Name: Proyección de imagen 3D Time-lapse de la fagocitosis por macrófagos de ratón (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-10-19T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 24 s
Description: Aprende a visualizar la fagocitosis en macrófagos peritoneales de ratón mediante microscopía confocal de disco giratorio. Esta técnica permite el análisis en tiempo real de la captura y ingestión de partículas.

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Este trabajo fue apoyado por las becas HA 3271/4-1 y HA 3271/4-2 del DFG (Deutsche Forschungsgemeinschaft) y la concesión FF-2016-05 de EXC 1003 (racimo de la excelencia 1003), las células en movimiento (CiM), DFG.

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Los autores no tienen nada que revelar.

La gran mayoría de los ensayos de fagocitosis, especialmente punto final y ensayos de alto rendimiento, no proporcionan la visualización de cómo las partículas son realmente capturadas, envuelto e ingeridas. Estudios pioneros por Munthe-Kaas et al. 10 y Kaplan2 en la década de 1970 sugirieron que sorprendentemente diferentes reorganizaciones citoesqueléticas estuvieron implicados en la fagocitosis de IgG opsonizadora versus opsonizadora complemento de partículas (células de sangre rojas de ovejas). Aquí describimos ensayos de fagocitosis usando microscopia confocal de disco giratorio que permiten proyección de imagen de alta resolución, en tiempo real de eventos simples fagocíticas. Fagocito de nuestro modelo es el los macrófagos peritoneales residentes de ratón, que puede ser aislada con mínimo manejo y utilizamos eritrocitos humanos recién aislados como partículas. Sin embargo, los ensayos de fagocitosis podrían aplicarse a otros fagocitos como los macrófagos derivados de médula ósea de ratón o neutrófilos, macrófagos derivados de monocitos humanos y líneas de celulares de macrófagos de ratón, neutrófilos de sangre periférica. En el caso de los fagocitos humanos o ratón neutrófilos, alternativa etiquetado fluorescente anticuerpos se necesitarían como fluorescencia etiquetada anti-CD14 (monocitos/macrófagos humanos) los anticuerpos16 o anticuerpos (Ly - 6 G) anti-Gr-1 (ratón neutrófilos).
Unopsonized glóbulos rojos humanos, como los glóbulos rojos de oveja utilizada tradicionalmente, son inertes en el sentido de que estas células son no (o, al menos, muy rara vez) ingeridas por los macrófagos peritoneales de ratón. De este modo, en contraste con perlas de poliestireno, actividad de bajo fondo. Glóbulos rojos humanos puede ser convenientemente opsonizadora con inmunoglobulinas de ratón IgG o IgM anticuerpos monoclonales contra CD235a (glycophorin A), un marcador específico de humanos eritrocitos (glóbulos rojos) y de precursores eritroides17, 18. en ensayos paralelos, fluorescencia etiquetada anti-IgG o IgM secundarios anticuerpos de ratón pueden ser aplicados para confirmar la opsonización. Las clases de anticuerpos IgG e IgM son hemaglutininas, sustancias (anticuerpos) que producen glóbulos rojos se aglutinan. Para evitar la aglutinación, intermitentemente mezclar la suspensión de células durante el período de incubación de 8 minutos con el anticuerpo anti-CD235a, y luego agregar la suspensión mezclada directamente a una que contiene macrófagos canal diapositiva (revestimiento de fibronectina) sin un paso de lavado . Pasos de lavado implican sedimentación de los eritrocitos por centrifugación, que promueve fuertemente la aglutinación. Antes opsonizante glóbulos rojos humanos, etiquetamos la membrana con una sonda fluorescente lipofílica de naranja y rojo. Este sondeo es brillantemente fluorescente en el inicio de grabaciones time-lapse, pero la señal poco a poco se desvanece, probablemente en gran parte debido al fotoblanqueo19. Además, los macrófagos y el revestimiento de fibronectina de la diapositiva será débil/rojo naranja fluorescente durante grabaciones. Este problema es probablemente debido al lavado de glóbulos rojos humanos después de etiquetar. En lugar de utilizar un marcador fluorescente lipofílico de la membrana de plasma, glóbulos rojos humanos podría ser etiquetados con un derivado de rodamina pH-sensible utilizando su amina reactiva succinimidyl ester15,20. Esto tiene la ventaja de permitir la visualización de la maduración del fagosoma ya que aumenta la intensidad de la fluorescencia con la disminución de pH15,20, pero este enfoque tiene la desventaja que actualmente se encuentran preparaciones reactivo éster caro e inestable después de la reconstitución en medio acuoso.
