Microdissection de la captura del laser de la malla Trabecular muy pura de ojos de ratón para análisis de expresión génica

El objetivo general de este procedimiento de microdisección láser es desarrollar un método robusto y reproducible para el aislamiento de una malla trabecular altamente enriquecida de los ojos de ratón utilizando microscopía de captura láser para el posterior aislamiento de ARN y el análisis de expresión posterior. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la oftalmología, como cuáles son los genes importantes y las vías de señalización que, cuando se regulan mal, pueden provocar enfermedades oculares. La principal ventaja de esta técnica es que el ARN de alta calidad de la malla trabecular de los ojos de ratón puede aislarse de forma reproducible para el análisis de la expresión génica.

Por lo general, las personas nuevas en este método tendrán dificultades porque la microdisección láser es una técnica poderosa que implica varios pasos de solución de problemas a lo largo de todo el protocolo. Comience este procedimiento con una recolección óptima de tejido para la microdisección láser como se describe en el protocolo de texto. Rocíe la solución de descontaminación de RNasa en el cepillo, las pinzas, los frascos de acoplamiento y el mandril de montaje.

Después de limpiar a fondo, enjuague el aparato con agua sin nucleasas y séquelo. Limpie el criostato con etanol al 100% para evitar la contaminación cruzada. Exprima una pequeña cantidad de O.C.T. en el mandril de montaje, luego retire el bloque de pañuelo del molde y coloque con cuidado el bloque en el mandril de montaje.

Una vez que el bloque de tejido en el mandril de montaje esté congelado, insértelo en el soporte de muestras del criostato. A continuación, ajuste el criostato para cortar secciones de ocho micras y seccione con cuidado a través del bloque O.C.T. para llegar a la muestra de tejido. Una vez observado el tejido, se debe dejar de cortar.

Recorte los bloques congelados por todos lados con una cuchilla de afeitar limpia y deje de tres a cuatro milímetros de O.C.T. alrededor del pañuelo para permitir su manipulación con el pincel. Corte a través del ojo, trabajando rápidamente. Tiñe cada tercera sección inundando el portaobjetos con una tinción rápida de H&E de un solo paso durante 60 segundos.

Enjuague la sección con agua del grifo y séquela al aire. Después de limpiar la sección con un agente de limpieza, monte la sección en un portaobjetos de vidrio cargado con un cubreobjetos, revíselo bajo el microscopio. Continúe seccionando hasta que la TM se haga evidente en las secciones manchadas.

Una vez que la TM comience a aparecer, corte dos secciones y móntelas en un portaobjetos de vidrio cargado para la tinción de H&E de rutina para formar un mapa para cortar con microdisección de captura láser. Después del primer portaobjetos de mapas de H&E, corte y alinee seis secciones en serie de ocho micras de espesor en el criostato y móntelas simultáneamente en el portaobjetos de membrana de PET. Adherir el tejido deslizando brevemente un pulgar enguantado a lo largo de la parte posterior de la membrana.

Después del montaje, coloque el portaobjetos de membrana de PET inmediatamente en una caja de portaobjetos sobre hielo seco. Continúe seccionando el ojo. Después de cada dos portaobjetos de membrana PET con seis secciones cada uno, recoja dos secciones en un portaobjetos de vidrio cargado para crear otro portaobjetos de mapa para la tinción de H&E.

Continúe seccionando aproximadamente 100 secciones en serie de ocho micras de espesor hasta que la TM ya no sea visible. Confirme la falta de TM tiñendo rápidamente una sección en un portaobjetos de vidrio cargado. Después de realizar la tinción de portaobjetos de mapa de H&E como se describe en el protocolo de texto, revise visualmente los portaobjetos de H&E con un microscopio.

Identifique las diapositivas de mapa con TM claramente visibles y accesibles para cortar. Utilice las diapositivas de membrana de PET entre estas diapositivas de mapa para LCM. Retire la caja de portaobjetos que contiene las secciones de papel congelado del congelador a -80 grados centígrados y colóquela sobre hielo seco.

