Name: Medición de transporte de electrones membrana Trans-Plasma por C2C12 miotubos (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-05-04T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 27 s
Description: Aprende a medir el transporte de electrones transmembrana en tiempo real mediante ensayos espectrofotométricos utilizando miotubos C2C12. Este método permite estudiar los mecanismos de biología redox celular.

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Nos gustaría agradecer a Thomas Bell, Lyn Mattathil, Mark Mannino y Neej Patel por su soporte técnico. Este trabajo fue financiado por concesión de servicio de salud pública de Estados Unidos R15DK102122 del Instituto Nacional de Diabetes y digestivo y enfermedades del riñón (NIDDK) a Jonathan Fisher. El contenido del manuscrito es responsabilidad exclusiva de los autores y no representan necesariamente la opinión oficial de la NIDDK o los institutos nacionales de salud.

Nota: Vea la figura 1 para una descripción esquemática de los pasos claves.
1. ensayo de reducción de WST-1
<ol><li>Crecer y diferenciar las células adherentes C2C12 utilizando estándar de la célula cultura procedimientos7 en una placa de 96 pozos utilizando filas A-f.<ol>
<li>Utilizar un medio de diferenciación que consta de medio modificado Eagle de Dulbecco (DMEM) suplementado con 2% de suero de caballo, 100 U/mL de penicilina y estreptomicina de 0,1 mg/mL. Incube las células a 37 ° C con 5% CO2.</li>
		<li>Al medirse la implicación de ascorbato en tPMET, suplemento de medios de diferenciación con el ácido ascórbico de 100 μm. Permitir que las células al incubar en medio de la diferenciación para ~ 24-48 h.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Preparar soluciones WST-1 y PMS.<ol>
<li>Para hacer un stock de 10 mM de WST-1, disolver 0,033 g de WST-1 (peso fórmula (PF): 651.34 g/mol) en 5 mL de fosfato tampón salino (PBS). Almacenar a 4 ° C.</li>
		<li>Para hacer un stock de 5 mM del PMS, disolver 0,0023 g de PMS (FW: 306.34 g/mol) en 1,5 mL de desionizada H2O (diH2O). Almacenar a-20 ° C y proteger de la luz.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Añadir 0,0108 g de glucosa, para una concentración final de 5 mM a 11,4 mL de PBS o HEPES tamponada con solución salina (HBS; sal de sodio HEPES 20 mM, 140 mM NaCl, KCl, 2, 5 mM de MgSO4, de 5 mM 1 mM CaCl2). Añadir 480 μl de 10 mM WST-1 para una concentración final de 400 μm y 48 μl de 5 mM PMS para una concentración final de 20 μm.</li>
	<li>Al medirse la implicación de ascorbato en tPMET, divida la solución en dos alícuotas de 6 mL. A una alícuota, añadir 6 μl de diH2O y a la otra alícuota agregar 6 μl de 2 kU/mL AO para una concentración final de 2 U/mL.</li>
	<li>Al medirse la implicación de superóxido en tPMET, divida la solución en dos alícuotas de 6 mL. A una alícuota, agregar 55 μl de 0,1 M KPO4 tampón y a la otra alícuota agregar 55 μl de 6.5 kU/mL de sodio a una concentración final de 60 U/mL.</li>
	<li>Lavar las células con PBS. Aspire el medio y agregar 150 μL PBS. Luego aspirar el PBS. Nota: El ensayo se realiza con las células plateadas, adjuntadas. Así, hay no hay centrifugación o el uso de la tripsina en el proceso de lavado.</li>
	<li>Añada 100 μl de solución de WST-1 (-) SOD o (-) AO a las columnas 1-6 y agregar 100 μl de solución de WST-1 (+) de sodio o (+) AO para columnas 7-12 en la placa de 96 pocillos. Utilizar filas G y H como controles de fondo (es decir, para monitorear el cambio en la absorbancia del reactivo solamente en pozos sin células).</li>
	<li>Los valores de absorbancia con el espectrofotómetro cada 10 min durante 1 h a 438 nm.</li>
	<li>Después de la lectura, los medios de comunicación de aspirar y lavar cada pozo con 150 μL de PBS. Luego aspirar el PBS.</li>
