Name: Delgada película compuesto silicio elastómeros para aplicaciones de piel y cultivo celular: fabricación y caracterización (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-07-03T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 2 s
Description: Aprende a fabricar y caracterizar películas delgadas de elastómeros de silicio para aplicaciones de piel y cultivo celular. Este protocolo permite producir materiales con precisión en aproximadamente tres horas.

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Martin Danner es reconocido por su ayuda en la preparación de muestras y establecimiento de procedimientos de cultivo celular. Los autores quisieran agradecer Biesterfeld insta GmbH (Hamburgo, Alemania), especialmente de Robert Radsziwill para apoyo continuo y discusión. La investigación conduce a estos resultados ha recibido financiación del Consejo Europeo de investigación en convenio de subvención de ERC de séptimo programa marco (FP/2007-2013) de n. la Unión Europea 340929.

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Los autores no tienen nada que revelar.

El diseño de estructuras de compuestos permite el simple ajuste de propiedades de los materiales, tales como módulo de Young o el espesor de las muestras. Módulo de Young de PDMS puede cambiar con eficacia en una amplia gama por alterar la relación de mezcla entre los dos componentes o la fabricación de mezclas utilizando un30,de elastómero de silicona diferentes31. Los métodos descritos no se limitan a los PDMS usada en la investigación actual, pero sobre todo el desempeño adhesivo depende en el tipo específico utilizado. Un paso crítico dentro de este protocolo es el proceso de fabricación de las películas compuestas (figura 1). Fue demostrado que el espesor de las películas afecta significativamente el comportamiento de la adherencia de las películas sobre diferentes sustratos, incluyendo la piel (figura 5 y figura 6). Además el espesor de la película, tiempo y temperatura durante el proceso de polimerización afecta a las propiedades de los materiales32. Por lo tanto, parámetros como el espesor de las capas poliméricas tienen que ser cuidadosamente adaptados y verificado.
Análisis de las propiedades adhesivas de las películas delgadas se realizaron con medidas de adhesión fuerza normal con dos substratos de vidrio de diferente rugosidad hasta Ra = 0.338 μm (figura 3). En general, rugosidad afecta significativamente la adherencia de las superficies, especialmente de materiales elásticos33,34. La aspereza del vidrio puede ser variada fácilmente mediante pulido con papel de lija de tamaños diferentes asperezas, por lo tanto, lo que permite la fabricación de sustratos exhibiendo mayor rugosidad valores21. Además, otros materiales, por ejemplo resina epoxi se puede utilizar para la producción de sustratos15,35. Esto podría ser una estrategia importante modificación del protocolo presentado. Por ejemplo, si sustratos exhibiendo diferentes superficie libre energías son necesarias o específicas topografías son necesarias. Aquí, pull-off estrés y el trabajo de separación de las láminas delgadas fabricada de PDMS y SSA se analizaron con una configuración a la medida (dispositivo de medición macroscópica adherencia (MAD, figura 4)). 36 alineación óptica de sustrato y el penetrador es un paso crítico para el análisis de los resultados de medición. Por lo tanto, ajuste del ángulo de inclinación debe realizarse con el goniómetro, tan preciso como sea posible. Esto se logra con suficiente precisión introduciendo manualmente el sustrato en el contacto con la superficie de la película hasta que se logre un contacto horizontal.
En el protocolo actual, el tiempo de espera se mantuvo constante en un segundo (figura 5 y figura 7). Especialmente para la investigación del rendimiento adhesivo de una película elástica a una superficie sustrato ásperas, una extensión del tiempo de espera proporciona información adicional. Por ejemplo, un aumento en la tensión de pull-off con el aumento de tiempo de espera ha sido reportado8. Además de las mediciones realizadas en el actual protocolo, otros métodos, por ejemplo cáscara pruebas podrían realizar, lo que permite una investigación más exhaustiva de adherencia rendimiento37.
Las propiedades adhesivas de folios exhibiendo la película diferentes espesores del adhesivo suave piel se determinaron (figura 7). Nuestros resultados están en consonancia con datos publicados que indican que una disminución de plomo de espesor de película a un aumento de la tensión de pull-off como el confinamiento, es decir, la relación entre sustrato diámetro y película grueso, aumenta38,39 . Basado en estos resultados y los datos representados en la figura 7, se concluye que folios con un grosor total de unos 100 μm (espesor de la capa de la SSA de aprox. 60 μm aplicada a una película PDMS con un espesor de aprox. 40 μm) presentan adherencia favorable p propiedades en las superficies ásperas.
A continuación, folios vírgenes se han realizado experimentos relacionados con la caracterización biológica y plasma tratado folios (figura 8). Tratamiento del plasma de los elastómeros de silicona es una técnica frecuentemente aplicada, versátil para aumentar las propiedades hidrofílicas de las superficies y promover accesorio celular y celular separarse40,41. Siliconas son bien conocidas por su baja toxicidad y alta bioestabilidad pero pueden contener monómeros residuales o catalizadores que puedan influir en los procesos fisiológicos, también conduce a la citotoxicidad42,43. En la llevaron a cabo experimentos hemos observado menos de 5% de citotoxicidad mediante la liberación LDH como un indicador y un análisis de exclusión azul de tripano. En el protocolo presentado, toda la población celular, incluyendo agregados celulares individual de forma que la superficie ha sido analizada para el análisis de la proliferación (figura 9B). Una modificación del protocolo podría producir resultados más diferenciados. Para cada muestra, el sobrenadante que contiene agregados celulares separadas podría transfirió a un tubo de reacción separada y no se combina con las células enzimático extraídas de la superficie del polímero. Esto permite la exacta evaluación de las células a la superficie y finalmente revelar una determinación más detallada de la influencia de los polímeros en el proceso de adhesión celular. Además de los métodos de inmunocitoquímica presentados aquí, las células podrían cosecharse para investigación con métodos de immunoblot, lo que permite una detallada evaluación cuantitativa de la expresión de la proteína.
En Resumen, hemos establecido las condiciones de fabricación para la producción de películas delgadas de compuestos elastoméricas para aplicaciones en la investigación de la cultura avanzada de la célula. Además, estas películas delgadas poseen alta capacidad de adaptación a la piel la aspereza, permitiendo el sofisticado diseño de adhesivos de la piel.

