Análisis molecular de transición endotelio-mesénquima inducida por transformación de señalización del Factor de crecimiento β

Este método puede ayudar a responder preguntas clave en los campos de la biología vascular y del cáncer, como los mecanismos de plasticidad endotelial en diversas condiciones patológicas, incluido el cáncer. La principal ventaja de esta técnica es que la inducción robusta de EndMT in vitro se logra mediante el tratamiento con TGF-en células endoteliales MS-1. En primer lugar, cultive las células MS-1 en condiciones de cultivo estándar y evite que el cultivo sea confluente.

A continuación, en un plato de 10 cm, lave las células MS-1 con solución salina tamponada con fosfato 1x. A continuación, añada 1 ml de tripsina a la placa e incube la placa a 37 grados centígrados durante cinco minutos. A continuación, añada 9 mL de medio de cultivo a las células tripsinizadas para su desprendimiento.

A continuación, recoja la suspensión celular tripsinizada en un tubo de 15 ml. Centrifugar la suspensión celular a 300 a 400 x G durante cinco minutos a temperatura ambiente. A continuación, utilice un contador automático de células para contar el número de células viables.

A continuación, coloque las células MS-1 en placas de cultivo estándar sin recubrimiento para el cultivo a largo plazo. Después de 24 horas, estimular las células endoteliales con una concentración final de 1 ng por mililitro de TGF-2. A continuación, incubar la placa de cultivo a 37 grados centígrados con un 5% de dióxido de carbono.

Después de 48 horas de tratamiento, reemplace el medio con un medio de cultivo fresco y precalentado que contenga TGF-2 Para el análisis posterior, coloque las células MS-1 en un portaobjetos de cámara de cultivo de 8 pocillos previamente recubierto con gelatina. Después de 24 horas, añadir 10 M de inhibidor de ROCK al cultivo celular. Después de una hora, estimular las células endoteliales con una concentración final de 1 ng por mililitro de TGF-2.

A continuación, incubar las células a 37 grados centígrados. Para un cultivo de 72 horas de duración, reemplace el medio antiguo con un medio fresco que contenga TGF-2 después de 48 horas. Después de un día entero de tratamiento con TGF, retire el medio.

A continuación, fije las células con un 4% de paraformaldehído y solución salina tamponada con fosfato durante 20 minutos a temperatura ambiente. Una vez finalizado el período de fijación, enjuague las células con solución salina tamponada con fosfato. A continuación, incubar las células con Triton X-100 al 0,2% durante cinco minutos a temperatura ambiente.

Después de cinco minutos, vuelva a enjuagar las células con solución salina tamponada con fosfato 1x tres veces. Después de tres lavados, incubar las células con falotoxina fluorescente diluida que contenga tampón bloqueante durante una hora a temperatura ambiente. Después de la incubación, lavar las células con solución salina tamponada con fosfato 1x, tres veces.

A continuación, tiñe los núcleos celulares con un tinte de unión a ácido nucleico de cianina durante cinco minutos a temperatura ambiente. Después de cinco minutos, enjuague el portaobjetos y monte un cubreobjetos en el portaobjetos utilizando medios de montaje de portaobjetos. Observe las células bajo un microscopio confocal.

Las células muestran una reorganización de las fibras gruesas de tensión tras el tratamiento con TGF-2. Esto indica la potencia del TGF-2 en la inducción de EndMT en las células endoteliales. Después de 72 horas de tratamiento con TGF-2, deseche el medio y fije las células con 0,5 a 1 ml de metanol frío al 50% y acetona al 50% durante cinco minutos.

A continuación, enjuague las células con solución salina tamponada con fosfato 1x, tres veces. Una vez completados los tres lavados, incube las células con anticuerpos primarios en un tampón de bloqueo durante la noche a 4 grados centígrados, en la oscuridad. Al día siguiente, vuelva a lavar las células con solución salina tamponada con fosfato 1x, tres veces.

A continuación, incubar las células con un anticuerpo secundario conjugado con colorante verde contra la VE-cadherina en tampón de bloqueo, durante una hora en la oscuridad. Vuelva a lavar las células con solución salina tamponada con fosfato 1x, tres veces. A continuación, tiñe los núcleos celulares con un tinte de unión a ácido nucleico de cianina durante cinco minutos a temperatura ambiente.

Después de cinco minutos, enjuague la corredera y monte un cubreobjetos en la corredera utilizando un medio de montaje de la corredera. A continuación, observe las células bajo un microscopio confocal. Las células muestran una disminución de la expresión de VE-cadherina y un aumento de la expresión de actina del músculo liso tras el tratamiento con TGF-2 durante 48 a 72 horas.

Antes del ensayo de contracción del gel de colágeno, cultive las células MS-1 en presencia y ausencia de TGF-2 durante 72 horas. A continuación, prepara el gel de colágeno tipo 1 con hielo. A continuación, mezcle 800 l de la solución de gel de colágeno con 200 ml de células endoteliales controladas o tratadas con TGF-2.

A continuación, agregue 1 ml de esta mezcla a cada pocillo de una placa de cultivo de 12 pocillos. Deje que el gel se solidifique a 37 grados centígrados durante 30 a 60 minutos. Después de la solidificación del gel, agregue 1 mL de MEM Alpha, que contiene 10% de suero de ternera fetal, 50 unidades por mililitro de penicilina y 50 g por mililitro de estreptomicina, para hacer flotar el gel.

A continuación, separe el gel de la pared del pocillo e incube el gel flotante a 37 grados centígrados durante 48 horas. Después de 48 horas de incubación, escanee las imágenes del gel desde la parte inferior de la placa con un escáner. Son visibles distintos cambios morfológicos, que transforman las células de la arquitectura en forma de adoquín a la arquitectura en forma de huso mesenquimal debido a la exposición al tratamiento con TGF-2 durante 72 horas.

Curiosamente, el tratamiento con TGF beta 2 durante 48 a 72 horas muestra un aumento tanto en el ARNm como en los niveles de expresión proteica de la actina del músculo liso en las células MS-1. El ensayo de contracción del gel también muestra que tras el tratamiento con TGF-2, el gel de colágeno tipo 1 se contrae significativamente. Curiosamente, la privación de TGF-2 disminuye la actina del músculo liso a nivel basal y las células retoman la morfología de adoquín, lo que indica que EndMT es un proceso dinámico.

De hecho, la inhibición del microARN 31 por el inhibidor del microARN LNA utilizando las células MS-1, atenúa la inducción de marcadores mesenquimales. Sin embargo, el inhibidor no afecta a la inducción de genes diana de TGF como la fibronectina 1, PAI-1 y Smad 7. Seguir este procedimiento como un método como la expresión génica, el knockdown o la modulación de microarrays, se puede realizar para responder preguntas adicionales como la función específica de genes y microARN en EndMT.