	<li>Calcular el cambio en la absorbancia de cada pocillo restando la absorbancia inicial para un pozo de la absorbencia en cualquier momento para bien. Corregir este cambio para el cambio en la absorbencia (si cualquier) observado en los pozos de fondo (es decir, pozos con solución de ensayo pero sin células).</li>
	<li>Para el análisis, normalizar los datos de absorbancia para el control de medición de 60 minutos o lavar los pocillos con PBS o HBS y luego realizar un análisis de proteína bicinchoninic ácido (BCA).</li>
	<li>Añadir albúmina de suero bovino (BSA) estándar de 2 mg/mL (rango de 0.5-2 μL para la curva estándar, dependiendo del grado de confluencia de las células) en los pocillos vacíos (filas G y H), luego añadir el reactivo BCA en todos los pocillos.</li>
	<li>Cuantificar los datos mediante nmol de WST-1 reducción por μg de proteína. Utilizar 37 mM-1 cm-1 22 como el coeficiente de extinción para WST-1 reducida en 438 nm.</li>
</ol>2. ensayo de reducción de DPIP
<ol><li>Crecer y diferenciar células adherentes C2C12 con el mismo procedimiento que el paso 1.1.</li>
	<li>Preparar solución DPIP stock 10 mM como sigue. Disolver 0,029 g de DPIP (FW: 290.08 g/mol) en 10 mL de diH2O. confirmar la concentración de DPIP midiendo absorbancia a 600 nm con un espectrofotómetro. Utilizar 1 mM-1 cm-1 23 como el coeficiente de extinción para la DPIP reducida a 600 nm. Almacenar a 4 ° C.</li>
	<li>Añadir a 11,880 mL de PBS para una concentración final de 5 mM 0,0108 g de glucosa. Añadir 120 μl de 10 mM DPIP para una concentración final de 100 μm.</li>
	<li>Al medirse la implicación de ascorbato en tPMET, divida la solución en dos alícuotas de 6 mL. A una alícuota, añadir 6 μl de diH2O y a la otra alícuota agregar 6 μl de 2 kU/mL AO para una concentración final de 2 U/mL.</li>
	<li>Al medirse la implicación de superóxido en tPMET, divida la solución en dos alícuotas de 6 mL. A una alícuota, agregar 55 μl de 0,1 M KPO4 tampón y a la otra alícuota agregar 55 μl de 6.5 kU/mL de sodio a una concentración final de 60 U/mL.</li>
	<li>Los medios de comunicación de aspirar y lavar las células en 150 μL de PBS. Aspire el PBS y añadir 100 μl de solución de DPIP (-) SOD o (-) AO a las columnas 1-6 y agregar 100 μl de solución de DPIP (+) de sodio o (+) AO para columnas 7-12 en la placa de 96 pocillos. Utilizar filas G y H será como controles de fondo (es decir, para monitorear el cambio en la absorbancia del reactivo solamente en pozos sin células).</li>
	<li>Medir la absorbancia a 600 nm utilizando espectrofotómetro cada 10 minutos para 1 h. cuantificar el cambio en absorbancia con respecto al control en el minuto 60 similar a pasos 1.9-1.13.</li>
</ol>3. determinación de si los aceptadores del electrón reducida son sustratos para AO o TEPES
<ol><li>Añadir a 5,436 mL de PBS o HBS, 240 μl de 10 mM WST-1 para una concentración final de 400 μm y 24 μl de 5 mM PMS para una concentración final de 20 μm.<ol>
<li>De DPIP, añadir 60 μL de 10 mM DPIP, para una concentración final de 100 μm, a 5,940 mL de PBS o HBS.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Añada 100 μl de solución para cada bien en una placa de 96 pocillos de fondo plano en la ausencia de células y medir la absorbancia en un espectrofotómetro a 438 nm, para WST-1 y 600 nm, de DPIP.</li>
	<li>Añadir 1 μl de ascorbato 10 mM a la mitad de los pozos a una concentración final de 100 μM. Monitorear la absorbancia hasta que se estabilice.</li>
	<li>Estabilización, añadir 1 μl de 200 U/mL AO para una concentración final de 2 U/mL en cada pocillo o añadir 1 μl de césped de 6 kU/mL para una concentración final de 60 U/mL a cada uno bien y monitorear la absorbancia de 1 h.</li>
</ol>