En este protocolo, se presentan métodos detallados para la fabricación de películas delgadas elastómero. El doctor ampliamente disponibles hoja técnica se ha utilizado para la producción de películas delgadas de compuestos. La técnica de fabricación se ha realizado en hojas de polyethylenterephtalate (PET), permitiendo la posterior producción de estas películas en gran escala. El énfasis de este protocolo es la evaluación de reproducibilidad, precisión de la fabricación de las diferentes capas de los folios y la determinación de las propiedades biológicas y adhesión del parche compuesto final. El poly-(dimethylsiloxane) de elastómero de silicona (PDMS) se utiliza ampliamente en tecnología biomédica, incluyendo la producción de adhesivos de la piel, aplicaciones de microfluídica e investigación adicional campos1,2,3 ,4. Recientemente, otra subclase de PDMS, llamados adhesivos de piel suave (SSA) han sido introducidas, en particular para la suave piel de la vinculación y la vinculación.
SSA de silicona son elastómeros de vinilo funcionalizado, difieren de los polímeros análogos por la ausencia de sílice5de refuerzo. Similar a otros PDMS, SSA módulo de Young se puede adaptar en una amplia gama de modulación concentración vinculante o curado tiempo6,7,8. Este cambio en el módulo de Young de los elastómeros de silicona afecta significativamente las propiedades adhesivas del material y también tiene profundas consecuencias en las células procariotas y eucariotas cultivadas en la superficie9,10 , 11. en el nivel biológico celular, demuestra, que las células eucariotas responden en el nivel de la transducción de señal a una modulación de la elasticidad de la matriz o el espesor de la superficie9,10,12 ,13,14. Por lo tanto, existe un amplio interés en aplicaciones de cultivo celular de polímeros con propiedades mecánicas ajustables. Lo importante es la intrínseca baja energía superficial de los elastómeros de silicona no proporciona las condiciones óptimas para el cultivo celular de las células eucariotas. Tratamiento plasma de oxígeno es una técnica ampliamente utilizada para aumentar el PDMS baja energía superficial temporalmente, conduce a una mejora de su fuerza pull-off, disminución de adsorción superficial de las moléculas, mientras que paralelamente promover la fijación, difusión y proliferación de las células eucariotas15,16,17,18.
Además de las propiedades de los materiales, la topografía de la superficie afecta significativamente la adhesión celular y la interacción adhesiva entre dos materiales19,20,21,22. Rugosidad de la superficie tiene varios efectos en la formación de contacto entre dos superficies: reducción de la superficie de contacto, alta almacena energía elástica que rodea asperezas así como influencia en la propagación de la grieta puede alterar la fuerza adhesiva23, 24. Adhesión de películas a la piel humana es un campo emergente de la aplicación, por ejemplo, apósitos, fijación de los electrodos de ECG u otros dispositivos electrónicos portátiles25,26,27, 28. Para medir el rendimiento adhesivo de auto-adhesivos en relación con la topografía de la superficie, substratos de vidrio con diferentes grados de rugosidad pueden utilizarse en mediciones de adherencia normal8,21. Aquí, dos substratos de vidrio han sido seleccionados para la investigación de las propiedades adhesivas de las películas de polímero. Se caracterizaron las películas primeras, compuestas con una capa de forro de PDMS en una proporción de 10 a 1 peso partes cubiertas por PDMS con diferente proporción de mezcla. En un segundo paso una capa adhesiva de SSA fue preparada con cantidades de peso igual de ambos componentes y con diferentes espesores de película en la parte superior una soporte película PDMS.