IgG-opsonizadora glóbulos rojos humanos son ingeridos a través de FcγRs, que se puede confirmar utilizando los macrófagos peritoneales aisladas de NOTAM21 o Fcer1g- / - ratones (Fcer1g knockout). Los macrófagos NOTAM opsonizadora IgG eritrocitos humanos se unen, pero carecen de ITAM (immunoreceptor motivo de activación basados en tirosina) - mediada de señalización necesaria para inducir la fagocitosis, mientras que los macrófagos de nocaut Fcer1g no expresan superficial FcγRs. IgG - u opsonizadora IgM humanas glóbulos rojos pueden ser además opsonizadora con C3b (que es hendida a iC3b) por incubar las células con el suero recién aislado de un ratón nulo complemento C5 (tipo suero provoca hemólisis). Las opsoninas IgG e IgM activan la cascada del complemento clásico, que conduce a la formación de poros (complejos de ataque de membrana) y lisis celular. En ratones que carecen de complemento C5, la cascada del complemento procede a complementar el escote de C3 y C5 convertasa carece de sustrato necesario para catalizar la vía terminal. Desarrollamos análisis simple para medir la cinética de la cascada del complemento. En Resumen, glóbulos rojos humanos puede co marcadas con un rojo fluorescente, marcador de membrana plasmática y el fluoróforo verde fluorescente, citosólico. Sobre la formación de lo complejos de ataque a membrana, formada por componentes del complemento C5-C9, el fluoróforo citosólico es rápidamente (en segundos) perdido desde el citosol. Visualización de la función end-effector (citólisis) de la cascada del complemento indica que el tiempo de incubación de 4 minutos es suficiente para opsonización C3b/iC3b de glóbulos rojos humanos. En ensayos paralelos, C3b/iC3b capa de glóbulos rojos humanos puede ser fácilmente había evaluada después de aplicar una mezcla de anti-ratón C3b y etiquetada fluorescente anticuerpos secundarios. En este caso, se requiere un paso de lavado para eliminar los anticuerpos no Unidos fluorescentes. Aunque la etapa de lavado consiste en sedimentaion de células por centrifugación, que promueve la aglutinación, opsonización exitosa puede evaluarse fácilmente mediante microscopía confocal. Fagocitosis mediada por receptor de complemento puede ser reflejada por cualquier aplicación IgG- / células de sangre roja humana opsonizadora iC3b NOTAM o Fcer1g- / - macrófagos o introduciendo IgM- / sangre roja humana opsonizadora iC3b células de macrófagos de tipo salvaje. Opsonizadora IgM de las células de sangre no son reconocidas por el FcγRs que contiene el ITAM (FcγRIII, FcγRI y FcγRIV) necesarias para la fagocitosis de partículas opsonizadora IgG22.
Para imagen fagocíticas eventos, la membrana plasmática de los macrófagos pueden ser etiquetadas con el anticuerpo conjugado de anti-F4/80 fluoróforo fluorescente verde, que también sirve como un marcador específico de los macrófagos de ratón. Glóbulos rojos humanos pueden procesar rojo fluorescente por la incubación con un marcador rojo naranja fluorescente membrana del plasma, como se señaló anteriormente. Este marcador de membrana plasmática lipofílico evita posibles efectos de confusión de etiquetas basados en anticuerpos. Rojo fluorescentes glóbulos rojos humanos, con o sin opsonización, se puede pipetearse directamente en el canal 100 μl de una diapositiva de canal y 3D Time-lapse reflejada por una 60 X 1.49 aceite de inmersión (o similar) objetivo realizado usando el 488 nm y 561 nm láser líneas , respectivamente, de un microscopio confocal (o similar) de disco de spinning. Es tentador para optimizar el sistema de proyección de imagen de alta resolución, pero la adquisición de pilas de Z repetidas sobre 16 minutos o así que puede causar fototoxicidad y photobleaching considerable. Optamos por utilizar 2 x 2 binning para promover buenos cocientes signal-to-noise y permite reducciones en la intensidad de excitación o tiempos de exposición, pero a expensas de la resolución óptica. Además, para reducir la fototoxicidad, agregamos un tesoro de especies reactivas de oxígeno al medio. En futuros estudios, los análisis podrían modificarse para la fagocitosis de células de sangre rojas humanas apoptotic de la imagen. Aplicación de un ionóforo Ca2 + , como A23187, puede utilizarse para inducir la fosfatidilserina externalización23, un "eat me" señal y sello de la temprana apoptosis24,25.