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<li>Maghzal, G. J., Krause, K. H., Stocker, R., Jaquet, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+reactive+oxygen+species+derived+from+the+family+of+NOX+NADPH+oxidases%5BTitle%5D)+AND+%22Free+Radic+Biol+Med%22%5BJournal%5D)">Detection of reactive oxygen species derived from the family of NOX NADPH oxidases.</a> Free Radic Biol Med. 53 (10), 1903-1918 (2012).</li>
</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

Hemos presentado dos métodos para utilizar aceptadores del electrón extracelular, WST-1 y DPIP, en ensayos espectrofotométricos para controlar tPMET en miotubos C2C12. Con el crecimiento de líneas celulares en los procedimientos de cultivo estándar y un lector espectrofotómetro de placas, es posible monitorizar tPMET con estos aceptadores del electrón en un análisis simple de la microplaca. WST-1 reducción es reproducible de pozo a pozo dentro de un ensayo, pero existe variabilidad día a día. El día a día coeficiente de ...

La capacidad de las membranas de plasma purificadas para reducir aceptadores del electrón ha llevado a la vista que la membrana plasmática tiene una capacidad inherente de redox de1. Visto previamente en hongos, plantas y animales, tPMET es un proceso común a múltiples organismos2,3,4,5. En concreto, este proceso ha sido demostrado en Saccharomyces cerevisiae, zanahoria células, eritrocitos, linfocitos, osteosarcoma, melanoma, macrófagos, músculo esquelético y neutrófilos2,3, 4 , 5 , 6 , 7. en un proceso que transporta electrones a través de la membrana de plasma para reducir oxidantes extracelulares, tPMET participa en muchas funciones celulares incluyendo: célula crecimiento5,8, de la viabilidad de la célula9, hierro metabolismo10,11,12,13y la protección de especies de oxígeno reactivo12,14,15de señalización de la célula. Debido a la implicación de tPMET en muchas funciones celulares, un desequilibrio de tPMET ha presumido para contribuir al desarrollo de algunas condiciones de salud graves, incluyendo cáncer16,17de las enfermedades cardiovasculares, metabólicos y síndrome18.
Hay varias formas para controlar a la transferencia de electrones a través de la membrana del plasma, pero es la técnica más ampliamente utilizada evaluar la reducción de los aceptores de electrones extracelular a través de análisis colorimétricos. Aceptadores del electrón extracelular comúnmente utilizados son las sales de tetrazolio, DPIP, FeCN y ferricytochrome c19,20. La sal de tetrazolio más comúnmente utilizado es una segunda generación sal conocida como WST-119. Este compuesto es más fácil de utilizar en el análisis colorimétricos en comparación a las sales de tetrazolio de primera generación debido a dos grupos sulfonato, que aumentan su solubilidad de agua21. WST-1, junto con el intermedio electrón aceptador 1-metoxi-phenazine methosulfate (mPMS), se reduce en eventos de transferencia de electrones solo dos. Esta reducción cambia la forma oxidada de color débil de WST-1 a un precipitado más intenso, amarillo20,22. WST-1 tiene un coeficiente de extinción molar alta de 37 x 103 M-1cm-1, conduce a un análisis alta sensibilidad21,22. DPIP también es utilizado como un aceptor de electrones extracelular para controlar tPMET. Se ha demostrado que puede reducirse extracellularly DPIP por tPMET sin la ayuda de aceptadores de electrones intermedios23,24. Debido a la ausencia de aceptadores del electrón intermedio, DPIP puede directamente electrones Pick-up de la membrana del plasma, a diferencia de WST-124. Similar a la DPIP, FeCN ha visto reducirse extracelularmente a ferrocianuro, tPMET sin la ayuda de aceptadores de electrones intermedios19,24. A diferencia de WST-1 y DPIP, FeCN tiene un coeficiente de extinción molar baja conduce a un menor análisis sensibilidad9. Otro aceptor de electrones extracelular utilizados para monitorear tPMET es ferricytochrome c. Similar a WST-1, ferricytochrome c reducción aumenta con el uso del aceptador del electrón intermedio, mPMS22. A diferencia de WST-1 sin embargo, el método c ferricytochrome es menos sensible debido a una alta formación y un coeficiente de extinción molar baja22.
Aquí presentamos un método para el análisis en tiempo real de tPMET a través de análisis espectrofotométricos. El método utilizado los aceptadores del electrón extracelular WST-1 y DPIP, pues ambos tienen un coeficiente de extinción molar alta mientras que siendo menos costosa en comparación con los otros comúnmente utilizados aceptadores del electrón extracelular como c ferricytochrome. Utilizamos phenazine methosulfate (PMS) en lugar de multiprocesamiento tienen una composición química similar y PMS es mucho menos costoso. mPMS es fotoquímicamente estable que es una característica importante de un kit comercial que necesita una larga vida útil. Sin embargo, hacemos PMS fresca para cada ensayo, por lo que la estabilidad no debe ser un problema. También presentamos un método para evaluar posibles interacciones enzimáticas (ver figura 1) entre el aceptador del electrón extracelulares y enzimas que pueden ser utilizadas para caracterizar el proceso de tPMET. En concreto, las enzimas AO y el césped puede ser utilizado determinan la parte de tPMET es debido al transporte de ascorbato o liberación de superóxido extracelular, dos métodos comunes para los electrones que se transportará a través de la membrana plasmática.

