distinct+root-associated+bacterial+communities%5BTitle%5D)+AND+%22PeerJ%22%5BJournal%5D)">Wild plant species growing closely connected in a subalpine meadow host distinct root-associated bacterial communities.</a> PeerJ. 3, e804(2015).</li>
<li>Bogas, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endophytic+bacterial+diversity+in+the+phyllosphere+of+Amazon+Paullinia+cupana+associated+with+asymptomatic+and+symptomatic+anthracnose%5BTitle%5D)+AND+%22Springerplus%22%5BJournal%5D)">Endophytic bacterial diversity in the phyllosphere of Amazon Paullinia cupana associated with asymptomatic and symptomatic anthracnose.</a> Springerplus. 4, 258(2015).</li>
<li>Hiscox, J., Savoury, M., Müller, C. T., Lindahl, B. D., Rogers, H. J., Boddy, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Priority+effects+during+fungal+community+establishment+in+beech+wood%5BTitle%5D)+AND+%22ISME+J%22%5BJournal%5D)">Priority effects during fungal community establishment in beech wood.</a> ISME J. 9 (10), 2246-2260 (2015).</li>
<li>Zhang, T., Yao, Y. -F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endophytic+Fungal+Communities+Associated+with+Vascular+Plants+in+the+High+Arctic+Zone+Are+Highly+Diverse+and+Host-Plant+Specific%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Endophytic Fungal Communities Associated with Vascular Plants in the High Arctic Zone Are Highly Diverse and Host-Plant Specific.</a> PLoS One. 10 (6), e0130051(2015).</li>
<li>Ghyselinck, J., Pfeiffer, S., Heylen, K., Sessitsch, A., De Vos, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effect+of+primer+choice+and+short+read+sequences+on+the+outcome+of+16S+rRNA+gene+based+diversity+studies%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">The effect of primer choice and short read sequences on the outcome of 16S rRNA gene based diversity studies.</a> PLoS One. 8 (8), e71360(2013).</li>
<li>Wintzingerode, F., Landt, O., Ehrlich, A., Göbel, U. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Peptide+nucleic+acid-mediated+PCR+clamping+as+a+useful+supplement+in+the+determination+of+microbial+diversity%5BTitle%5D)+AND+%22Appl+Environ+Microb%22%5BJournal%5D)">Peptide nucleic acid-mediated PCR clamping as a useful supplement in the determination of microbial diversity.</a> Appl Environ Microb. 66 (2), 549-557 (2000).</li>
<li>Cruaud, P., Vigneron, A., Lucchetti-Miganeh, C., Ciron, P. E., Godfroy, A., Cambon-Bonavita, M. -A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Influence+of+DNA+extraction+method%2C+16S+rRNA+targeted+hypervariable+regions%2C+and+sample+origin+on+microbial+diversity+detected+by+454+pyrosequencing+in+marine+chemosynthetic+ecosystems%5BTitle%5D)+AND+%22Appl+Environ+Microb%22%5BJournal%5D)">Influence of DNA extraction method, 16S rRNA targeted hypervariable regions, and sample origin on microbial diversity detected by 454 pyrosequencing in marine chemosynthetic ecosystems.</a> Appl Environ Microb. 80 (15), 4626-4639 (2014).</li>
<li>Yang, B., Wang, Y., Qian, P. -Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sensitivity+and+correlation+of+hypervariable+regions+in+16S+rRNA+genes+in+phylogenetic+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">Sensitivity and correlation of hypervariable regions in 16S rRNA genes in phylogenetic analysis.</a> BMC Bioinformatics. 17, 135(2016).</li>
</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

Este protocolo muestra una tubería establecida para explorar endosphere raíz, rizosfera y composiciones de comunidad microbiana del suelo, del muestreo de campo para el procesamiento de las muestras y la secuenciación descendente. Microbiomes asociada a raíz de estudiar presenta desafíos únicos, debido en parte a las dificultades inherentes en el muestreo de suelo. Suelos altamente variable en términos de propiedades físicas y químicas, y diferentes condiciones de suelo pueden ser separadas por tan sólo unos milímetros d...