Veinte años antes de la observación de Metchnikoff de células fagocíticas mesenchyme en larvas de estrellas de mar, en 1882 y posterior desarrollo de su teoría de la fagocitosis1, Ernest Haeckel describió, en 1862, la inmersión de las partículas de colorante insoluble de sangre células de Tetis fimbris (fimbria de Tethys), una especie de rapaz mar slug (Ernest Haeckel. Die Radiolarien (Rhizopoda radiaria): Eine Monographie; Druck und Verlag von Georg Reimer, Berlín, 1862). Él describió explícitamente protuberancias de la membrana envolvente de las partículas, que posteriormente fueron tomadas en el citoplasma y acumuladas en el núcleo celular. Más de 100 años más tarde, un estudio pionero realizado por Kaplan sugirió que había al menos dos morfológicamente distintos mecanismos de fagocitosis2. Kaplan mostraron mediante microscopía electrónica de barrido peritoneal del ratón macrófagos ingestión un ovejas opsonizadora IgG eritrocitos usando extensiones de la membrana delgada que alcanzaron encima y envolvieron firmemente la partícula, inicialmente dando lugar a una forma de taza estructura. Fagocitarias Copa formación requiere polimerización de la actina ya que fue abrogada por la citocalasina toxina fúngica permeable a la célula B, conocido por bloquear la actinia dinámica3. En contraste, ovejas eritrocitos opsonizadora con complemento apareció directamente en los macrófagos sin la generación de extensiones de la membrana, aunque en algunas imágenes, volantes de membrana se pueden ver en los retrocesos inmediatos de las partículas que se hunde. A diferencia de la formación de Copa fagocítica, complemento mediada por receptor en era insenstive citocalasina B tratamiento2. En los experimentos descritos por Kaplan, complemento opsonización se realizó por incubación de inmunoglobulina M (IgM) con la etiqueta oveja glóbulos rojos con el suero de los ratones del complemento C5-deficiente, que evita la hemólisis por el terminal del complemento C5-dependiente complementan el complejo.
Los dos modos de fagocitosis, formación de Copa fagocítica y hundirse, identificados por Kaplan se han convertido en opinión establecida en el campo4,5,6,7,8,9 . Sin embargo, las imágenes de alta resolución utilizan en el estudio original de Kaplan2, así como un estudio similar por Munthe-Kaas et al. 10, sólo proporcionan copias instantáneas de eventos fagocíticas. En una revisión reciente, Rougerie et al. 11 destacó que las diferencias morfológicas entre FcγR y CR-mediada por la fagocitosis quedan por aclararse, y, además, volantes de membrana han sido observados durante el complemento mediada por receptor de partículas captación2. Imágenes de células vivas de eventos fagocíticas simples que abarcan desde la captura de la partícula a internalización, combinada con genéticamente modificados modelos de ratón, podrían mejorar grandemente nuestra comprensión de cómo los fagocitos capturan e ingieren partículas. Un método podría ser usar microscopía de fuerza rápida atómica (AFM) que permite la proyección de imagen topográfica de ultra alta resolución (10-20 nm) de las células vivas. Recientemente, se ha desarrollado un sistema rápido de AFM12 , que es conveniente para las superficies de células imágenes rápidamente con de poco ruido. Esta técnica tiene la ventaja de parámetros de alta resolución, topográficos y de mecánica de la vida las células se pueden medir a intervalos cortos (segundos), a diferencia de la microscopía electrónica de barrido, que exige la fijación y secado de punto crítico de células. Otro enfoque es la microscopia confocal 3D Time-lapse, que está ampliamente disponible, aunque fototoxicidad y blanqueo son factores limitantes durante grabaciones. Este enfoque es muy versátil y permite óptico seccionado con alta resolución espacial y permite extraordinaria flexibilidad en el etiquetado con una asombrosa gama de sondas fluorescentes, incluyendo proteínas fluorescentes genéticamente codificadas. Aquí describimos ensayos de fagocitosis usando microscopia confocal de disco de spinning Time-lapse que permiten alta resolución espaciotemporal de eventos fagocíticas mediado por el receptor.