<table><tbody><tr><td>Mioblastos C2C12 Colección de</td><td>Cultivos Tipo Americano&nbsp;</td><td>CRL-1772</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco's modificado de águila de glucosa media - baja</td><td>Sigma</td><td>D6046</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Plex complejo de suero animal</td><td>Gemini Bio-Products&nbsp;</td><td>100-602</td><td></td></tr><tr><td>penicilina-estreptomicina</td><td>Sigma</td><td>516106</td><td></td></tr><tr><td>suero de caballo</td><td>Gibco Technologies</td><td>16050-130</td><td></td></tr><tr><td>Solución salina tamponada con fosfato de Dulbecco</td><td>Sigma</td><td>D8537</td><td></td></tr><tr><td>tripsina-EDTA</td><td>Sigma</td><td>T4049</td><td></td></tr><tr><td>placas de cultivo de 15 cm</td><td>TPP</td><td>93150</td><td></td></tr><tr><td>placas de cultivo de 96 pocillos</td><td>TPP</td><td>92096</td><td></td></tr><tr><td>2-(4-yodofenil)-3-(4-nitrofenil)-5-(2,4-disulfofenil)-2H-tetrazolio Sal sódica (WST-1)</td><td>Accela ChemBio&nbsp; Inc</td><td>SY016315</td><td></td></tr><tr><td>metosulfato de fenazina&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>P9625</td><td></td></tr><tr><td>Ácido L-ascórbico</td><td>Sigma</td><td>A5960</td><td></td></tr><tr><td>ascorbato oxidasa&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>A0157</td><td></td></tr><tr><td>superóxido dismutasa&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>S5395</td><td></td></tr><tr><td>2,6-dicloroinndofenol sal sódica&nbsp;</td><td>ICN Biomedicals</td><td>215011825</td><td></td></tr><tr><td>D-(+)-glucosa</td><td>Sigma</td><td>G7528</td><td></td></tr><tr><td>HEPES sal sódica</td><td>Sigma</td><td>H3784</td><td></td></tr><tr><td>cloruro sódico</td><td>Sigma</td><td>S7653</td><td></td></tr><tr><td>cloruro potásico</td><td>Fisher Scientific&nbsp;</td><td>BP366</td><td></td></tr><tr><td>sulfato de magnesio heptahidratado</td><td>Sigma</td><td>M5921</td><td></td></tr><tr><td>cloruro de calcio dihidratado</td><td>Sigma</td><td>C7902</td><td></td></tr><tr><td>fosfato de potasio</td><td>Fisher Scientific&nbsp;</td><td>BP363</td><td></td></tr><tr><td>Pierce BCA Protein Assay Kit</td><td>Thermo Scientific</td><td>23225</td><td></td></tr><tr><td>Powerwave X-I espectrofotómetro Biotek</td><td>Insturments</td><td>descontinuado&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Espectrofotómetro Spectronic Genesys 5 Thermo</td><td>Scientific 336001</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PureGrade Microplaca de 96 pocillos, F-bottom, transparente, sin tratar, no estéril</td><td>MidSci</td><td>781602 cloruro</td><td></td></tr><tr><td>de hierro (II) tetrahidratado</td><td>Sigma</td><td>220299</td><td></td></tr><tr><td>sulfato de hierro (II) heptahidrato</td><td>Sigma</td><td>215422</td><td></td></tr><tr><td>hipoxantina</td><td>Sigma</td><td>H9636</td><td></td></tr><tr><td>xantina oxidasa Sigma</td><td></td><td>X4500</td><td></td></tr><tr><td>Excel</td><td>Microsoft</td><td></td><td></td></tr><tr><td>R Studio</td><td>Rstudio</td><td></td><td>https://www.rstudio.com/products/rstudio/</td></tr> <tr><td>KC4</td><td>Biotek Instrumentos</td><td>descontinuados&nbsp;</td><td></td></tr></tbody></table>