Microbiomes asociada a la planta consisten en dinámicas y complejas de las comunidades microbianas de bacterias, arqueas, virus, hongos y otros microorganismos eucariotas. Además de su función bien estudiado como causa de enfermedad de plantas, microbios asociados planta pueden influir también positivamente en sanidad vegetal por mejorar la tolerancia a estreses bióticos y abióticos, promover la disponibilidad de nutrientes y mejorar el crecimiento de las plantas a través de la producción de fitohormonas. Por esta razón, existe particular interés en la caracterización de los taxa que se asocian con la planta raíz endospheres, rhizospheres y el suelo circundante. Mientras que algunos microbios pueden ser cultivadas en aislamiento en laboratorio generado medios de comunicación, muchos no pueden, en parte porque puede depender de relaciones simbióticas con otros microorganismos, crecen muy lentamente, o requieren condiciones que no pueden repetirse en un entorno de laboratorio. Porque evita la necesidad de cultivo y es relativamente barato y de alto rendimiento, perfiles filogenéticos basados en la secuencia de muestras ambientales y asociado anfitrión microbianas ha convertido en un método preferido para el análisis de la comunidad microbiana composición.
La selección de tecnologías de secuenciación adecuada proporcionada por varios generación sequencing (NGS) plataformas1 depende de las necesidades del usuario, con factores importantes como: la cobertura deseada, longitud del amplicón, espera que la comunidad diversidad, así como tasa de error, lectura de longitud y el costo-por-run/megabase de secuenciación. Otra variable que debe considerarse en los experimentos de secuenciación basada en productos es lo que gene se amplificarán y qué iniciadores se utilizará. Al diseñar o elegir cebadores, los investigadores a menudo se ven obligados a hacer realizables de los amplicones resultante entre la universalidad de la amplificación y la resolución taxonómica. Por esta razón, este tipo de estudios eligió a menudo cartillas y marcadores dirigidos selectivamente a subconjuntos específicos de la microbioma. Evaluación de la composición de comunidades bacterianas comúnmente se logra ordenando uno o más de las regiones hipervariables de bacteriano 16S rRNA gene2,3. En este estudio, describimos un amplicon basado en protocolo de secuenciación desarrollado para una plataforma NGS esa región de bp V3-V4 de objetivos el 500 del gene del rRNA 16S bacteriano, que permite la amplificación amplia de taxones bacterianos mientras que también proporciona suficiente variabilidad para distinguir entre diferentes taxones. Además, este protocolo puede ser fácilmente adaptado para el uso con otros conjuntos de la cartilla, como los dirigidos al marcador ITS2 de hongos o la subunidad rRNA de 18S de los eucariotas.
Mientras que otros enfoques tales como metagenómica de escopeta, metatranscriptomics y secuenciación unicelular, ofrecen otras ventajas incluyendo genomas microbianos resueltos y medición más directa de la función de la comunidad, estas técnicas son generalmente más caro y cálculo intensivo de los perfiles filogenéticos describen aquí4. Además, realizar escopeta metagenómica y metatranscriptomics en muestras de raíz produce un gran porcentaje de lecturas que el genoma de la planta huésped, y métodos para superar esta limitación todavía están siendo desarrollados5,6.
Como con cualquier plataforma experimental, basada en productos de perfiles pueden introducir a una serie de sesgos potenciales que deben considerarse en el análisis de datos y diseño experimental. Estos incluyen los métodos de recogida de muestras ADN extracción, selección de iniciadores PCR, y cómo se realiza la preparación de la biblioteca. Diferentes métodos pueden afectar significativamente la cantidad de datos utilizables generados y también pueden obstaculizar los esfuerzos para comparar resultados entre estudios. Por ejemplo, el método de eliminación de bacterias de rizósfera7 y el uso de técnicas de extracción diferentes o elección de ADN de8,de kits de extracción9 han demostrado a un impacto significativo en análisis posteriores, que conduce a conclusiones diferentes sobre cuáles microbios están presentes y su abundancia relativa. Desde perfiles basados en los productos pueden ser modificado para requisitos particulares, puede ser difícil hacer comparaciones entre los estudios. El proyecto del microbioma de tierra ha sugerido que los investigadores estudiando sistemas complejos como el microbioma asociado de planta beneficiaría el desarrollo de protocolos estándares como un medio de reducir al mínimo la variabilidad causada por la aplicación de diferentes métodos entre los estudios10,11. Aquí, discutimos muchos de los temas mencionados y ofrecen sugerencias sobre las mejores prácticas de donde proceda.
El protocolo muestra el proceso de recoger muestras de suelo, rizósfera y raíz de Sorghum bicolor y extracción del ADN mediante un ADN bien establecida aislamiento kit11. Además, nuestro protocolo incluye un flujo de trabajo de la secuencia detallada de productos, utilizando una plataforma NGS comúnmente utilizada, para determinar la estructura de las comunidades bacterianas12,13,14. Este protocolo ha sido validada para el uso en una amplia gama de anfitriones de la planta en un reciente estudio publicado de las raíces, rizosfera y asociados-suelos de 18 especies de monocotiledóneas, incluyendo sorgo bicolor, Zea mays y Triticum aestivum15. Este método también ha sido validado para su uso con otros genes marcadores, como lo demuestra su exitosa aplicación al estudio de los hongos ITS2 gen marcador en estudios de agave microbioma16,17 y microbioma fresa 18.