<table><tbody><tr><td>Catéter de plástico de 24 G</td><td>B Braun Mesungen AG, Alemania</td><td>4254503-01</td><td>Utilizado para el lavado peritoneal</td></tr><tr><td>Hank' Solución salina tamponada sin Ca2+ y Mg2+</td><td>Thermo Fisher Scientific 14170120</td><td></td><td>Se utiliza para el lavado peritoneal</td></tr><tr><td>Tubos de fondo redondo de polipropileno de 14 mL BD</td><td>Falcon</td><td>352059</td><td>Se utiliza para recoger células peritoneales</td></tr><tr><td>Medio RPMI 1640 que contiene 20 mM Hepes</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R7388</td><td>Medio base para ensayos</td></tr><tr><td>Bovino fetal inactivado por calor suero</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10082139</td><td>Utilizado como suplemento para RPMI 1640 media</td></tr><tr><td>100x penicilina/estreptomicina</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15140122</td><td>Utilizado como suplemento para RPMI 1640 media</td></tr><tr><td>Recubierto de fibronectina &micro;-Slide&nbsp; I cámaras</td><td>Ibidi, Martinsried, Alemania</td><td>80102</td><td>Portaobjetos de canal utilizados para ensayos</td></tr><tr><td>&micro;-Portaobjetos (aluminio anodizado) bastidor</td><td>Ibidi, Martinsried, Alemania</td><td>80003</td><td>Bastidor apilable esterilizable en autoclave para portaobjetos</td></tr><tr><td>de canal RPMI 1640 medio que contiene bicarbonato</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R8758</td><td>Medio para cultivo nocturno</td></tr><tr><td>N-(2-mercaptopropionil)glicina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M6635</td><td>Eliminador de especies reactivas de oxígeno</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 monoclonal (IgG2a) monoclonal (clon BM8) anticuerpo F4/80 anti-ratón</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>MF48020</td><td>Marcador de macrófagos de ratón y marcador de membrana plasmática</td></tr><tr><td>CellMask Naranja</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>C10045</td><td>Tinción de membrana plasmática fluorescente roja</td></tr><tr><td>Éster de succinimidil de pHrodo</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>P36600</td><td>Éster de succinimidilo reactivo a aminas de ratón pHrodo</td></tr><tr><td>(IgG2b) monoclonal (clon HIR2) anti-humano CD235a&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>MA1-20893</td><td>Se utiliza para opsonizar glóbulos rojos humanos con IgG</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 594-conjugado&nbsp; anti-ratón de cabra (secundario) Anticuerpo IgG</td><td>Abcam</td><td>Ab150116</td><td>Se utiliza para confirmar la opsonización de glóbulos rojos humanos con IgG</td></tr><tr><td>de ratón Anticuerpo C3b/iC3b/C3c de rata</td><td>Hycult Biotech</td><td>HM1065</td><td>Se utiliza para confirmar la opsonización C3b/iC3b de glóbulos</td></tr> <tr><td>rojos humanosAlexa Fluor 488-conjugado anti-rata anticuerpo IgG de cabra</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A-11006</td><td>Utilizado como anticuerpo secundario para confirmar la opsonización de C3b/iC3b</td></tr><tr><td>Calceína/AM</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>C3100MP</td><td>Se utiliza para cargar glóbulos rojos humanos con Calceína</td></tr><tr><td>Sistema de imágenes de células vivas UltraVIEW Vox 3D&nbsp;</td><td>Perkin Elmer, Rodgau, Alemania</td><td></td><td>Sistema de microscopio confocal de disco giratorio</td></tr><tr><td>Microscopio inverso Nikon Eclipse Ti</td><td>Nikon, Japón</td><td></td><td>Microscopio invertido</td></tr><tr><td>Escáner de disco giratorio CSU-X1</td><td>Yokogawa Electric Corporation, Japón</td><td></td><td>Unidad de disco giratorio Nipkow</td></tr><tr><td>de 14 bits Hamamatsu C9100-50 Dispositivo de par con carga múltiple de electrones (EM-CCD) Cámara refrigerada por Peltier</td><td>Hamamatsu Photonics Inc., cámara</td><td></td><td>EM-CCD de Japón del sistema de microscopio confocal de disco giratorio &nbsp;</td></tr><tr><td>Láser de estado sólido de 488 nm, 50 mW</td><td>Perkin Elmer, Rodgau, Alemania</td><td></td><td>Fuente láser (488 nm) del sistema de microscopio confocal de disco giratorio</td></tr><tr><td>Láser de estado sólido de 561 nm, 50 mW</td><td>Perkin Elmer, Rodgau, Alemania</td><td></td><td>Láser (561 nm) fuente del sistema de microscopio confocal de disco giratorio</td></tr></tbody></table>