medición de transporte de electrones membrana trans-plasma por c2c12 miotubos

Measuring Trans-Plasma Membrane Electron Transport by C2C12 Myotubes

Transporte de electrones de la membrana trans-plasma (tPMET) desempeña un papel en la protección de las células del estrés reductor intracelular, así como protección contra el daño por oxidantes extracelulares. Este proceso de transporte de electrones de reductores intracelulares a extracelulares oxidantes no está bien definida. Aquí presentamos ensayos espectrofotométricos por C2C12 miotubos para monitorear tPMET utilizando los aceptadores del electrón extracelular: 1 sal de tetrazolio soluble en agua (WST-1) y 2, 6-dichlorophenolindophenol (DPIP o DCIP). A través de la reducción de estos aceptadores del electrón, que son capaces de controlar este proceso en un análisis en tiempo real. Con la adición de enzimas como la ascorbato oxidasa (AO) y superóxido dismutasa (SOD) para el análisis, podemos determinar que la porción de tPMET es debido a la producción de exportación o superóxido ascorbato, respectivamente. Mientras WST-1 fue demostrada para producir resultados estables con bajo fondo, DPIP pudo ser nuevamente oxidado después de la adición de la AO y césped, que se demostró con análisis espectrofotométrico. Este método demuestra un análisis espectrofotométrico en tiempo real, multi-bien, rápido con ventajas sobre otros métodos utilizados para controlar tPMET como ferricianuro (FeCN) y reducción c ferricytochrome.

Las estadísticas se realizaron con ANOVA con medidas repetidas utilizando el software estadístico de RStudio25. Tamaños de muestra se indican en las leyendas de la figura.
Para controlar tPMET, miotubos C2C12 se utilizaron junto con aceptadores del electrón extracelular, WST-1 y DPIP. AO se utilizó para determinar que porción del WST-1 y reducción de DPIP fue debido a la emanación de ascorbato y césped se...

El objetivo de este protocolo es espectrofotometría monitor plasma trans membrana transporte de electrones utilizando aceptadores del electrón extracelular y analizar las interacciones enzimáticas que pueden ocurrir con estos aceptadores del electrón extracelular.

