Name: Análisis molecular de transición endotelio-mesénquima inducida por transformación de señalización del Factor de crecimiento β (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-08-03T13:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 49 s
Description: Aprende a inducir la transición endotelio-mesénquima en células MS-1 usando TGF-β2. Este protocolo permite analizar cambios morfológicos y moleculares, incluyendo la modulación de microRNAs, para estudiar mecanismos en biología vascular.

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Agradecemos Zea Borok y Kohei Miyazono sugerencias en la preparación del manuscrito. H.I.S. y M.H. son compatibles con la beca de investigación Fundación Uehara Memorial y H.I.S. es apoyada por Osamu Hayaishi Memorial Scholarship para estudio en el extranjero. Este trabajo fue apoyado por una beca de la Fundación de ciencia de Takeda (A.S.).

1. inducción de EndMT
<ol><li>Mantener las células MS-1 en condiciones de cultivo estándar y evitar la confluencia. Una fuente de células MS-1 se describe en la Tabla de materiales. Para las celdas de MS-1, usar medio-α mínimo esencial (MEM-α) con 10% de suero fetal de ternero (FCS), 50 U/mL de penicilina y 50 de μg/mL estreptomicina.</li>
	<li>Células de lavado MS-1 en 10 cm plato con 1 x de tampón fosfato salino (PBS) y añadir 1,0 mL de tripsina a la placa. Incubar por 5 min a 37 ° C.</li>
	<li>Separar las células con 9 mL de medio de cultivo. Recoger la suspensión de células en un tubo de 15 mL.</li>
	<li>Centrifugue la suspensión celular en 300-400 x g durante 5 min a temperatura ambiente.</li>
	<li>Cuidadosamente Quite el sobrenadante y suspender el precipitado de células en medios de cultivo precalentado.</li>
	<li>Contar las células viables usando la solución de azul de tripano y un hemocitómetro estándar o un contador celular automático.</li>
	<li>Células de la placa MS-1 en placas de cultivo estándar sin recubrimiento de 0.5 x 103 células por cm2 para el cultivo de término largo. Por ejemplo, células de3 placa de 5.0 x 10 por pozo en una 6 cultura bien la placa. Utilizar los mismos medios de cultivo incluyendo la misma concentración de FCS. En las células MS-1, TGF-β induce EndMT en cultura a largo plazo (al menos 48-72 h) con el uso de FCS.</li>
	<li>Estimulan las células endoteliales con TGF-β2 (una concentración final de 1 ng/mL) después de 24 h.</li>
	<li>Células en cultivo en una incubadora humidificada (5% CO2, 37 ° C). Supervisar diariamente las células cuando centrándose en cambios morfológicos.</li>
	<li>Sustituir los medios de comunicación con fresco con los medios de cultivo que contiene TGF-β2 después de 48 h de tratamiento con TGF-β en la cultura a largo plazo.</li>
	<li>Proceder a los análisis posteriores. Por lo general, reorganización de la actina se observa después de 24 h de tratamiento, y downregulation de marcadores endoteliales y upregulation de marcadores mesenquimales se observan después de 48-72 h de tratamiento con TGF-β.</li>
</ol>2. Análisis de Immunocytochemical
<ol><li>Mantener las células MS-1 en condiciones de cultivo estándar.</li>
	<li>Las células de la placa MS-1 a 4 células bien diapositivas cámara de cultura en 1.0 x 103 células por pocillo (1.7 cm2). Diapositivas se encuentran sensibilizadas con gelatina. Uso 0,5 – 1,0 mL de medios de cultivo por pozo.</li>
	<li>Estimulan las células endoteliales con TGF-β2 (una concentración final de 1 ng/mL) después de 24 h. Al analizar la participación de roca en EndMT, agregue a un antes de 1 h ROCK inhibidor de la Y-27632 (10 μM) para tratamiento de TGF-β. Al evaluar el efecto de la inhibición de señalización de TGF-β, pueden utilizarse inhibidores de quinasa del receptor de TGF-β.</li>
	<li>Células en cultivo en una incubadora humidificada (5% CO2, 37 ° C). Reorganización de la actina se observa en las células 1 MS después de 24 h de tratamiento con TGF-β. Otros los cambios se hacen evidentes después de 48-72 h de tratamiento. Para el cultivo de 72 h, sustituir los medios de comunicación con medio fresco que contiene TGF-β después de 48 h de tratamiento con TGF-β.</li>
	<li>
La coloración de la F-actina
	<ol>
<li>Después de 24 h de tratamiento TGF-β, eliminar los medios de comunicación, fijar las células con paraformaldehído al 4% en PBS 1 x por 20 min a temperatura ambiente y lavar las células con PBS 1 x.</li>
		<li>Incubar con 0,2% Tritón X-100 durante 5 minutos a temperatura ambiente.</li>
		<li>Lavar las células 3 veces con PBS 1 x.</li>
		<li>Incubar con phalloidin-tetramethylrhodamine B isotiocianato de phalloides de la Amanita 150-fold diluido con solución amortiguadora de bloqueo durante 1 hora a temperatura ambiente.</li>
		<li>Lavar las células 3 veces con PBS 1 x.</li>
		<li>Se tiñen los núcleos con tintes de unión del ácido nucleico de Cianina por 5 min a temperatura ambiente.</li>