Procese las diapositivas de una en una. Fije las secciones colocando el portaobjetos inmediatamente en inhibidores fríos que contengan etanol al 75% durante 30 segundos. Sumerja suavemente el portaobjetos en agua sin nucleasas durante 10 a 15 segundos para disolver el OCT sin interferir con las secciones de tejido.

Pipetear cuidadosamente 300 microlitros de solución de acetato violeta de cresilo al 1,5% directamente sobre las secciones e incubar durante 45 segundos a temperatura ambiente. A continuación, lave las secciones una vez colocándolas en un baño de etanol al 75% durante 30 segundos. Pipetear 200 microlitros de solución de eosina Y en las secciones e incubar durante tres a cinco segundos.

Deshidratar el tejido colocando los portaobjetos posteriormente en etanol al 75%, etanol al 95% y, finalmente, en un baño de etanol al 100% durante 30 segundos cada uno. Seca el extremo del portaobjetos con una toallita de papel entre cada paso para eliminar el exceso de líquido. Deje que la corredera se seque completamente al aire debajo del capó durante cinco minutos.

Una vez seco, realice el LCM inmediatamente después. Evite el uso de xileno para el último paso de limpieza. El tratamiento con xileno hará que la sección de tejido se monte inadecuadamente en el portaobjetos de la membrana.

El xileno también reducirá la eficiencia de la captura de tejidos por LCM. Coloque el portaobjetos de membrana PET con el lado del tejido teñido hacia abajo, directamente sobre la parte superior de un nuevo portaobjetos de vidrio que se haya cargado en la platina del microscopio. Asegúrese de que la membrana y el portaobjetos de vidrio estén bien emparejados en la platina del microscopio.

Inicie LCM estableciendo primero los límites de deslizamiento. Elija el aumento 4X más bajo en el panel Objetivo y, a continuación, defina el área de trabajo del portaobjetos de membrana moviendo la platina XY del microscopio hasta que la esquina superior izquierda, donde se unen el metal y la membrana, sea visible en la transmisión de vídeo en directo. En este punto, presione el botón Límite 1 y aparecerá un rectángulo rojo en el mapa de carreteras.

A continuación, mueva la etapa XY a la esquina opuesta y presione el botón Límite 2. Presione el botón Escanear para crear una imagen de mapa de ruta de la membrana y los tejidos entre los límites establecidos. Haga doble clic cerca de la TM de una de las secciones del ojo dentro del mapa de ruta.

La MT se puede localizar cerca del vértice del ángulo iridocorneal. Una vez que se haya identificado la TM, aumente el aumento a 10X y concéntrese manualmente en la TM. Repite con objetivos de 20X y 40X. Cuando la TM esté enfocada con el objetivo 40X, navegue hasta un área en blanco, seleccione la herramienta de dibujo a mano alzada y dibuje una línea larga en un área en blanco de tejido.

Configure los parámetros del láser para que la velocidad de corte sea del 34%, el enfoque sea del 58% y la potencia sea del 70% y luego presione el botón Cortar. Realice ajustes láser finos en los parámetros de velocidad, enfoque y potencia hasta que se observe una línea de corte clara y fina. Para un corte preciso, asegúrese de que la acción de corte siga la línea dibujada.

A continuación, cargue la tapa del tubo de aislamiento en el soporte de la tapa y abra el tubo. Coloque el soporte de la tapa en el elevador de la tapa y asegúrese de que el tubo esté invertido. También asegúrese de que el material de la tapa adhesiva sobresalga más allá de la punta de la tapa para garantizar que el tejido deseado se capture correctamente.

Es fundamental asegurarse visualmente de que la malla trabecular se recoja y se fije a la tapa de aislamiento. Seleccione el modo de disección manual en el panel del software. Revise cuidadosamente que el TM esté directamente debajo del tubo de aislamiento.

