Name: Microdissection de la captura del laser de la malla Trabecular muy pura de ojos de ratón para análisis de expresión génica (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-06-03T13:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 47 s
Description: Aprende microdissección láser para aislar la malla trabecular de ojos de ratón con alta pureza. Este método permite obtener ARN de calidad para análisis de expresión génica en estudios oftalmológicos.

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Toda metodología de este estudio en el NIEHS Animal estudio propuesta IIDL 05-46 aprobó el nacional Instituto de Ciencias de salud ambiental (NIEHS) Animal cuidado y uso de Comité (ACUC).
1. colección de tejido óptima para Microdisección láser
<ol><li>Obtener 2 a 3 meses ratones, C57BL/6 macho o hembra. Eutanasia con CO2 para un mínimo de 1 minuto o hasta que la respiración ha cesado. Quitar el animal de la jaula y asegurar la muerte por dislocación cervical, decapitación o toracotomía.</li>
	<li>Antes de la disección, sean todas las herramientas de disección limpia y esterilizada. Nota: Para la eliminación de los ojos curvada tijeras y pinzas con punta dentada (preferido punta: 0.5 x 0.4 mm) será necesario.</li>
	<li>Coloque el ratón sobre una superficie plana en su lado, de manera que el ojo es fácilmente accesible. Aferramos al ángulo del ojo (rabillo del ojo) con la pinza estabilizar el ratón, y luego con las tijeras curvas, frente a la curva de los ojos, corte alrededor del ojo con el zócalo del ojo como guía hasta que el globo ocular se puede tomar fácilmente de la toma (utilizar la curva no la puntas de las tijeras).</li>
	<li>Jale con cuidado y, usando las tijeras curvas, corte del nervio óptico, que lanza el ojo de la cavidad orbitaria. Retire con cuidado el tejido no-ocular de los ojos y enjuáguelos en el 1 x de tampón fosfato salino (PBS). Repita 1.3-1.4 para el ojo contralateral.</li>
	<li>Seque el ojo con un trapo de tejido para quitar toda la humedad antes de incrustar. Colocar el ojo en molde (25 x 20 x 5 mm3) de la muestra para que la lente y del nervio óptico son paralelos a la mesa con el fin de obtener las secciones sagitales. Incrustar ojos de óptimo corte temperatura (O.C.T.) compuesto y coloque en el hielo seco para congelar. Una vez congelado, almacenar los bloques a-80 ° C.</li>
</ol>2. congelado de la sección Preparación para Microdisección láser
<ol><li>Antes de usar incubar terephthalate del polietileno (animal doméstico) membrana desliza en vinculante de UV a máxima potencia durante 45 minutos.</li>
	<li>Rocíe la solución de descontaminación de Rnasa en el cepillo, pinzas, frascos de acoplamiento y montaje de mandril. Limpie. Enjuague con agua libre de nucleasas y seque. Limpie el criostato con etanol al 100% para evitar la contaminación cruzada.</li>
	<li>Ajustar el criostato a-18 ° C. Eliminar un bloque congelado de congelador de-80 ° C en un tiempo y entregar al criostato con hielo seco. Permite el bloque congelado se equilibren con la temperatura del criostato para un mínimo de 10 minutos.</li>
	<li>Apriete una pequeña cantidad de O.C.T. en el pedazo de montaje (figura 1A) y desmoldar el bloque de tejido y coloque con cuidado el bloque en el mandril de montaje (figura 1B). Una vez que el bloque de tejido en el mandril de montaje está congelado sólido, inserte el soporte de espécimen de criostato (figura 2A).</li>
	<li>Ajustar el criostato para cortar 8 tramos de μm y cuidadosamente la sección a través del bloque O.C.T. para llegar a la muestra de tejido. Una vez que se observa el tejido, deje de seccionamiento, recortar los bloques congelados por todos lados con una navaja limpia y deje de O.C.T. el tejido circundante para permitir la manipulación con el pincel (figura 2B) 3-4 mm. Use un nuevo pincel limpio en lugar de la placa del rodillo entre cada cambio de muestra para evitar la contaminación cruzada de la muestra.</li>
	<li>Sección a través del ojo de trabajo rápidamente. Mancha mancha cada tercera sección inundando la diapositiva con un paso rápido hematoxylin y eosina (H & E) de 60 s, enjuague con agua corriente, aire seco, en agente de claro y montar en un portaobjetos de vidrio cargada con un cubreobjetos. Ver bajo el microscopio y continuar hasta que la TM es evidente en las secciones de corte de seccionamiento.</li>