<table><tbody><tr><td>0.1-10/20 y micro; L puntas de micropipeta filtradas</td><td>USA Scientific</td><td>1120-3810</td><td>Se pueden sustituir por equivalentes de otros proveedores.</td></tr><tr><td>Tubos de microcentrífuga de 1,5 mL USA</td><td>Scientific</td><td>1615-5510</td><td>Se pueden sustituir por equivalentes de otros proveedores.</td></tr><tr><td>10 y micro; L pipeta multicanal</td><td>Eppendorf</td><td>3122000027</td><td>Se puede sustituir por equivalentes de otros proveedores.</td></tr><tr><td>10 y micro; L, 100 y micro; L, y 1000 &micro; L micropipetas</td><td>Eppendorf</td><td>3120000909</td><td>Se pueden sustituir por equivalentes de otros proveedores.</td></tr><tr><td>100 y micro; L pipeta multicanal</td><td>Eppendorf</td><td>3122000043</td><td>Se puede sustituir por equivalentes de otros proveedores.</td></tr><tr><td>1000 y micro; L puntas de micropipeta filtradas</td><td>USA Scientific</td><td>1122-1830</td><td>Se pueden sustituir por equivalentes de otros proveedores.</td></tr><tr><td>Tubos de microcentrífuga de 2 mL USA</td><td>Scientific</td><td>1620-2700</td><td>Se pueden sustituir por equivalentes de otros proveedores.</td></tr><tr><td>Tamiz de suelo de 2 mm</td><td>Proveedores forestales 60141009</td><td></td><td>Puede sustituir con equivalentes de otros proveedores.</td></tr><tr><td>200 y micro; L puntas de micropipeta filtradas</td><td>USA Scientific</td><td>1120-8810</td><td>Se pueden sustituir por equivalentes de otros proveedores.</td></tr><tr><td>Depósitos de 25 ml</td><td>VWR International LLC</td><td>89094-664</td><td>Se pueden sustituir por equivalentes de otros proveedores.</td></tr><tr><td>Viales cónicos de 50 mL Thermo</td><td>Fisher Scientific</td><td>352098</td><td>Se pueden sustituir por equivalentes de otros proveedores.</td></tr><tr><td>Filtros de vacío de 500 mL (0,2 y micro; tamaño de poro m)</td><td>VWR International LLC</td><td>156-4020</td><td></td></tr><tr><td>Microplacas de 96 pocillos</td><td>USA Scientific</td><td>655900</td><td></td></tr><tr><td>Placas de PCR de 96 pocillos</td><td>BioRad</td><td>HSP9631</td><td></td></tr><tr><td>Agencourt AMPure XP Beads</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>NC9933872</td><td>Instrucciones de uso: https://www.beckmancoulter.com/wsrportal/ajax/downloadDocument/B37419AA.pdf?autonomyId=TP_DOC_150180 &documentName=B37419AA.pdf</td></tr><tr><td>Papel de aluminio</td><td>Boardwalk</td><td>7124</td><td>Puede sustituir con equivalentes de otros proveedores.</td></tr><tr><td>Báscula analítica con resolución de 0,001 g</td><td>Ohaus Pioneer</td><td>PA323</td><td>Se puede sustituir por equivalente de otros proveedores.</td></tr><tr><td>Bioruptor Plus ultrasonido</td><td>Diagenode</td><td>B01020001</td><td></td></tr><tr><td>Albúmina sérica bovina (BSA) 20 mg/mL</td><td>Centrífuga New England Biolabs</td><td>B9000S</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Eppendorf</td><td>5811000908</td><td>Incluye adaptadores de cubo de placa de 50 ml y 96 pocillos</td></tr><tr><td>Guantes criogénicos</td><td>Millipore Sigma</td><td>Z183490</td><td>Puede sustituir con equivalentes de otros proveedores.</td></tr><tr><td>Kit DNeasy PowerClean (opcional)</td><td>Qiagen Inc.</td><td>12877-50</td><td>Anteriormente MoBio</td></tr><tr><td>DNeasy PowerSoil kit</td><td>Qiagen Inc.</td><td>12888-100</td><td>Anteriormente MoBio</td></tr><tr><td>Hielo seco</td><td>Cualquier</td><td></td> imán NA <td></td></tr><tr><td>DynaMag-2</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>12321D</td><td>No sustituya</td></tr> el <tr><td>etanol</td><td>VWR International LLC</td><td>89125-188</td><td>Puede sustituirlo por un equivalente de otros proveedores.</td></tr><tr><td>Bolsas para congelador del tamaño de un galón</td><td>Ziploc</td><td>NA</td><td>Se pueden sustituir con equivalentes de otros proveedores.</td></tr><tr><td>Lector de microplacas Gemini EM</td><td>Molecular Devices</td><td>EM</td><td>Puede usar otro fluorómetro que lee placas de 96 pocillos desde la parte superior.