Medición de transporte de electrones membrana Trans-Plasma por C2C12 miotubos

Trans-plasma membrane electron transport (tPMET) plays a role in protection of cells from intracellular reductive stress as well as protection from damage ...

El objetivo general de este procedimiento es monitorear el proceso de transporte de electrones de la membrana transplasmática en tiempo real a través de ensayos espectrofotométricos. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la biología radox sobre el mecanismo de transporte de electrones de la membrana transplasmática y cómo se mantiene el entorno redox de una célula. La principal ventaja de esta técnica es que el ensayo es un ensayo espectrofotométrico rápido, multipocillo y en tiempo real.Para comenzar, coloque las células de adherencia C2C-12 a dos veces 10 a la cuarta celda por centímetro cuadrado en las filas A a F de una placa de 96 pocillos, luego cubra las células con medios de crecimiento. Incubar las células en una incubadora a 37 grados centígrados con un 5% de dióxido de carbono. Después de 24 horas en cultivo, aspire el medio de crecimiento, lave con 150 microlitros de PBS, reemplácelo con medio de diferenciación e incube las células durante 24 a 48 horas adicionales.A continuación, prepare un stock de soluciones WST-1 y PMS. Prepare una solución madre de 10 milimolares de WST-1 disolviendo 033 gramos de WST-1 en cinco mililitros de PBS. Luego, vórtice la solución.A continuación, prepare la solución madre de PMS disolviendo 0023 gramos de PMS en 1,5 mililitros de agua ionizada. Vortex, la solución. Para preparar la solución de trabajo, agregue glucosa al PBS para hacer 11,4 mililitros de una solución de glucosa de cinco milimolares.A esta solución, agregue 480 microlitros de la solución madre WST-1 para una concentración final de 400 micromolares WST-1 y 48 microlitros de la solución madre PMS para una concentración final de 20 micromolares PMS. Vórtice las soluciones para mezclar. Luego divida la solución en dos alícuotas de seis mililitros.Dependiendo del ensayo, agregue los componentes relevantes que se describen aquí. Con las soluciones ya preparadas, aspire los medios de diferenciación de las células y lávelas una vez con 150 microlitros de PBS. Retire el PBS y agregue 100 microlitros de la alícuota uno en las columnas del uno al seis.Y agregue 100 microlitros de la alícuota dos a las columnas siete a 12 de la placa de 96 pocillos. Coloque la placa de 96 pocillos en un lector de placas y mida los valores de absorbancia cada 10 minutos durante una hora a 438 nanómetros. Después de la lectura final, aspire los medios y lave cada pocillo con 150 microlitros de PBS.A continuación, aspire el PBS. Para el análisis, calcule el cambio en la absorbancia de cada pozo restando la absorbancia inicial para el pozo de la absorbancia en cualquier punto de tiempo posterior para ese mismo pozo. Corrija este cambio en función del cambio en la absorbancia que se observa en los pozos de fondo.Una vez corregidos los antecedentes, normalice los datos de absorbancia a las mediciones de control de 60 minutos. Alternativamente, normalice por el contenido de proteína en cada pocillo utilizando un ensayo estándar de proteína BCA. Finalmente, cuantificar los datos para obtener la cantidad de reducción de WST-1 por microgramos de proteína.Para comenzar el ensayo de reducción de DPIP, cultive y diferencie las células de adherencia C2C-12, como se muestra para el ensayo de reducción WST-1. A continuación, prepare una solución madre que contenga 10 milimolares de DPIP disolviendo 029 gramos de DPIP en 10 mililitros de agua ionizada. A continuación, vórtice la solución.Confirme la concentración midiendo la absorbancia de la solución a 600 nanómetros con un espectrofotómetro. Para hacer la solución de trabajo, agregue 120 microlitros de la solución madre de DPIP de 10 milimolares a 11,88 mililitros de una solución de cinco milimolares de glucosa y PBS para una concentración de trabajo final de DPIP de 100 micromolares. Luego, vórtice la solución.Luego divida la solución en dos alícuotas de seis mililitros. Dependiendo