	<li>Una vez que el TM comienza a aparecer, cortar 2 secciones y montar en un portaobjetos de vidrio cargados de rutina de H & E tinción para formar un mapa para el corte con LCM. Nota: Ver sección 3 para el mapa y detalles de coloración.</li>
	<li>Después de la primera H & E mapa de deslizamiento, corte y línea 6 serial 8 μm espesor secciones en criostato y montar simultáneamente en la diapositiva de la membrana de PET (Figura 3A, B). Adherir el tejido deslizando brevemente dedo enguantado a lo largo de la parte posterior de la membrana. Después del montaje, coloque el portaobjetos de la membrana de PET inmediatamente en una caja de deslizamiento en hielo seco. Nota: Las secciones menos se pueden montar, sin embargo, varias secciones en la diapositiva a la vez es recomendable utilizar para reducir la degradación de RNA limitando la cantidad de tiempo de que cada sección se expone a la temperatura ambiente.</li>
	<li>Continuar a la sección el ojo, después cada dos diapositivas de membrana de PET con 6 secciones, recoger dos secciones en un portaobjetos de vidrio cargada para crear otra diapositiva del mapa para la tinción de H & E. Continuar de seccionamiento, aproximadamente 100 μm 8 serial secciones gruesas, hasta que TM no es visible. Confirme rápidamente tiñendo una sección en un portaobjetos de vidrio cargada (ver 2.6).</li>
	<li>Almacenar las diapositivas de membrana de PET a-80 ° C para su uso posterior del LCM.</li>
</ol>3. H y E mapa Deslice el protocolo de tinción y examen morfológico
<ol><li>Para visualizar y revisar las diapositivas del mapa en las diapositivas de vidrio cargada, fijar el tejido mediante la transferencia de inmediato en un recipiente de tinción lleno de 100 mL de la solución de fijación rápida para enjuague s. 7 la diapositiva sumergiéndola en agua destilada 10 - 20 veces , entonces transfiera el porta a un frasco de acoplamiento con agua destilada.</li>
	<li>Quitar la corredera de agua y luego seco bordes con paño tejido. Pipeta de 200 μL modificado filtrado Harris Hematoxylin en cada sección e incube durante 30 s a temperatura ambiente. Enjuagar cuidadosamente el portaobjetos con agua corriente hasta que el agua salga claro. Borrar el final de la diapositiva con un trapo de tejido entre cada paso (blot entre cada paso de 3.2-3.5) para eliminar el exceso de líquido.</li>
	<li>Diapositiva de lugar de 1 x PBS a temperatura ambiente durante 30 s. Luego, enjuague con cuidado el portaobjetos con agua corriente durante 30 s.</li>
	<li>Inmersión de la diapositiva 3 - 4 veces en el baño de etanol de 95%. Aplique suficiente solución de colorante eosina Y para cubrir el tejido sobre el portaobjetos e incube durante 15 s a temperatura ambiente.</li>
	<li>Enjuagar el portaobjetos en un baño de etanol 95% dos veces con 10-20 inmersiones rápidas cada. Enjuagar el portaobjetos en un baño de etanol 100% dos veces con 10-20 inmersiones rápidas cada. Luego, enjuagar el portaobjetos dos veces en el baño de xileno (10-20 rápido sumerge cada).</li>
	<li>Montaje mediante la aplicación de medio de montaje resinosa al tejido, añadir el cubreobjetos con cuidado para evitar burbujas de aire y deje secar durante la noche en la capilla.</li>
	<li>Informe H & E se desliza visualmente o mediante un escáner de diapositivas digitales. Identificar mapa diapositivas con TM claramente visible y accesible para el corte. Utilizar la mascota diapositivas membrana entre estos mapa diapositivas de LCM.</li>
</ol>4. polietileno tereftalato (PET) membrana diapositivas protocolo procesamiento y tinción
<ol><li>Antes de quitar diapositivas de PET del congelador primero prepare solución violeta de cresilo disolviendo 0,3 g de acetato de cresilo violeta en 20 mL de etanol al 75% y colocar en coctelera para filtro de la solución con 0,22 μm filtro estéril y conservar a 4 ° C por no más de 2 h. de 6 el lunes MLS.</li>
	<li>Preparar eosina solución alcohólica con fresco 75% de etanol en una proporción de 1:4. Preparar soluciones de deshidratación (etanol 100%, 75% y 95%) y fijación (etanol del 75%) en los tubos polipropileno cónico de 50 mL limpio, libre de nucleasas, sobre hielo. Añadir el inhibidor de la Rnasa a cada solución.</li>
	<li>Retire la caja de diapositivas que contienen secciones de tejido congelado del congelador de-80 ° C y colocar en hielo seco. Proceso de una diapositiva al tiempo. Fijar diapositivas colocando la diapositiva inmediatamente en etanol frío del 75% durante 30 s.</li>