<table><tbody><tr><td>2-Propanol, 97%</td><td>Stockmeier Chemie</td><td>1000452610000</td><td>Isopropanol</td></tr><tr><td>Abrasivo almohadilla de mano Diamnod</td><td>Bohle</td><td>MO 5007522</td><td>Grano: 220</td></tr><tr><td>Accutase</td><td>Capricornio Científico</td><td>ACC-1B</td><td></td></tr><tr><td>Albúmina Fraktion V</td><td>Roth</td><td>0163.2</td><td>BSA</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 Faloidina</td><td>ThermoFischer Scientific</td><td>A12379</td><td>altamente tóxico</td></tr><tr><td>Aquamount</td><td>Polysciences</td><td>18606-20</td><td>medio de montaje soluble en agua</td></tr><tr><td>CytoTox-ONE Ensayo de integridad de membrana homogénea</td><td>Promega</td><td>G7890</td><td></td></tr><tr><td>DPBS, sin Ca2+, Mg2+</td><td>ThermoFischer Scientific</td><td></td> 14190094 <td></td></tr><tr><td>Suero fetal bovino oro</td><td>GE Health Care Life Science</td><td>A15-151</td><td>FBS</td></tr><tr><td>Goniómetro OCA35</td><td>Dataphysics</td><td></td><td>para la determinación del ángulo de contacto estático con el agua</td></tr><tr><td>Hoechst Dye 33342</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B1155-100MG</td><td>bisBenzimide H 33342 triclorhidrato, altamente tóxico</td></tr><tr><td>Microscopio Axiovert 25</td><td>Zeiss</td><td>Microscopio utilizado para la documentación</td>de <td></td> cultivos celulares</tr><tr><td>Microscopio Eclipse LV100ND</td><td>Nikon</td><td></td><td>Microscopio utilizado para la determinación del espesor de la película</td></tr><tr><td>Paraformaldehído, solución acuosa 16%</td><td>Microscopía electrónica Ciencias RT</td><td>15710</td><td>microscopía electrónica grado</td></tr><tr><td>de penicilina y solución de estreptomicina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4333-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Phenom XL Microscopio electrónico de barrido (SEM)</td><td>Phenom</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Poly-(alcohol vinílico) 4-88, MW 31000</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>81381-1KG</td><td>Mowiol 4-88</td></tr><tr><td>Poli-dimetilsiloxanos, Sylgard 184</td><td>Dow Corning</td><td>(400)000108351397</td><td>PDMS</td></tr><tr><td>RPMI 1640 medio basal</td><td>ThermoFischer Scientific</td><td>21875034</td><td></td></tr><tr><td>adhesivo de piel blanda (SSA)</td><td>Dow Corning</td><td>(400)000108251792</td><td>MG 7-9800 Adhesivo de piel blanda (SSA)</td></tr><tr><td>mezclador de velocidad DAC 600.2 VAC-P</td><td>Hauschild</td><td></td><td></td></tr><tr><td>lápiz óptico profilomter</td><td>Zeiss</td><td>Modelo: SURFCOM 1500SD3</td>Tecan Infinite M200 pro Lector de <td></td></tr><tr><td></td><td>placas de fluorescencia</td><td>Tecan</td><td></td></tr><tr><td>Triton X 100</td><td>Calbiochem</td><td>648466</td><td></td></tr><tr><td>solución de Trypan Blue</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8154-100ML</td><td>solución de</td></tr><tr><td>tripsina/EDTA</td> altamente tóxica <td>PAN-Biotech</td><td>P10-023500</td><td>0,05% de tripsina, 0,02% EDTA en PBS</td></tr><tr><td>Pegamento UV</td><td>Bohle</td><td>BO MV76002</td><td>viscosidad media</td></tr></tbody></table>

delgada película compuesto silicio elastómeros para aplicaciones de piel y cultivo celular: fabricación y caracterización