</td></tr><tr><td>K2HPO4</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P3786</td><td></td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5655</td><td></td></tr><tr><td>Bata de laboratorio</td><td>Workrite</td><td>J1367</td><td>Puede sustituirse por equivalentes de otros proveedores.</td></tr><tr><td>Líquido N2</td><td>Cualquier</td><td>NA</td><td>puede sustituirse por equivalente de otros proveedores.</td></tr><tr><td>Líquido N2 dewar</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>4150-9000</td><td>Puede sustituir con equivalente de otros proveedores.</td></tr><tr><td>Sistema de purificación de agua ultrapura Milli-Q</td><td>Millipore Sigma</td><td>SYNS0R0WW</td><td></td></tr><tr><td>Minicentrífuga</td><td>Eppendorf</td><td>5404000014</td><td></td></tr><tr><td>Agua de grado molecular</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>4387937</td><td>Puede sustituir con equivalentes de otros proveedores.</td></tr><tr><td></td><td>Morteros VWR International LLC</td><td>89038-150</td><td>Se pueden sustituir con equivalentes de otros proveedores.</td></tr><tr><td>Guantes de nitrilo</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>19167032B</td><td>Se pueden sustituir por equivalentes de otros proveedores.</td></tr><tr><td>Toallas de papel</td><td>VWR International LLC BWK6212</td><td></td><td>pueden sustituirse por equivalentes de otros proveedores.</td></tr><tr><td>Película de sellado de placa PCR</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>NC9684493</td><td></td></tr><tr><td>tubos de tiras de PCR</td><td>USA Scientific</td><td>1402-2700</td><td></td></tr><tr><td>Mortles</td><td>VWR International LLC</td><td>89038-166</td><td>Puede sustituir por equivalentes de otros proveedores.</td></tr><tr><td>Espátulas de plástico</td><td>LevGo, Inc.</td><td>17211</td><td></td></tr><tr><td>Platinum Hot Start PCR Master Mix (2x)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>13000014</td><td></td></tr><tr><td>PNAs - cloroplasto y PNA mitocondrial</td><td>Bio</td><td>NA</td><td>Asegúrese de verificar la secuencia bioinformáticamente</td></tr><tr><td>Gafas de protección</td><td>Millipore Sigma</td><td>Z759015</td><td>Puede sustituir con equivalentes de otros proveedores.</td></tr><tr><td>Qubit 3.0 Fluorímetro</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Q33216</td><td></td></tr><tr><td>Qubit dsDNA HS kit de ensayo</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Q32854</td><td></td></tr><tr><td>Mazo de goma (opcional)</td><td>Ace Hardware</td><td>2258622</td><td>Puede sustituir con equivalente de otros proveedores.</td></tr><tr><td>Tijeras o tijeras</td><td>VWR International LLC</td><td>89259-936</td><td>Se pueden sustituir por equivalentes de otros proveedores.</td></tr><tr><td>Pala</td><td>Home Depot</td><td>2597400</td><td>Puede sustituir con equivalentes de otros proveedores.</td></tr><tr><td>Colector de núcleos de suelo (diámetro pequeño: < 1 pulgada)</td><td>Ben Meadows</td><td>221700</td><td>Puede sustituir con equivalente de otros proveedores.</td></tr><tr><td>Botellas rociadoras Santa</td><td>Cruz Biotechnology</td><td>sc-395278</td><td>Se pueden sustituir con equivalentes de otros proveedores.</td></tr><tr><td>Imprimaciones con código de barras desalinizadas estándar (10 y micro; M) (Tabla 1)</td><td>IDT</td><td>NA</td><td>4 nmole Oligo de ADN ultramero con desalinización estándar. El adaptador NGS y el cebador de secuenciación (Tabla 1) están diseñados para su uso con Illumina MiSeq utilizando la química v3.</td></tr><tr><td>Termociclador</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>E950040015</td><td>Puede sustituir por equivalentes de otros proveedores.</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>X100</td><td>Puede sustituir con equivalentes de otros proveedores.</td></tr><tr><td>Pesaje de barcos</td><td>Spectrum Chemicals</td><td>B6001W</td><td>Puede sustituir con equivalentes de otros proveedores.</td></tr></tbody></table>