	<li>Cuidadosamente sumerja el portaobjetos en agua libre de nucleasa para 10-15 s disolver O.C.T. sin interferir con las secciones de tejido.</li>
	<li>Cuidadosamente pipetee 300 μL de solución de acetato violeta de cresilo 1.5% directamente a las secciones e incubar durante 45 s a temperatura ambiente. Luego, lavar una vez colocando en el baño de etanol 75% para 30 s. pipeta de 200 μL Y solución según en las secciones e incubar durante 3-5 s.</li>
	<li>Deshidratar el tejido colocando posteriormente el portaobjetos en etanol al 75%, etanol al 95% y, finalmente, baño de etanol 100% durante 30 s cada uno. Borrar el final de la diapositiva con un trapo de tejido entre cada paso para eliminar el exceso de líquido. Airee el tobogán seco completamente debajo de la campana por 5 min. Una vez seco, realizar LCM inmediatamente después. Nota: Se recomienda evitar el uso de xileno para este paso, puede hacer que las secciones de tejido para adherir a la diapositiva de la membrana y reduce la eficiencia de captura de tejido.</li>
</ol>5. láser microdisección con láser UV
<ol><li>Encienda el ordenador y deje que arranque. Abra el suministro de energía de luz blanca del microscopio. Encienda la llave de láser UV y un amarillo LED se iluminará. Inicie el software de la LCM, permite cargar completamente y un video en vivo mostrará. Presione el botón del láser en la caja del regulador y un LED verde se iluminará.</li>
	<li>Cargar una nueva diapositiva de cristal sobre la platina del microscopio, luego coloque el portaobjetos de la membrana de PET con el lateral de tejido teñido hacia abajo directamente en la parte superior del portaobjetos de vidrio. Asegúrese de que la membrana y el portaobjetos de cristal están emparejados firmemente sobre la platina del microscopio.</li>
	<li>Inicio LCM estableciendo primero los límites de la diapositiva. Elija la menor 4 X aumentos en el panel de objetivos (figura 4). Luego definir el área de trabajo de la diapositiva de membrana moviendo la microscopios xy-etapa hasta la esquina superior izquierda, donde se unen el metal y la membrana es visible en el video en vivo, presione el botón "Limit 1" y un rectángulo rojo aparecerá en la hoja de ruta. A continuación, pasar a la etapa de xy a la esquina opuesta y presione el botón "límite 2". Presione el botón de "scan" para crear una imagen de mapa de ruta de la membrana y los tejidos dentro de los límites del sistema.</li>
	<li>Haga doble clic en cerca de la TM de una de las secciones del ojo dentro de la hoja de ruta, la TM puede ser localizado cerca del vértice del ángulo iridocorneal (figura 5A). Una vez que la TM ha sido identificado, incrementar la magnificación 10 X y manualmente en el TM. Repetir con 20 X y 40 X objetivos. Cuando el TM está en foco con el objetivo 40 X (figura 5B), navegar en una zona en blanco cercana (enfoque puede necesitar ajustarse ligeramente), selecciona la "herramienta de dibujo a mano alzada" y trace una línea larga en un área en blanco de tejido.</li>
	<li>Configure los parámetros de láser para que la "velocidad de corte" es 34%, "focus" es del 58%, y "poder" es el 70% (figura 4), luego presione el botón "cortar". Hacer ajustes finos láser a la velocidad, foco y parámetros de la energía hasta una línea de corte claro y fino se observa (véase figura 5). Para un corte preciso, garantizar una acción de corte sigue la línea dibujada.</li>
	<li>La tapa de tubo de aislamiento de la carga en el soporte de la tapa y abrir el tubo. Instale el soporte del casquillo a la elevación de tapa y asegúrese de que el tubo se invierte. Asegurar que el material adhesivo de la tapa sobresale más allá de la punta de la PAC para asegurar que el tejido deseado es capturado correctamente.</li>
	<li>Seleccione el modo "Manual" de disección en el panel de software. Revisar cuidadosamente que el TM (figura 5B) es directamente debajo del tubo de aislamiento. El balance de blancos y ajuste de brillo para adquirir la calidad de imagen óptima (figura 4).</li>
	<li>Para empezar a cortar, manualmente ajustar el enfoque y dibujar una línea usando la herramienta a mano alzada, asegúrese de que la tapa de la colección permanece en la posición hacia arriba sin tocar la membrana. Dibujar círculos parciales cerca de donde la TM se une con la esclerótica (figura 5), luego presione "corte." Se hacen los primeros cortes, coloque la tapa en la posición hacia abajo y vuelva a ajustar el enfoque, y luego dibujar dos líneas en el espacio abierto o libre para conectar los dos círculos parciales completando el círculo alrededor de la TM, y luego pulse "cortar" y recoger el tejido de la sección , asegúrese de que la TM fue recogido por el microdissection tapón (Figura 5 D-F).</li>