proyección de imagen 3d time-lapse de la fagocitosis por macrófagos de ratón

Time-lapse 3D Imaging of Phagocytosis by Mouse Macrophages

Fagocitosis juega un papel clave en la defensa del huésped, así como en el mantenimiento y desarrollo de tejido y consiste en los cambios rápidos, mediada por el receptor del citoesqueleto de actina, envuelven y fagocitar las partículas grandes. Aunque se han identificado receptores fagocíticos, vías de señalización corriente abajo y efectores, tales como Rho GTPasas, la remodelación citoesqueleto dinámico de eventos fagocíticas mediada por receptores específicos siguen siendo confusos. Hace cuatro décadas, dos mecanismos distintos de la fagocitosis, ejemplificado por receptores de Fcγ (FcγR) y receptor de complemento (CR) - mediada por la fagocitosis, se identificaron mediante microscopía electrónica. Atascamiento de la inmunoglobulina G (IgG)-partículas opsonizadas a FcγRs provoca la protuberancia de extensiones de membrana fina, que inicialmente forman una copa fagocítica llamada alrededor de la partícula antes de que se convierte en totalmente incluido y retraído dentro de la célula. En cambio, las partículas complemento opsonizadora parecen hundirse en el fagocito después de atar a los receptores de complemento. Estos dos modos de fagocitosis, formación de Copa fagocítica y se hunde, se han convertido en un bien establecido en la literatura. Sin embargo, las distinciones entre los dos modos han velado por los informes que complemento mediada por receptor fagocitosis puede inducir varias protuberancias de la membrana. Con la disponibilidad de técnicas de imagen de alta resolución, se requieren ensayos de fagocitosis que permiten visualización 3D (tres dimensiones) en tiempo real de lo específicos receptores fagocíticos mediato la captación de partículas individuales. Más utilizados enfoques para el estudio de la fagocitosis, como ensayos de punto final, pierda la oportunidad de entender lo que está sucediendo en el interfaz de partículas y de los fagocitos. Aquí describimos ensayos fagocíticos, usando microscopia confocal de disco spinning Time-lapse, que permite imágenes en 3D de eventos simples fagocíticas. Además, se describen ensayos inequívocamente de la imagen del receptor Fcγ - o complemento fagocitosis mediada por receptor.

En la figura 1se muestra un diagrama esquemático de la diapositiva del canal utilizado para la proyección de imagen de la fagocitosis mediante microscopía confocal spinning Time-lapse. Glóbulos rojos humanos (hRBCs) se tiñen con el marcador rojo fluorescente membrana del plasma CellMask Orange, mientras que los macrófagos peritoneales residentes de ratón aislados (Ms) están marcados con verde fluorescente Alexa Fluor 488-anticuerpo conjugado con anti-F4/80 ( Figura 2), que sirve como un marcador específico de los macrófagos de ratón y una etiqueta de la membrana plasmática. Glóbulos rojos humanos puede opsonizadora con IgG (mIgG) del ratón o mouse IgM (mIgM), por incubar las células con el anticuerpo anti-CD235a IgG (o IgM) (CD235a, también conocido como glicoforina A, es una proteína expresada específicamente en glóbulos rojos humanos). La proyección de imagen 3D Time-lapse de macrófagos fluorescentes verdes presentada con rojo fluorescentes glóbulos rojos humanos permite la visualización de eventos fagocíticas sola partícula (figura 2). Una observación más cercana de eventos simples fagocíticas permite detalles de la captura de la partícula y la ingestión a delinearse. Por ejemplo, la captura de un opsonizadora mIgG humano glóbulo rojo por un filopodium de macrófagos, una proyección delgada, dedo-como puede observarse (Figura 3A; vea también Horsthemke et al. 15). por otra parte, el exprimir de una célula de sangre roja humana durante la formación de Copa fagocítica puede observarse (Figura 3A). Sobre la introducción de suero dulce ratón, opsonizadora mIgG, o glóbulos rojos opsonizadora mIgM, humanos activan la cascada del complemento clásico, que culmina en la formación de un complejo de ataque a membrana hemolítico. La cinética de la hemólisis mediada por complemento puede medirse por las células con doble tinción con CellMask Orange y calceína la proyección de imagen. Verde fluorescente calceína citosólica se libera rápidamente de las células durante la hemólisis (figura 3B).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57566/57566fig1.jpg"> Figura 1: manejo de diapositivas del canal revestido de fibronectina. Diapositiva de canal (A) A consta de dos embalses conectados por un canal con las dimensiones diapositivas de 50 x 5 mm 0,4 mm. canal inicialmente se prellena aplicando medio 1-2 mL a uno de los dos embalses y inclinando el portaobjetos. Tapas (B) pueden ser colocados en los depósitos antes de la incubación. Las tapas se pueden utilizar convenientemente para bombear burbujas de aire no deseados antes de la siembra el canal con las células. Canal de 100 μl (C) el aire burbuja-libre puede ser llenado mediante Pipeteo directamente medio en la boca de un canal. Este paso se utiliza, por ejemplo, a los macrófagos de la semilla en una diapositiva o para añadir gfluorophore (verde fluorescente)-anticuerpo conjugado de anti-F4/80, que sirve como una etiqueta de la membrana, así como un marcador de macrófagos de ratón. (D) después de pipeteo partículas como opsonizadas glóbulos rojos humanos, en un canal sembrado con fluorescencia manchados los macrófagos, la diapositiva se puede colocar en el escenario de un microscopio invertido y microscopia confocal de disco de spinning Time-lapse puede ser realiza. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57566/57566fig1large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57566/57566fig2.jpg"> Figura 2: imagen 3D Time-lapse de fagocitosis. (A) esquema que muestra la opsonización de membrana plasmática teñida (rojo fluorescente) glóbulos rojos humanos (hRBCs) con anticuerpos de ratón (m) anti-CD235a de la inmunoglobulina G (mIgG) y presentación de la etiqueta hRBCs a los macrófagos de ratón (Ms), etiquetado (verde fluorescente) con verde fluoróforo conjugada anti-F4/80 de anticuerpos fluorescentes. (B) Time-lapse imágenes (vistas XZ), obtenidas por microscopía confocal de disco, mostrando la formación de Copa fagocítica y la ingestión de opsonizadora mIgG hRBCs de giro Barra de escala = 10 μm. (C) reconstrucciones 3D mostrando macrófagos ingieren opsonizadora mIgG hRBCs. Correspondiente vista XZ (para 3 de los puntos de tiempo) aparecen en representan distancias de cuadrícula B. 5.07 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57566/57566fig2large.jpg" target="_blank">haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57566/57566fig3.jpg"> Figura 3: captura de una partícula por una filopodium. Time-lapse imágenes, obtenidas por microscopía confocal de disco, que muestra un macrófago del ratón captura una inmunoglobulina de ratón G (mIgG) de giro-opsonizadas humana glóbulos rojos (hRBC) vía un filopodium (flechas en la parte superior del panel), una proyección en forma de dedo. Tenga en cuenta que el glóbulo rojo pierde sus crenations durante fagocitarias Copa formación. Además, la Copa fagocítica aparece para exprimir el envuelto de glóbulos rojos (indicado por las flechas en el panel inferior). Barra de escala = 10 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57566/57566fig3large.jpg" target="_blank">haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>