explorar el microbioma de la raíz: extracción de datos de la comunidad bacteriana del suelo, rizosfera y raíz endosphere

Exploring the Root Microbiome: Extracting Bacterial Community Data from the Soil, Rhizosphere, and Root Endosphere

La interacción íntima entre la planta huésped y microorganismos asociados es crucial en la determinación de aptitud de la planta y puede fomentar mejor tolerancia a estreses abióticos y enfermedades. Como el microbioma de la planta puede ser muy compleja y de bajo costo, alto rendimiento métodos tales como secuenciación basada en productos del gene del rRNA 16S se prefieren a menudo para caracterizar su composición microbiana y diversidad. Sin embargo, la selección de la metodología adecuada al llevar a cabo tales experimentos es fundamental para reducir los sesgos que se pueden hacer análisis y comparaciones entre las muestras y estudios difíciles. Este protocolo describe en detalle una metodología estandarizada para la colección y extracción de ADN de muestras de suelo, rizósfera y raíz. Además, destacar una tubería bien establecida 16S rRNA amplicon secuencia que permite la exploración de la composición de comunidades bacterianas en las muestras y puede ser fácilmente adaptados para otros genes marcadores. Este gasoducto ha sido validado para una gran variedad de especies de plantas, incluyendo sorgo, maíz, trigo, fresa y agave y puede ayudar a superar problemas asociados con la contaminación de los organelos de la planta.

Realizar el protocolo recomendado debe resultar en un conjunto de datos de indexadas Lee extremo apareado que pueden ser emparejados a cada muestra y asignado a cualquier bacteriana unidades taxonómicas operativas (OTU) o variante de la secuencia exacta (ESV, también conocido como productos variante de la secuencia (ASV) y unidad taxonómica incompletos (sOTU)), dependiendo de posteriores análisis. Con el fin de obtener datos de la secuencia de alta calidad, se debe tener cuidado en cada p...

Aquí, describimos un protocolo para obtener datos de la secuencia del amplicón del suelo, rizosfera y raíz endosphere microbiomes. Esta información puede utilizarse para investigar la composición y diversidad de las comunidades microbianas asociadas de planta y es conveniente para el uso con una amplia gama de especies de plantas.

Explorar el microbioma de la raíz: extracción de datos de la comunidad bacteriana del suelo, rizosfera y raíz Endosphere

The intimate interaction between plant host and associated microorganisms is crucial in determining plant fitness, and can foster improved tolerance to ...