	<li>Coloque la tapa en la posición hacia arriba y repita el procedimiento (5.2-5.8) en las secciones restantes. Ligeramente ajustar la posición de la tapa para que todas las muestras aisladas se encaja en la tapa y no se solapan (figura 5). Para la consistencia, la ventana de tiempo para una diapositiva es uso menos secciones por mascota deslizarán si se necesita más tiempo para aislar TM de todas las secciones de 20 minutos. Para la siguiente membrana de PET, inserte un nuevo tubo de aislamiento y repita la sección 5.</li>
</ol>6. lisis del tejido de Microdissected TM
<ol><li>Recién preparar buffer de lisis de RNA a lisar tejido LCM aislado. Añadir 10 μl de β-mercaptoetanol a cada 1 mL de la solución de lisis. Almacenar el buffer de lisis con β-mercaptoetanol a temperatura ambiente durante no más de 1 mes.</li>
	<li>Retire el tubo de aislamiento del soporte de la tapa dentro de 20 minutos desde el inicio de la microdisección. Visualizar la superficie de la tapa por el ojo para la captura de TM.</li>
	<li>Cuidadosamente pipetee 10 μl de tampón de lisis en la tapa del tubo de la colección asegurando el tampón de lisis cubre completamente el microdissected TM. Cierre adhesivo tapa e incubar el tubo de recogida de boca abajo a temperatura ambiente durante 10 minutos. Después de la incubación, Centrifugue a 800 x g durante 2 min y coloque el lisado en hielo seco. Almacenar lisados a-80 ° C para su posterior purificación y análisis.</li>
</ol>7. ARN aislamiento y análisis de calidad
<ol><li>Analizar la calidad del RNA por la descongelación de las muestras a temperatura ambiente. Piscina junto todas las muestras aislaron de un solo ratón en tubo de microcentrífuga de 1,5 mL libre de Rnasa uno. Nota: por ejemplo, para cada repetición biológica, tubos de 10-12 con microdissected en 10 μl lisado se generaron y los lisados fueron transferidos en un solo tubo para cada repetición biológica (100-120 μl lisado).</li>
	<li>Añadir un volumen de etanol al 70% recién preparada (hecha con agua libre de ARNasa) a cada solución lisado. Entonces, purificar RNA total siguiendo las directrices de usuario de kit de aislamiento de RNA. Asegurar la extracción de ADN genómico de cada muestra de RNA. Nota: ADN genómico puede interferir con los posteriores análisis de ARN.</li>
	<li>Medir la calidad de ARN aislado de lo TM a las muestras de cada ratón y analizar la integridad del ARN ribosómico (figura 6A). Nota: Debido al pequeño tamaño de TM, ARN ribosómico picos pueden no ser observable (Figura 6B) sobre el perfil de calidad de RNA (dos picos observados entre 1.000-4.000 bp en la figura 6A, C) que se utiliza para calcular el número de integridad del RNA (RIN) 47.<ol>
<li>Obtener una medida más precisa de la integridad del RNA por aislar RNA el tejido restante más abundante en la diapositiva de la membrana. Para obtener un representante RIN, RNA aislado del tejido ocular en la diapositiva de la membrana por Pipetear 10 μl lisis de búfer en la sección de un tejido y realizar aislamiento de RNA. Analizar calidad de RNA y calcular RIN (figura 6).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Para aplicaciones posteriores de RNA, uso un kit de RNA entrado baja para la generación de la secuencia y del cDNA biblioteca ceder reproducibles los resultados de tan poco como 80 secciones de LCM aislado TM.</li>
</ol>8. Análisis
<ol><li>Para comprobar que el tejido recogido de hecho está enriquecido en genes asociados TM, recopila varias RNA adicional de microdissected todo ojo, esclerótica, iris, retina, córnea y lente de 3 ratones separados. Uso de que este ARN en combinación con LCM recogidos ARN aislado TM y el cuerpo ciliar de ratones separados 4.</li>
	<li>Convertir que el RNA de las muestras de microdissected fue a cDNA usando un kit de transcripción inversa de cDNA. Amplificación del RNA de las muestras aislada de LCM y convertir a cDNA mediante una entrada baja RNA a cDNA kit.</li>
	<li>Analizar todas las RNA para malla trabecular expresando genes, myocilin (MYOC) y alfa-actina-2 (ACTA2) y normalizar usando el gene del servicio de limpieza HSP90a1 por PCR digital (Figura 7A-B).</li>
</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