Thin Film Composite Silicon Elastomers for Cell Culture and Skin Applications: Manufacturing and Characterization

En este protocolo, se presentan métodos para fabricar películas compuesto elastómero delgada para aplicaciones de cultura avanzada de la célula y para el desarrollo de adhesivos de la piel. Dos-(dimethyl siloxanes) poli diferentes PDMS y pegamento de piel suave (SSA), se han utilizado para en investigación de profundidad de efectos biológicos y características adhesivas. Los folios consisten en una capa de respaldo flexible y una capa superior. Ambas capas son fabricados por la técnica de aplicación de la lámina de doctor. En la presente investigación, se ha investigado el comportamiento adhesivo de los folios como una función del espesor de capa o de una variación del módulo de Young de la capa superior. Módulo de Young de PDMS ha cambiado mediante la variación de la base a la proporción de mezcla del crosslinker. Además, el espesor de las películas de la SSA ha sido variado de aprox. 16 μm a aprox. 320 μm. barrido microscopía electrónica (MEB) y microscopía óptica se han utilizado para mediciones de espesor. Las propiedades adhesivas de láminas de elastómero dependen fuertemente del espesor de la película, módulo de Young de los polímeros y las características de superficie. Por lo tanto, se ha investigado la adherencia normal de estas películas sobre sustratos de vidrio que superficies lisas y rugosas. Pull-off el estrés y el trabajo de separación dependen de la proporción de mezcla de elastómeros de silicón.
Además, el espesor del adhesivo suave piel colocado sobre una capa de apoyo de apoyo ha sido variado con el fin de producir parches para aplicaciones de piel. Citotoxicidad, proliferación y adhesión celular de elución de L929 fibroblastos murinos en películas PDMS (proporción 10:1) y SSA (proporción 50: 50 de la mezcla) se han realizado. Han demostrado, por primera vez, la comparación de lado a lado de películas delgadas de compuestos fabricados de ambos polímeros y presentar la investigación de sus propiedades biológicas y adhesivo.

Se presenta un protocolo para el proceso de fabricación de estructuras de compuestos poliméricos de película delgada que poseen diferentes jóvenes moduli o espesores. Las películas se fabrican para estudios del cultivo celular avanzada o como adhesivos de la piel.

Delgada película compuesto silicio elastómeros para aplicaciones de piel y cultivo celular: fabricación y caracterización

In this protocol, we present methods to fabricate thin elastomer composite films for advanced cell culture applications and for the development of skin ...