del ensayo, agregue los componentes relevantes que se describen aquí. Con las soluciones ya preparadas, aspire los medios de diferenciación de las células y lávelas una vez con 150 microlitros de PBS.Retire el PBS y agregue 100 microlitros de la alícuota uno en las columnas uno a seis, y 100 microlitros de la alícuota dos a las columnas siete a 12 de la placa de 96 pocillos. Coloque la placa de 96 pocillos en un lector de placas y mida los valores de absorbancia cada 10 minutos durante una hora a 600 nanómetros y analice los valores resultantes como se describe en el análisis del ensayo de reducción WST-1. Para empezar, prepare dos soluciones.Primero, prepare seis mililitros de 400 micromolares WST-1 y 20 micromolares PMS en PBS. A continuación, prepare seis mililitros de una solución de 100 micromolares de DPIP y PBS. Prepare la primera placa de 96 pocillos agregando 100 microlitros de una solución WST-1 / PMS a las filas A a D en una placa de fondo plano en ausencia de celdas, y mida la absorbancia en un espectrofotómetro a 438 nanómetros.A continuación, prepare una segunda placa de 96 pocillos añadiendo 100 microlitros de la solución DPIP a las filas A a D en una placa de fondo plano en ausencia de células, y mida la absorbancia en el espectrofotómetro a 600 nanómetros. A continuación, agregue un microlitro de ascorbato de 10 milimolares a la mitad de los pocillos para obtener una concentración final de 100 micromolares. Controle la absorbancia en la placa hasta que se estabilice.Después de esto, repita con DPIP. Tras la estabilización, determine si los aceptores de electrones producidos son sustratos. En el caso de la ascorbato oxidasa, el superóxido dismuta, añadiendo ascorbato oxidasa o superóxido dismutador a cada pocillo y controlando el cambio de absorbancia durante una hora.Para monitorear el transporte de electrones de la membrana transplasmática, se utilizó ascorbato oxidasa para bloquear los efectos de la reducción mediada por ascorbato y superóxido dismutasa para bloquear la reducción mediada por superóxido para determinar qué parte de la reducción de WST-1 se debía a cada componente. Con la adición de ascorbato oxidasa, la reducción de WST-1 se suprimió en aproximadamente un 30%, lo que indica que alrededor del 30% del transporte de electrones de la membrana transplasmática se debió a la exportación de ascorbato. Con la adición de superóxido dismutasa, la reducción de WST-1 se suprimió en aproximadamente un 70%, lo que indica que alrededor del 70% del transporte de electrones de la membrana transplasmática se debió a la liberación de superóxido extracelular.Para determinar si el DPIP reducido es un sustrato para la ascorbato oxidasa o la superóxido dismutasa, los niveles de DPIP se redujeron con ácido ascórbico. Después de 20 minutos, se añadió ascorbato oxidasa y se controló la absorbancia. La recuperación muestra que el DPIP reducido es un sustrato para la ascorbato oxidasa.Cuando se añadió la superóxido dismutasa, el DPIP también se reoxidó, aunque a un ritmo más lento; por lo tanto, el DPIP reducido es un sustrato para estas enzimas y no un aceptor de electrones extracelular apropiado para ser utilizado con estas enzimas. Una vez dominada, esta técnica se puede completar en dos horas si se realiza correctamente. Al intentar este procedimiento, es importante recordar que todos los reactivos deben estar frescos todos los días.Después de su desarrollo, esta técnica allanó el camino para que los investigadores en el campo de la biología redox exploraran el transporte de electrones de la membrana transplasmática en una variedad de tipos de células. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo medir el transporte de electrones de la membrana transplasmática utilizando aceptores de electrones extracelulares, así como cómo determinar si el aceptor de electrones podría ser un sustrato para las enzimas utilizadas en el ensayo.

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Investigación

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Biochemistry

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