El TM desempeña un papel vital en mantener activamente IOP homeostático y su disfunción es ampliamente aceptado como el principal factor causal para hipertensos glaucoma1,2,19. Un número de polimorfismos de nucleótido único en genes varios identificados por análisis GWAS se han relacionado con riesgo de glaucoma aumento y aumento de la resistencia al centro de la salida AH en el TM; sin embargo, los mecanismos moleculares precis...

El glaucoma es un grupo de enfermedades caracterizado por neuropatía óptica y retinopatía que en última instancia conduce a la ceguera irreversible1,2. Se estima que para 2020 más 70 millones de personas en todo el mundo estarán viviendo con algún tipo de enfermedad3,4,5,6,7. Glaucoma primario de ángulo abierto (GPAA), el tipo más frecuente de glaucoma, se caracteriza por una disminución en la salida de humor acuoso (AH) conduce a aumento de la presión intraocular (IOP)8,9,10, 11,12,13,143,15,16,17,18. Pio sin tratamiento, crónicamente elevada izquierda conduce a daño progresivo e irreversible de la retina y cabeza del nervio óptico causando ceguera radial1,2,19. Todos los métodos actuales para frenar la progresión del foco de glaucoma en la reducción de Pio, ya sea por disminución de la tasa de producción de AH por el cuerpo ciliar o mejorando su salida1,8,9, 10 , 11 , 12 , 13 , 14. la malla trabecular (TM) juega un papel vital en la regulación activa de la principal vía de salida AH y su función inadecuada es un factor causativo para hipertensos glaucoma1,2,19. Sin embargo, los mecanismos moleculares asociados con la disfunción TM y cómo regula AH drenaje no se entienden todavía completamente y es actualmente un foco importante de glaucoma investigación1,2,19, 20. aunque varios estudios de Asociación de genoma completo (GWAS) han vinculado un número de genes para glaucoma y mayor resistencia a la instalación de la salida AH en el TM, los mecanismos moleculares exactos que conducen a la enfermedad no entienden todavía completamente21 , 22 , 23 , 24 , 25.
Modelos animales han mejorado considerablemente nuestros conocimientos actuales de progresión de la enfermedad de glaucoma (examinado exhaustivamente en3,15,16,26,27,28, 29,30,31,32,33). Se han desarrollado varios métodos pioneros para estudiar el TM34,35,36 y estos métodos se han utilizado ampliamente para avanzar en nuestra comprensión actual del tejido normal y enfermo. Un área que no ha sido explorado extensivamente es el uso de modelos de ratón modificados genéticamente para estudiar los mecanismos moleculares de la insuficiencia de TM. Transgénico knock-in y los estudios con ratones knock-out de genes TM asociado, tales como Myocilin (Myoc)37,38 y39de la Cyp1b1, han sido las herramientas principales para el estudio de los mecanismos moleculares de TM función. Lógicamente, el tamaño pequeño de la TM en ratones representa un serio obstáculo que debe superar para comenzar a estudiar este tejido. Modelos de ratón representan una poderosa herramienta para el estudio de la genética y mecanismos moleculares de la enfermedad, mientras que los avances en las tecnologías de LCM proporcionan las herramientas necesarias para potenciar el estudio de los tejidos más pequeños y más delicados, como el TM.
En este informe, se describe un método reproducible y robusto para el LCM de TM altamente enriquecido de ojos de ratón y posterior aislamiento de RNA, amplificación para análisis de aguas abajo de la expresión. Métodos similares han sido utilizados con éxito en ratones para aislar otros tipos de ojos tejidos40,41,42,43,44, la metodología que se divulga adjunto puede aplicarse a otros tejidos discretos del ojo para el estudio de RNA, microRNA, ADN y proteínas. Lo importante, esta técnica permite el uso de ratones modificados genéticamente para entender mejor la patogenia molecular de la deficiencia de la TM en glaucoma y enfermedad ocular3,15,16,17 ,18,26,31,45,46. La capacidad de aislar la TM de ojos de ratón por LCM será una técnica útil en la obtención de más conocimientos sobre los mecanismos moleculares de varias enfermedades oculares.