El objetivo general de este procedimiento es fabricar y caracterizar estructuras compuestas poliméricas de película delgada para estudios avanzados de cultivo celular o como adhesivos cutáneos. Este método puede ayudar a responder preguntas clave sobre cómo se pueden utilizar los compuestos elastoméricos para lograr una acción de adherencia óptima, incluso en superficies irregulares. Las principales ventajas de estas técnicas son que son sencillas y de aplicación universal.Esto permite la fabricación a gran escala con una precisión muy alta. Por lo general, las personas nuevas en este método tendrán dificultades, porque las mediciones de adhesión requieren un entrenamiento y una práctica intensivos para lograr la precisión necesaria. La demostración de los procedimientos de cultivo celular y la aplicación de plasma estará a cargo de Angela Rutz, técnica de nuestro laboratorio.Para preparar el PDMS, mezcle y desgasifique 1,1 gramos de la mezcla de prepolímero en un mezclador de velocidad a 2350 RPM al vacío durante tres minutos. Para preparar la capa de soporte de PDMS, utilice una máquina de aplicación de rasquetas controlada automáticamente. Coloque la rasqueta encima de un trozo de papel de aluminio de PET 100% limpio con isopropanol y utilice los tornillos de microposicionamiento para ajustar el grosor de la capa de soporte.Cargue el PDMS en una jeringa de 10 mililitros de un solo uso. Llene el depósito de la rasqueta con el polímero e inicie el movimiento de la rasqueta con una velocidad de aproximadamente 2 milímetros por segundo. Cuando se haya recubierto el trozo de película de PET, transfiera la película a un horno a 95 grados centígrados durante una hora.Para preparar la capa superior de la película compuesta, use una cuchilla para quitar tiras delgadas de los lados largos de la capa de respaldo. Para permitir que la rasqueta se deslice sobre la lámina de PET y aplique la segunda capa de PDMS como se describió anteriormente. Luego, coloque el papel de aluminio en el horno.Para preparar las muestras para las mediciones de adhesión, use una cuchilla de afeitar para cortar las películas de la lámina de PET en piezas de cuatro centímetros cuadrados de área y use pegamento UV para asegurar las piezas en un portaobjetos de vidrio. Ilumine las piezas con luz ultravioleta durante tres minutos y monte la primera muestra polimérica en el portamuestras. Utilice el goniómetro para ajustar el ángulo de inclinación, hasta que el sustrato esté en contacto con la película polimérica en una alineación completamente paralela de ambas superficies, tal como se visualiza en las imágenes de la cámara.La alineación óptica del sustrato con la muestra es muy crítica para interpretar los resultados de la medición. Por lo tanto, el ajuste del ángulo de inclinación debe realizarse con la mayor precisión posible utilizando el inclinómetro. Mueva el sustrato alineado a la superficie de la película polimérica hasta que se logre una tensión de precarga de 13 más o menos cinco kilopascales, e inicie el paquete de software programado personalizado escrito en LabView.A continuación, establezca los parámetros de medición necesarios para medir las propiedades de adhesión de tres muestras fabricadas de forma independiente en seis ubicaciones diferentes de cada superficie de película. Para preparar las películas para la microscopía óptica, utilice una cuchilla de afeitar para cortar la muestra polimérica en trozos de 0,25 centímetros cuadrados y fije las piezas al borde de un portaobjetos de vidrio. Luego, coloque el portaobjetos en orientación vertical bajo un microscopio vertical y mida el grosor de la sección transversal de la película.Para preparar un experimento de cultivo celular, primero use un bisturí para cortar piezas de aproximadamente cinco por cinco milímetros de la capa de soporte de PET, y use pinzas para transferir las piezas a cubreobjetos de vidrio individuales de 12 milímetros. Transfiera los cubreobjetos dentro de la cámara de reacción de un dispositivo de plasma y cierre la tapa del dispositivo. Evacúe la cámara hasta alcanzar una presión de 1,6 veces 10 por menos milibares, y trate las películas con plasma durante tres minutos.Luego, ventile la cámara de reacción y transfiera las muestras a pocillos individuales de una placa de 24 pocillos. A continuación, lave un cultivo celular L929 confluente del 70 al 80 % con DPBS libre de calcio y magnesio durante 30 segundos en una cabina de flujo laminar. Seguido de una incubación de cinco minutos con dos mililitros de una solución proteolítica y colagenolítica adecuada a 37 grados centígrados y 5% de CO2.Cuando las células se hayan desprendido, agregue ocho mililitros de medio suplementado con suero y transfiera las células a un tubo cónico de 15 mililitros. Luego, después de contar, siembre 60.000 células por mililitro de medio por pocillo de la placa de 24 pocillos que contiene las muestras poliméricas, y coloque la placa en la incubadora de cultivo celular durante tres días antes de la captura y fijación de la imagen de contraste de fase. Dependiendo del espesor de la película superior, se observa una disminución de la tensión de extracción con un aumento del espesor de la película, independientemente de la textura de la superficie del sustrato.El trabajo de separación, sin embargo, suele ser ligeramente menor para las superficies de sustrato rugosas en comparación con las lisas. Cuando se registra el mecanismo de desprendimiento, se observa poca cavitación en las películas más delgadas, mientras que la aparición de grietas en forma de dedos es observable en las películas más gruesas. Los experimentos de cultivo celular revelan que las células sembradas en polímeros prístinos muestran un comportamiento de adhesión y propagación celular deficientes, mientras que la monocapa confluente se observa para células cultivadas en superficies tratadas con plasma.En general, los niveles de lactato deshidrogíaca son comparables para las células cultivadas en ambos materiales poliméricos, con menos del 5% de citotoxicidad. Una vez dominados, la producción de los compuestos de película polimérica se puede completar en aproximadamente tres horas. Aunque el análisis posterior con una prueba de adherencia normal requiere capacitación, es una herramienta muy poderosa para investigar las propiedades adhesivas de las películas.Después de ver este video, debe tener una buena comprensión de cómo fabricar películas compuestas poliméricas delgadas y analizarlas con pruebas de adhesión específicas y herramientas biológicas celulares. No olvide que trabajar con productos químicos y materiales biológicos puede ser extremadamente peligroso. Por lo tanto, tome las precauciones adecuadas, como seguir los procedimientos de seguridad obligatorios, usar equipo de protección de seguridad personal y manipular estos materiales en un gabinete de seguridad.

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Research

Investigación

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