El objetivo general de este experimento es caracterizar tres compartimentos del microbioma de la raíz, el suelo, la rizosfera y la endosfera de la raíz, utilizando el perfil de la comunidad del gen de ARN ribosómico 16S. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en ecología microbiana, como los factores bióticos y abióticos que son los principales impulsores de la estructura del microbioma. La principal ventaja de esta técnica es que estandariza cada paso, desde la separación de la raíz y la rizosfera hasta la extracción del ADN y la preparación de una biblioteca de secuenciación.La demostración de este procedimiento estará a cargo de Tuesday Simmons, estudiante graduado en el Laboratorio Coleman-Derr. Para comenzar el protocolo, recoja muestras de suelo a granel con un colector de núcleos de suelo esterilizado con etanol para obtener un suelo que esté libre de raíces de plantas. Recoja un núcleo de aproximadamente 23 a 30 centímetros de la base de la planta.A continuación, transfiera el suelo a una bolsa de plástico, homogeneice el suelo agitando suavemente la bolsa, transfiera una alícuota de 600 miligramos de la muestra de suelo a un tubo de dos mililitros e inmediatamente coloque el tubo de dos mililitros en hielo seco hasta la extracción del ADN. Para recolectar la raíz y la rizosfera, use una pala esterilizada con etanol para desenterrar la planta, teniendo cuidado de obtener la mayor cantidad posible de la raíz. Sacuda suavemente el exceso de tierra de las raíces hasta que haya aproximadamente dos milímetros de tierra adherida a la superficie de la raíz.Para plantas grandes, use tijeras estériles para cortar una subsección representativa de raíces y coloque un mínimo de 500 miligramos de tejido radicular en un vial cónico de 50 mililitros. Agregue suficiente tampón de eliminación de epífitas para cubrir las raíces, luego coloque inmediatamente la muestra en hielo seco. Para separar la rizosfera de las raíces, descongele la muestra de raíz en hielo, luego sonique las muestras de raíz.Transfiera las raíces a un tubo limpio y refrigerado de 50 mililitros con pinzas estériles. No deseche el tubo original con tampón y tierra. Contiene la fracción de la rizosfera.A continuación, centrifuga el tubo que contiene el tampón y la rizosfera. Decantar el sobrenadante y colocar la fracción de la rizosfera en hielo seco. Para lavar las raíces, agregue aproximadamente 20 mililitros de cuatro grados centígrados de agua estéril a la fracción de la raíz.Lave la raíz agitándola vigorosamente durante 15 a 30 segundos, luego drene el agua. Use una espátula estéril para transferir rápidamente 250 miligramos de tierra y rizosfera a tubos de recolección separados provistos en un kit comercial de aislamiento de ADN para la extracción de suelo, luego proceda usando el protocolo del proveedor del kit. Después de la elución, almacene el ADN a menos 20 grados centígrados hasta que esté listo para proceder a la preparación de la biblioteca de amplicones, luego extraiga el ADN de las muestras de raíz.Enfríe un mortero esterilizado con nitrógeno líquido. Mida de 600 a 700 miligramos de tejido radicular y coloque el tejido en el mortero y agregue con cuidado suficiente nitrógeno líquido para cubrir las raíces. Muele las raíces en trozos pequeños.Continúe el proceso de agregar nitrógeno líquido y moler al menos dos veces, siendo consistente entre muestras, hasta que las raíces sean un polvo fino. Rápidamente, antes de que el polvo de raíz comience a descongelarse, use una espátula estéril para transferir el polvo de raíz a tubos de 1,5 mililitros previamente pesados en hielo. Registre el peso del tubo y el polvo.Use una espátula estéril para transferir rápidamente 150 miligramos de polvo de raíz al tubo de recolección provisto en el kit comercial de aislamiento de ADN diseñado para la extracción del suelo, luego proceda con el aislamiento de ADN utilizando el protocolo del proveedor del kit. Prepare suficiente mezcla maestra de PCR para amplificar cada muestra de ADN por triplicado. Vierta la mezcla maestra en un depósito de pipeta multicanal estéril de 25 mililitros y distribuya 66 microlitros de mezcla maestra en cada pocillo de una nueva placa de PCR de 96 pocillos.A continuación, agregue seis microlitros de cinco nanogramos por microlitro de ADN de la placa de ADN normalizada a la placa de mezcla maestra. A continuación, añada a la placa maestra 1,5 microlitros de