<table><tbody><tr><td>Imprimaciones ACTA2 ddPCR (dMmuCPE5117282)</td><td>BioRad</td><td>10031252</td><td>FAM</td></tr><tr><td>Agilent 2100 Bioanalyzer</td><td>Agilent Technologies</td><td>G2946-90004</td><td></td></tr><tr><td>Agilent RNA 6000 Pico kit</td><td>Agilent Technologies</td><td>5067-1513</td><td></td></tr><tr><td>BioRad QX200 Sistema de PCR Digital de Gotas</td><td>BioRad</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pincel pequeño</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Portaobjetos de microscopio de vidrio cargado</td><td>Thermo scientific</td><td>4951PLUS-001</td><td></td></tr><tr><td>Cresyl Acetato violeta Sigma</td><td>Aldrich</td><td>C5042</td><td></td></tr><tr><td>Tijeras curvas</td> Eosina Y dye Thermo scientific 71204 Pinzas <td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td> de etanol Punta curva y dentada (tamaño de punta preferido: 0,5 x 0,4 mm)<td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>HemaCen</td><td>American MasterTech</td><td>STHEM30</td><td></td></tr><tr><td>kit de transcripción inversa de ADNc de alta capacidad</td><td>Applied Biosystems</td><td>4368814</td><td></td></tr><tr><td>Hsp90a ddPCR Primers(dMmuCPE5097465)</td><td>BioRad</td><td>10031255</td><td>VEX</td></tr><tr><td>Criostato Leica CM1850 Unidad</td> de filtro <td>Leica</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Millex-GS</td><td>EMD Millipore</td><td>SLGS033SB</td><td>0.22 y micro; m</td></tr><tr><td>MMI CellCut Modelo de corte UV</td><td>Máquinas moleculares & Industrias</td><td></td><td>Instrumento LCM</td></tr><tr><td>MMI CellTools Software</td><td>Máquinas Moleculares & Industrias</td><td>50202</td> Tubo de muestra del <td>software LCM</td></tr><tr><td>para microdisección de captura láser</td> Productos <td>ASEE ST-LMD-M-500 Tubo de</td><td>tapa de aislamiento / Fabricado por Microdissect GmBH en Alemania y distribuido por Productos ASEE Tubo</td><td></td></tr> de <tr><td>muestra para microdisección de captura láser (alternativa)</td><td>Máquinas moleculares & Industrias</td><td></td><td></td></tr><tr><td>modificadas Harris Hematoxylin</td><td>Thermo scientific</td><td>7211</td><td>FAM</td></tr><tr><td>MYOC ddPCR Primers (dMmuCPE5095712)</td><td>BioRad</td><td>10031252</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Memebrane Slides, sin RNasa</td><td>Productos ASEE</td><td>FS-LMD-M-M-50r</td><td>Membrana de tereftalato de polietileno (PET)/Fabricada por Microdissect GmBH en Alemania y distribuida por Productos ASEE</td></tr><tr><td>Portaobjetos Memebrane, Máquinas Moleculares Libres de ARNasa (Alternativas)</td> <td>& Industrias</td><td>50102</td><td></td></tr><tr><td>Rapid Fix</td><td>Thermo scientific</td><td>6764212</td><td>H& Tinción E</td></tr><tr><td>Tampón RLT</td><td>Qiagen</td><td>79216</td><td>Bufffer de lisis utilizado para muestras de LCM</td></tr><tr>Solución de descontaminación de<td>RNAseZap</td><td>Sigma</td><td>R2020</td><td></td></tr><tr><td>Protect RNA Inhibidor de ARNasa</td><td>Sigma Aldrich</td><td>R7397</td><td></td></tr><tr><td>RNeasy Micro Kit</td><td>Qiagen</td><td>74004</td><td>Kit de aislamiento de ARN</td></tr><tr><td>SMART-Seq v4 Kit de ARN de entrada ultra baja</td><td>Takara Clontech</td><td>634888</td><td>kit de ARN a ADNc de baja entrada para muestras LCM</td></tr><tr><td>SuperMix (no dUTP)</td><td>BioRad</td><td>1863023</td><td>mezcla maestra de PCR digital</td></tr><tr><td>Tissue-Tek Cryomold (25 mm x 20 mm x5 mm)</td><td>Sakura</td><td>4557</td><td></td></tr><tr><td>Compuesto Tissue-Tek O.C.T.</td><td>Sakura</td><td>4583</td><td></td></tr><tr><td>Stratalinker Reticulante UV</td><td>Stratagene</td><td>400075</td><td></td></tr><tr><td>Xileno</td><td>Macron</td><td>8668</td><td></td></tr></tbody></table>