Aquí describimos los métodos usando microscopia confocal de disco de spinning solo eventos fagocíticas imagen por residente macrófagos peritoneales de ratón. Los protocolos pueden ampliarse a otras células fagocíticas.

Proyección de imagen 3D Time-lapse de la fagocitosis por macrófagos de ratón

Phagocytosis plays a key role in host defense, as well as in tissue development and maintenance, and involves rapid, receptor-mediated rearrangements of ...

El objetivo general de este ensayo, es preparar macrófagos y glóbulos rojos opsonizados para la visualización de la fagocitosis mediante microscopía tridimensional de lapso de tiempo. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la inmunología, como cómo los fagocitos capturan e ingieren partículas. Esta técnica permite la visualización de la absorción de partículas en tiempo real, a diferencia de los ensayos de punto final más tradicionales que sólo permiten la evaluación de si, pero no cómo, se ha ingerido una partícula.Generalmente, los individuos nuevos en este método pueden tener problemas hasta que se acostumbren a los procedimientos de aislamiento celular. Primero tuvimos la idea de este método cuando nos dimos cuenta de las ventajas de girar esta microscopía confocal para la imagen de lapso de tiempo 3D de la fagocitosis. Para aislar los macrófagos peritoneales, coloque un catéter plástico de calibre 24 en el peritoneo de un ratón de tres a cuatro meses de edad, y utilice una jeringa de plástico de cinco mililitros para limpiar la cavidad dos veces con 4,5 mililitros de HBSS helado sin calcio y magnesio por lavado.Transferencia de la suspensión aspirada a un tubo inferior redondo de polipropileno de 14 mililitros a medida que se recoge. Cuando ambas muestras hayan sido cosechadas, centrifugar el aspirado y resuspendir las células peritoneales en un mililitro de medio rpmI 1640 libre de bicarbonato completo para lograr aproximadamente seis veces 10 a la sexta concentración de células por mililitro. A continuación, para pre-llenar diapositivas añadir un mililitro de HEPES completo suplementado medio a un reservorio de un portaobjeto recubierto de fibronectina, e inclinar la diapositiva para permitir que el medio se aspire desde el depósito aguas abajo.Para eliminar las burbujas de aire no deseadas, agregue uno a dos mililitros de medio fresco a uno de los dos depósitos y aplique firmemente una tapa de depósito. A continuación, aplique presión rítmica del pulgar a la tapa para bombear cualquier aire fuera de la diapositiva, inclinando la diapositiva según sea necesario. Cuando todo el aire haya sido expulsado, incline el deslizamiento hacia el medio sin tapicear que contiene el depósito y retire la tapa para evitar que el aire vuelva a aspirar al canal.Ahora pipetear la solución celular un par de veces para reducir el aglutinamiento, y añadir 100 microlitros de las células en un canal de la diapositiva para una incubación de dos horas en una cámara húmeda a 37 grados centígrados en ausencia de dióxido de carbono. Al final de la incubación sustituya el medio que contiene HEPES en cada diapositiva por un medio completo de bicarbonato complementado como acaba de demostrar. Luego coloque las células en una incubadora húmeda de 37 grados centígrados con 5% de dióxido de carbono para su cultivo nocturno.A la mañana siguiente transfiera un mililitro de sangre de donante sano recién obtenida a un tubo de microcentrífuga de polipropileno de fondo redondo de dos mililitros. A continuación, centrifugar la muestra. Retire el plasma y la capa buffy que contienen sobrenadante.Y transfiera cuidadosamente 100 microlitros de los glóbulos rojos sedimentados a un tubo de mircocentrífugio de dos mililitros que contenga 100 microlitros de medio completo suplementado con HEPES. Etiquete el tubo 1:1 y transfiera cuatro microlitros