cebador delantero de 10 micromolares, de modo que cada columna tenga un código de barras directo diferente, y 1,5 microlitros de cebador inverso de 10 micromolares, de modo que cada fila tenga un código de barras inverso diferente. Cubra la placa con una película y gire la placa brevemente a 3, 000 RCF.Utilice una pipeta multicanal para mezclar suavemente el contenido, luego divídalos en tres placas con 25 microlitros de mezcla de reacción y cubra las placas con una película de PCR. Amplifique el ADN en cada placa usando un termociclador. Después de la amplificación, agrupe las tres placas replicadas en una sola placa de 96 pocillos.Usando una hoja de cálculo de computadora, calcule el volumen de 100 nanogramos de cada muestra, así como el volumen promedio de todas las muestras. Para cada producto de PCR en blanco, agregue el volumen promedio calculado en un solo tubo de 1,5 mililitros. Para las muestras amplificadas con éxito, agrupe 100 nanogramos de cada muestra en el mismo tubo, luego mida la concentración del producto agrupado con un fluorómetro de sobremesa y eluya 600 nanogramos de ADN en agua de grado molecular hasta un volumen final de 100 microlitros en un tubo de 1,5 mililitros.Almacene el producto restante a menos 20 grados centígrados. Antes de purificar la alícuota de ADN de 600 nanogramos, prepare 600 microlitros de etanol fresco al 70%. Siga el proceso de purificación por PCR establecido utilizando perlas paramagnéticas.Agite el tubo de cuentas magnéticas para volver a suspender las cuentas que se depositan en la parte inferior. Agregue 1x volumen, 100 microlitros, de solución de perlas a la alícuota de 600 nanogramos de ADN. Mezcle bien la solución y las perlas pipeteando 10 veces.Después de mezclar bien, incube la mezcla durante cinco minutos a temperatura ambiente. Coloque el tubo en el soporte magnético durante dos minutos o hasta que la solución esté clara para separar las perlas de la solución. Mantenga el tubo en el soporte, aspire el sobrenadante transparente con cuidado sin tocar las perlas magnéticas y deséchelo.Deje el tubo en el soporte, agregue 300 microlitros de etanol al 70% al tubo e incube las perlas a temperatura ambiente durante 30 segundos. Aspire el etanol y deséchelo. Repita este proceso y elimine todo el etanol después del segundo lavado.Retire el tubo del soporte magnético y seque el contenido al aire durante cinco minutos. Agregue 30 microlitros de agua de grado molecular a las perlas secas y mezcle pipeteando 10 veces. Incubar a temperatura ambiente durante dos minutos.Regrese el tubo al soporte magnético durante un minuto para separar las perlas de la solución. Transfiera el eluido a un tubo nuevo. Mida la concentración final del ADN limpio y agrupado utilizando un fluorómetro de sobremesa.Diluir una alícuota a 10 nanomolares en un volumen final de 30 microlitros o a la concentración y el volumen preferidos por la instalación de secuenciación. Después de la etapa de amplificación, se realizó la secuenciación para determinar la composición de la comunidad bacteriana de cada muestra. Una alineación de la secuencia de PNA con cada cloroplasto y el gen de ARN ribosómico mitocondrial 16S para la planta huésped investigada no debería revelar ninguna discrepancia.Un solo desajuste con la secuencia de PNA de 13 pares de bases puede reducir drásticamente la efectividad, como en el caso de la secuencia de PNA de cloroplasto proporcionada y el gen de ARN ribosómico del cloroplasto 16S de Lactuca sativa o lechuga. Dado que se agrupó una cantidad igual de ADN amplificado por muestra, se obtuvo un número par de lecturas, que coinciden con los taxones bacterianos, por muestra después de la secuenciación, ordenadas en función de su índice de código de barras. Una vez dominada, esta técnica se puede realizar para ocho plantas en aproximadamente ocho horas.Al intentar este procedimiento, es importante ser coherente entre los experimentos. Los pequeños detalles, como los cambios en el método de extracción de ADN y la mezcla maestra de PCR, pueden introducir sesgos. Siguiendo este procedimiento, se pueden utilizar otros métodos, como la metatranscriptómica, para responder a preguntas adicionales, como qué microbios están activos y qué genes están expresando.No olvide que trabajar con nitrógeno líquido puede ser extremadamente peligroso y siempre se deben tomar precauciones como el uso de EPP adecuado al realizar este procedimiento.