microdissection de la captura del laser de la malla trabecular muy pura de ojos de ratón para análisis de expresión génica

Laser Capture Microdissection of Highly Pure Trabecular Meshwork from Mouse Eyes for Gene Expression Analysis

Microdissection de la captura del laser (LCM) ha permitido el análisis de expresión génica de las células y enriquecido las poblaciones de la célula en secciones del tejido. LCM es una gran herramienta para el estudio de los mecanismos moleculares subyacentes de la diferenciación celular y el desarrollo y progresión de varias enfermedades, incluyendo el glaucoma. El glaucoma, que comprende una familia de neuropatías ópticas progresivas, es la causa más común de ceguera irreversible en todo el mundo. Cambios estructurales y daños en la malla trabecular (TM) pueden resultar en aumento presión intraocular (PIO), que es un factor de riesgo para desarrollar glaucoma. Sin embargo, los mecanismos moleculares precisos involucrados son todavía poco conocidos. La capacidad para realizar análisis de expresión génica será crucial en la obtención de más conocimientos sobre la función de estas células y su papel en la regulación del desarrollo IOP y glaucoma. Para lograr esto, un método reproducible para aislar altamente enriquecido TM de secciones congeladas de ojos de ratón y un método para el análisis de la expresión del gen aguas abajo, tales como RT-qPCR y RNA-Seq es necesario. El método descrito en el presente documento es desarrollado para aislar TM muy puro de ojos de ratón para posterior PCR digital y análisis de microarrays. Además, esta técnica puede adaptarse fácilmente para el aislamiento de las células oculares muy enriquecidas y compartimentos celulares que han sido difíciles de aislar de ojos de ratón. La combinación de análisis LCM y el ARN puede contribuir a una comprensión más completa de los eventos celulares subyacentes glaucoma.

LCM recogió RNA de la TM y del cuerpo ciliar de 4 ratones diferentes fue aislado para poder analizar la expresión génica y comparar la expresión con en todo ojo, esclerótica, iris, retina, córnea y lentes aisladas de tres ratones separados. TM expresando genes MYOC48 ACTA249 analizaron y en todos los tejidos recogidos para confirmar que las muestras aisladas de TM eran de hecho altamente enriquecidas en TM. Debido a la extr...

Aquí, describimos un protocolo para un microdissection de la captura del laser reproducible (LCM) para aislar la red trabecular (TM) para posteriores análisis de ARN. La capacidad de analizar los cambios en la expresión génica en el TM ayudarán en la comprensión de los mecanismos moleculares subyacentes de enfermedades oculares relacionadas con la TM.

Microdissection de la captura del laser de la malla Trabecular muy pura de ojos de ratón para análisis de expresión génica

Laser capture microdissection (LCM) has allowed gene expression analysis of single cells and enriched cell populations in tissue sections. LCM is a great ...

El objetivo general de este procedimiento de microdisección láser es desarrollar un método robusto y reproducible para el aislamiento de una malla trabecular altamente enriquecida de los ojos de ratón utilizando microscopía de captura láser para el posterior aislamiento de ARN y el análisis de expresión posterior. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la oftalmología, como cuáles son los genes importantes y las vías de señalización que, cuando se regulan mal, pueden provocar enfermedades oculares. La principal ventaja de esta técnica es que el ARN de alta calidad de la malla trabecular de los ojos de ratón puede aislarse de forma reproducible para el análisis de la expresión génica.Por lo general, las personas nuevas en este método tendrán dificultades porque la microdisección láser es una técnica poderosa que implica varios pasos de solución de problemas a lo largo de todo el protocolo. Comience este procedimiento con una recolección óptima de tejido para la microdisección láser como se describe en el protocolo de texto. Rocíe la solución de descontaminación de RNasa en el cepillo, las pinzas, los frascos de acoplamiento y el mandril de montaje.Despué

laser-capture-microdissection-highly-pure-trabecular-meshwork-from

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Investigación

JoVE Journal

Biology

Biología

Láser microdisección de captura de tejidos de mamíferos

Microdisección láser se aplicó para analizar perfiles de expresión génica en compartimentos específicos de Drosophila disco ala sometida a localizado...