de los glóbulos rojos diluidos a un nuevo tubo de microcentrífuga de dos mililitros que contenga dos mililitros de medio completo suplementado con HEPES. A continuación, etiquete este tubo 4:2000 y coloque ambos tubos de muestra de glóbulos rojos diluidos sobre hielo.Para etiquetar los macrófagos peritoneales reemplace el medio de bicarbonato en cada diapositiva de canal con medios completos complementados con HEPES. A continuación, incline la diapositiva para permitir que se añadan 100 microlitros del anticuerpo específico de macrófago de ratón con etiqueta fluorescente de interés a la apertura del canal de 100 microlitros de la diapositiva. Aspirar el medio que fluye hacia el depósito aguas abajo, e incubar las células durante 20 minutos en una cámara húmeda a 37 grados centígrados en ausencia de dióxido de carbono.Mientras que las células peritoneales están siendo etiquetadas suavemente mezclar 4:2000 muestra de glóbulos rojos y transferir 400 microlitros de las células en un nuevo tubo de microcentrífuga de dos mililitros, en un bloque de aluminio calentado dentro de una campana de flujo laminar durante unos cinco a ocho minutos. Cuando las células se han calentado a 37 grados celsius mezclar 0.4 microlitros de una mancha de membrana plasmática fluorescente roja apropiada con las células. A continuación, vuelva a colocar las células en el bloque de calor.Después de cinco minutos lavar las células mediante la adición de 1,6 mililitros de HEPES fresco complementado medio completo y centrífuga. Gire el tubo para identificar el gránulo de glóbulos rojos. Usando una punta de pipeta de uno a 1,5 mililitros retire cuidadosamente el sobrenadante en dos volúmenes sin alterar el pellet y mezcle 2000 microlitros de HEPES fresco complementado medio completo con las células.Centrifugar y volver a suspender el pellet en 400 microlitros de medio. A continuación, etiquete el tubo PMS para la mancha de membrana de plasma. Al final de la incubación del etiquetado peritoneal de 20 minutos, lave el portaobjetos con un mililitro de HEPES fresco y completo.Para opsonizar los glóbulos rojos añadir un microlitro de ratón IGG2B monoclonal anti humano CD235A anticuerpo al tubo de muestra PMS. Después de ocho minutos a 37 grados centígrados con la mezcla una vez por minuto, transfiera 100 microlitros de la membrana plasmática manchados de glóbulos rojos humanos astuitos A los macrófagos peritoneales que contienen el deslizamiento del canal. Tan pronto como se hayan añadido los glóbulos rojos humanos monte la diapositiva en un microscopio confocal de disco giratorio.Con la incubadora de etapas ajustada a 37 grados centígrados e inmediatamente comenzar a tomar imágenes de las células. Lapso de tiempo 3D-imágenes de macrófagos fluorescentes verdes presentados con glóbulos rojos fluorescentes humanos permite la visualización de eventos fagocíticos de partículas únicas. Por ejemplo, se puede observar la captura de un ratón IGG opsonizado glóbulo rojo humano por un filopodio macrófago.Así como, el exprimido de un glóbulo rojo humano durante la formación de la copa fagocítica. Después de ver este video usted debe tener una buena comprensión de cómo aislar los macrófagos peritoneales residentes del ratón, las células etiquetadas fluorescentemente, y las partículas opsonizadas.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Immunology and Infection

Inmunología e Infección

Source: Lê-Bury, G., et al. Phagosome Migration and Velocity Measured in Live Primary Human Macrophages Infected with HIV-1. J. Vis. Exp. (2016)This video demonstrates live confocal imaging of HIV-1-infected human macrophages to visualize and quantify phagosome migration using GFP fluorescence and bright field tracking, providing insights into how HIV alters intracellular trafficking during Fc receptor–mediated phagocytosis.