exploring-root-microbiome-extracting-bacterial-community-data-from

Research

Investigación

JoVE Journal

Genetics

Genética

El objetivo del protocolo presentado aquí es estudiar la respuesta de transcriptómicos de endosphere aislado de Bacillus mycoides a exudados de raíces de papa. Este método facilita la identificación de genes bacterianos importantes implicados en interacciones planta-microorganismo y es en principio aplicable a las plantas, con ajustes menores y otros endófitos.

Interacción planta-microorganismo: Respuesta transcripcional de Bacillus Mycoides a exudados de raíces de papa

Excavación de raíces de las plantas del campo, así como procesamiento de muestras en endosphere, rizosfera y suelo se describen en detalle, incluyendo métodos de análisis de datos y extracción de ADN. Este documento está diseñado para permitir a otros laboratorios a utilizar estas técnicas para el estudio del suelo, endosphere y microbiomes de la rizosfera.

Aislamiento y análisis de comunidades microbianas en el suelo, rizosfera y raíces en los experimentos de pastos perennes

Visualización y medición del crecimiento de raíz en situ es extremadamente difícil. Se presenta un método rhizobox personalizable para seguir el desarrollo de la raíz y proliferación en el tiempo en respuesta al enriquecimiento de nutrientes. Este método se utiliza para analizar maíz diferencias genotípicas en la plasticidad de la raíz en respuesta a una fuente de nitrógeno orgánico.

Un protocolo de Rhizobox optimizada para visualizar el crecimiento de las raíces y la capacidad de respuesta a nutrientes localizadas

Aquí describimos un ensayo de crecimiento de plantas hidropónicas para cuantificar la presencia de especies y visualizar la distribución espacial de bacterias durante la colonización inicial de las raíces vegetales y después de su transferencia a diferentes ambientes de crecimiento.

Monitoreo de la Colonización Y Mantenimiento Bacterial en Arabidopsis thaliana Roots en un Sistema Hidropónico Flotante

Se aplicó el análisis de redes para evaluar la asociación de varias comunidades microbianas ecológicas, como el suelo, el agua y la rizosfera. Aquí se presenta un protocolo sobre cómo usar el algoritmo WGCNA para analizar diferentes redes de co-ocurrencia que pueden ocurrir en las comunidades microbianas debido a diferentes entornos ecológicos.

Divergencia de la microbiota radicular en diferentes hábitats basada en redes de correlación ponderadas

Los microcosmos de compost llevan la diversidad microbiana que se encuentra en la naturaleza al laboratorio para facilitar la investigación del microbioma en Caenorhabditis elegans. Aquí se proporcionan protocolos para establecer experimentos de microcosmos, y los experimentos demuestran la capacidad de modular la diversidad microbiana ambiental para explorar las relaciones entre la diversidad microbiana ambiental y la composición del microbioma intestinal del gusano.

Microcosmos de compost como entornos microbianamente diversos y naturales para la investigación del microbioma en Caenorhabditis elegans

Presentamos un protocolo para un sistema experimental semihidropónico basado en vidrio que apoya el crecimiento de una variedad de plantas filogenéticamente distintas con o sin microbios. El sistema es compatible con diferentes medios de cultivo y permite el muestreo no destructivo del exudado de la raíz para el análisis posterior.

Un sistema versátil de frascos de vidrio para el perfilado de exudado de raíces semihidropónico

Este protocolo presenta un flujo de trabajo fiable y eficiente desde la recogida de muestras hasta el análisis de datos para perfilar los microbiomas bacterianos endófitos y epífitos presentes en la corteza de Populus trichocarpa.

Un flujo de trabajo para la evaluación cuantitativa de los microbiomas bacterianos endófitos y epífitos de la corteza de Populus trichocarpa

Aquí se presenta un procedimiento rápido y estandarizado para establecer comunidades sinérgicas de biopelículas multiespecie de varios suelos de rizosfera. Se trata de un protocolo único diseñado para sondear y simular la compleja rizosfera de la microbiota del suelo.

Un enfoque para la construcción de comunidades de biopelículas multiespecies a partir del suelo de la rizosfera

Aquí, presentamos un protocolo para eliminar un gen de interés involucrado en la conjugación de plásmidos y posteriormente analizamos el impacto de su ausencia utilizando ensayos de apareamiento. La función del gen se explora más a fondo en una región específica de su secuencia mediante deleción o mutaciones puntuales.

Conjugación de apareamiento Los ensayos para el análisis específico de la secuencia de proteínas de transferencia que participan en la conjugación bacteriana

Aprende a caracterizar el microbioma de raíces en suelo, rizosfera y endosfera mediante perfilado del gen 16S rRNA. Este protocolo estandarizado facilita el análisis de comunidades microbianas asociadas a plantas.

Explorar el microbioma de la raíz: extracción de datos de la comunidad bacteriana del suelo, rizosfera y raíz Endosphere

Explorar más videos