Microdisección láser aplicada a perfiles de expresión génica de subconjunto de las células de la Drosophila Ala Disco

El perfilado de la expresión de ARN en regiones cerebrales discretas del ratón requiere una estrategia precisa y reproducible de recolección de tejido. Aquí se describe un protocolo que utiliza tanto la sección coronal del cerebro como la microdisección asistida por punzón tisular. El rendimiento y la calidad del ARN total obtenido a partir de las muestras resultantes confirman la utilidad del método descrito.

Sin láser y de captura de enfoque de Microscopía de la microdisección de regiones discretas del cerebro del ratón para el aislamiento de ARN total y Downstream secuenciación de próxima generación y de perfiles de expresión génica

Se describe cómo utilizar la microdisección de captura por láser (LCM) para obtener poblaciones enriquecidas de las neuronas del hipocampo o neuronas individuales de las secciones congeladas del cerebro de rata lesionado para el posterior análisis de expresión génica usando PCR en tiempo real cuantitativa y / o microarrays de todo el genoma.

Captura de microdisección láser poblaciones enriquecidas de neuronas o neuronas individuales para análisis de expresión génica después de una lesión cerebral traumática

En este artículo describimos los principios para diseñar y realizar un experimento de trazado de linaje multicolor utilizando ratones R26R-Confetti. Proporcionamos un protocolo específico para el seguimiento de las células epiteliales de la córnea que puede ser modificado para otros tejidos de interés.

Un método para Lineage Tracing de células corneales Uso de Multi-color de los ratones reportero fluorescente

Se desarrolló un protocolo de microdisección de captura láser (LCM) para obtener una cantidad suficiente de ARN de alta calidad para el análisis de la expresión génica en células óseas. El estudio actual se centra en las secciones del fémur del ratón. Sin embargo, el protocolo LCM reportado aquí se puede utilizar para estudiar la expresión génica en células de cualquier tejido duro.

Un protocolo de microdisección de captura láser que produce ARN de alta calidad a partir de huesos de ratón congelados

Este protocolo describe la microdisección de captura láser para el aislamiento del cartílago y el hueso de las secciones congeladas frescas del embrión del ratón. El cartílago y el hueso se pueden visualizar rápidamente mediante la tinción violeta de cresíl y se recogen con precisión para producir ARN de alta calidad para el análisis transcriptómico.

Microdisección de captura láser de cartílago embrionario de ratón y hueso para análisis de expresión génica

Aquí se presenta una plataforma microscópica multifoto para imágenes de superficie ocular de ratón en vivo. El ratón fluorescente transgénico permite la visualización de núcleos celulares, membranas celulares, fibras nerviosas y capilares dentro de la superficie ocular. Las señales no lineales de segunda generación armónica derivadas de estructuras de collagenounous proporcionan imágenes sin etiquetas para arquitecturas estromales.

Una plataforma de microscopía multifoto personalizada para imágenes en vivo de cornea de ratón y conjuntiva

Este artículo presenta un protocolo para la microdisección ocular en roedores. El proceso implica la enucleación del globo ocular junto con la membrana nictitante (es decir, el tercer párpado). Esto es seguido por la separación de las copas oculares posterior y anterior.

Microdisección del ojo de roedor

Este protocolo detalla la separación del epitelio del cristalino ocular del ratón y la masa a granel de las células de fibra, seguida del aislamiento de ARN y el análisis de qPCR. Este método permite separar los compartimentos de las células del cristalino para un análisis más detallado del transcriptoma y los procesos biológicos en las células epiteliales frente a las células de fibra diferenciadas.

Aislamiento de ARN del epitelio del cristalino ocular de ratón y masas masivas de células de fibra

Aprende microdissección láser para aislar la malla trabecular de ojos de ratón con alta pureza. Este método permite obtener ARN de calidad para análisis de expresión génica en estudios oftalmológicos.

Microdissection de la captura del laser de la malla Trabecular muy pura de ojos de ratón para análisis de expresión génica

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