Live Imaging of Phagosome Migration in HIV-1-Infected Human Macrophages

Este video muestra un ensayo para monitorear eventos independientes de fagocitosis de glóbulos rojos (RBC) mediados por macrófagos. Los glóbulos rojos humanos opsonizados con inmunoglobulina G (IgG) de ratón se incuban con macrófagos de ratón y se observan al microscopio confocal. Los glóbulos rojos son engullidos por los macrófagos a través de una formación de copas fagocíticas y se dirigen a la degradación lisosomal.

Imágenes en tiempo real de la fagocitosis de macrófagos de glóbulos rojos opsonizados con IgG

Este video demuestra una técnica de microscopía de fluorescencia de reflexión interna total (TIRF) de alta resolución para la visualización en tiempo real de la formación y cierre de fagosomas durante la fagocitosis mediada por macrófagos de glóbulos rojos (RBC) opsonizados con IgG adheridos a la superficie de un plato con fondo de vidrio. Los macrófagos extienden seudópodos alrededor de los glóbulos rojos y los engullen dentro de los fagosomas, separándolos de la superficie del vidrio.

Visualización basada en microscopía TIRF de la formación y el cierre de fagosomas

Se describen métodos para la microscopia de vídeo en vivo de células...

Vídeo en vivo de células Microscopía de fagocitosis hongo patógeno

Phagocytic cells play a major role in the innate immune system by removing and eliminating invading microorganisms in their phagosomes. Phagosome ...

Estudio de fagolisosoma Biogénesis en macrófagos en directo

Aquí presentamos un protocolo para cuantificar la fagocitosis de partículas fluorescentes por una línea celular de macrófagos adherentes utilizando un método fluorométrico. Este método facilita una cuantificación de alto rendimiento de la internalización de partículas, así como la polimerización de actina resultante.

Alto Rendimiento Fluorométrico Técnica de Evaluación de macrófagos fagocitosis y actina polimerización

Describimos una configuración experimental para visualizar con una formación y cierre de fagosomas de alta resolución sin precedentes en tres dimensiones en macrófagos vivos, utilizando microscopía de fluorescencia de reflexión interna total. Permite el seguimiento de la base de la copa fagocítica, los pseudópodos en expansión, así como el sitio preciso de la escisión del fagosoma.

&quot;Fagosoma Cierre de ensayo&quot; para visualizar Fagosoma Formación en tres dimensiones utilizando la reflexión interna total fluorescente Microscopía (TIRFM)

En este estudio se tomó la imagen de la actividad fagocítica de macrófagos contra las células cancerosas, específicamente las células del carcinoma mamario del ratón 4T1. El modelo de cocultivo de células vivas se estableció y observó utilizando una combinación de microscopía de contraste de interferencia fluorescente y diferencial. Esta evaluación se realizó utilizando un software de imágenes para desarrollar vídeo de lapso de tiempo multipunto.

Time-Lapse 2D Imaging of Phagocytic Activity in M1 Macrophage-4T1 Mouse Mammary Carcinoma Cells in Co-cultures

Aquí describimos métodos que utilizan la microscopía de lapso de tiempo y contraste de fase para crear imágenes de macrófagos peritoneales residentes del ratón en un complemento quimiotáctico gradiente C5a. Los protocolos se pueden extender a otras células inmunitarias.

Imágenes de lapso de tiempo de Macrófago de ratón Chemotaxis

Aquí se presenta un protocolo para cuantificar y producir imágenes dinámicas de la regulación mediada por células madre mesenquimales (MSC) de la fagocitosis de macrófagos (MΦ) de partículas de levadura no opsonizada (zymosan) que se conjugan con una molécula fluorescente sensible al pH.

Regulación de células madre mesenquimales de la fagocitosis de macrófagos; Cuantificación e imágenes

Este protocolo describe un método de imagenología con células vivas y lapso de tiempo para visualizar la fagocitosis de células de cáncer de mama triple negativo marcadas con proteína verde fluorescente por macrófagos derivados de células mononucleares de sangre periférica, mediante el uso de un microscopio automatizado.

Imágenes de lapso de tiempo de la fagocitosis de células de cáncer de mama triple negativo marcadas con proteína de fluorescencia verde por macrófagos mediada por anticuerpos

Aprende a visualizar la fagocitosis en macrófagos peritoneales de ratón mediante microscopía confocal de disco giratorio. Esta técnica permite el análisis en tiempo real de la captura y ingestión de partículas.

Proyección de imagen 3D Time-lapse de la fagocitosis por macrófagos de ratón

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