Establezca el balance de blancos y ajuste el brillo para obtener una calidad de imagen óptima. Para comenzar a cortar, ajuste manualmente el enfoque y dibuje una línea con la herramienta a mano alzada. Asegúrese de que la tapa de recolección permanezca en la posición hacia arriba, sin tocar aún la membrana.

Dibuje círculos parciales cerca de donde la TM se encuentra con la esclerótica y presione Cortar. Una vez realizados los primeros cortes, coloque la tapa en la posición hacia abajo y reajuste el enfoque, luego dibuje dos líneas en el espacio abierto o libre para conectar los dos círculos parciales, completando el círculo alrededor de la TM. A continuación, pulse Cortar y recoger el tejido de la sección. Asegúrese de que la TM haya sido recogida por el tapón de microdisección.

Vuelva a colocar la tapa en la posición hacia arriba y repita en las secciones restantes. Ajuste ligeramente la posición de la tapa para que todas las muestras aisladas quepan en la tapa y no se superpongan. Para la siguiente membrana de PET, inserte un nuevo tubo de aislamiento y repita esta sección.

Para realizar la lisis del tejido de MT microdisecado, pipetee cuidadosamente 10 microlitros de tampón de lisis en la tapa del tubo de recolección, asegurándose de que el tampón de lisis cubra completamente la MT microdisecada. Cierre suavemente la tapa adhesiva e incube el tubo de recolección boca abajo a temperatura ambiente durante 10 minutos. Después de la incubación, centrifugar a 800 g durante dos minutos y colocar el lisado sobre hielo seco. Almacene los lisados a -80 grados centígrados para su posterior purificación y análisis.

La degradación rápida del ARN puede afectar al análisis de ARN posterior. La calidad del ARN debe medirse y cuantificarse utilizando una plataforma basada en microfluídica. Aquí se muestran los resultados representativos del análisis de expresión génica del ARN total de alta calidad purificado a partir de la malla trabecular.

El gel digital para el ARN total restante del tejido ocular después de la microdisección láser muestra un alto número de integridad de ARN, que es necesario para el análisis posterior del ARN. Una vez que se extrae el ARN de calidad del tejido, se pueden realizar análisis posteriores como microarrays, RNA-Seq y qPCR. En este caso, se utilizó el análisis cuantitativo de PCR digital para analizar la expresión de los genes asociados a la malla trabecular, la miocilina y el ACTA2 a partir del ARN recogido por LCM.

El mapa de calor generado a partir de los datos obtenidos del análisis de microarrays ilustra que esta técnica puede utilizarse para comprender los cambios en la expresión génica en la malla trabecular de ratones de tipo salvaje y ratones knockout con un fenotipo de IOP elevado. Una vez dominada, esta técnica se puede realizar en tan solo un día por animal biológico si se hace correctamente. La demostración visual de este método es esencial, ya que los pasos de la microdisección láser son difíciles de aprender debido a la dificultad de la visualización de las células de interés y la ausencia de estándares para estas muestras únicas.

Confiar en el operador calificado es fundamental. Al intentar este procedimiento, es importante recordar que el ARN en pequeñas cantidades de tejido puede degradarse rápidamente. Se deben tomar precauciones como descontaminar el equipo de RNasa, minimizar la exposición al aire y mantener los tejidos fríos.

Aunque este método puede proporcionar información sobre los efectos del aumento de la presión intraocular en la expresión génica específica de la malla trabecular, también se puede aplicar a otros sistemas, como la evaluación de los cambios en la expresión génica en la retina causados por el aumento de la presión intraocular. Siguiendo este procedimiento, se pueden realizar otros métodos como RNA-Seq o micro-array para responder a preguntas adicionales como qué vías de señalización están alteradas en la malla trabecular de ratones con presión intraocular elevada. Después de su desarrollo, esta técnica allanó el camino para que los investigadores estudiaran de manera más efectiva los cambios en la expresión génica en la malla trabecular en modelos de ratón.