		<li>Enjuague portaobjetos y cubreobjetos de Monte cara abajo sobre un portaobjetos utilizando medios de montaje de la diapositiva.</li>
		<li>Observar con un microscopio confocal. Usar láser 543 nm y un filtro de emisión de 560 – 615 nm para la detección de la fluorescencia de phalloidin. Uso de láser 633 nm y un filtro de emisión de más de 650 nm para la tinción nuclear. Sobre el tratamiento con TGF-β, se observaría la formación de fibras de estrés gruesa.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
VE-cadherina y la coloración de la α-SMA
	<ol>
<li>Después de 72 h de tratamiento TGF-β, eliminar los medios de comunicación, fijar las células con frío 50% de metanol y acetona al 50% (0.5 – 1.0 mL por pozo) durante 5 minutos.</li>
		<li>Lavar las células 3 veces con PBS 1 x (0.5 – 1.0 mL por pozo).</li>
		<li>Incubar con anticuerpos primarios en solución amortiguadora de bloqueo durante la noche a 4 ° C en la oscuridad según la concentración recomendada del fabricante. Uso de anticuerpo monoclonal de VE-cadherina (BV13, dilución 1: 100) y α-SMA Cy3-conjugado anticuerpo monoclonal (1A4, dilución 1: 200)20.</li>
		<li>Lavar las células 3 veces con PBS 1 x.</li>
		<li>Incubar las células con un anticuerpo secundario conjugado con tinte verde a VE-cadherina anticuerpo en solución amortiguadora de bloqueo durante 1 hora a temperatura ambiente en la oscuridad según la concentración recomendada del fabricante.</li>
		<li>Lavar las células 3 veces con PBS 1 x.</li>
		<li>Se tiñen los núcleos con tintes de unión del ácido nucleico de Cianina por 5 min a temperatura ambiente.</li>
		<li>Enjuague portaobjetos y cubreobjetos de Monte cara abajo sobre un portaobjetos utilizando medios de montaje de la diapositiva.</li>
		<li>Observar con un microscopio confocal. Utilizando láser 543 nm y un filtro de emisión de 560 – 615 nm para la detección de α-SMA (Cy3). Para la detección de VE-cadherina, utilice láser 488 nm y un filtro de emisión de 505-550 nm. Por lo general, sobre el tratamiento con el tratamiento de TGF-β, disminución de la VE-cadherina señales y se observaría un aumento en las señales de la α-SMA.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. ensayo de contracción de Gel de colágeno tridimensional
<ol><li>Realizar cultivo de células de 1 MS con o sin TGF-β durante 72 h antes del ensayo de contracción de gel de colágeno.</li>
	<li>Preparar el tipo gel de colágeno en el hielo. Mezclar solución de colágeno frío, 10 x concentrado MEM medio y tampón de dilución de colágeno que contiene 0,05 N NaOH, 2.2% de NaHCO3y 200 mM HEPES pH 7.4 un 8:1:1 ratio.</li>
	<li>Mezclar 200 mL de control o suspensiones de células endoteliales tratadas con TGF-β (1.0 x 106 células/200 μL) y 800 μl de la solución del gel de colágeno. Para TGF-β muestras tratadas, añadir TGF-β2 (1 ng/mL) a la suspensión de células.</li>
	<li>Añadir 1,0 mL de la mezcla a cada pozo de pozo de 12 placas y dejar para solidificar en la incubadora a 37 ° C durante 30 – 60 min.</li>
	<li>Después de la gelatinización, superposición de 1,0 mL de MEM-α que contiene 10% FCS, 50 U/mL de penicilina y estreptomicina 50 μg/mL para flotar el gel. Para TGF-β muestras tratadas, añadir TGF-β2 (1 ng/mL) a los medios de comunicación. Nota: Para las muestras tratada de TGF-β, agregar TGF-β en el gel y los medios de cultivo.</li>
	<li>Incubar los geles flotantes a 37 ° C durante 48 h.</li>
	<li>Escanear las imágenes de los geles de la parte inferior de las placas mediante un escáner. También puede grabar las imágenes de geles con una cámara digital a una distancia fija por encima de los geles.</li>
	<li>Cuantificar la superficie de gel basada en número de píxeles con ImageJ. Seleccione el gel utilizando una selección a mano alzada o herramientas de selección, o seleccione el gel mediante "imagen | Ajustar | Umbral del color"de la herramienta y luego determinar el área de la utilización de gel" analizar | Comando de medida".</li>
</ol>4. inhibición de miRNA actividades por miRNA bloqueado-basados en ácidos nucleicos inhibidores
<ol><li>Mantener las células MS-1 en condiciones de cultivo estándar.</li>
	<li>Transfectar ácido nucleico bloqueado (LNA) inhibidores de la miRNA, miRNA sintético dúplex o siRNAs (20 o 50 nM) lipofection reactivos según las instrucciones del fabricante. Datos y fuentes de LNA miRNA inhibidores sintéticos miRNA dúplex y siRNAs fueron descritas en nuestros anteriores informes26,27. En las células MS-1, procedimientos de transfección estándar basados en las instrucciones del fabricante funcionan bien para introducción de LNA inhibidores de miRNA, miRNA sintético dúplex o siRNAs.</li>
	<li>Después de 16-48 h, estimulan las células endoteliales con TGF-β2 (una concentración final de 1 ng/mL).</li>
	<li>Proceder a distintos análisis aguas abajo, incluyendo análisis de la expresión (RT-PCR cuantitativa y análisis de RNA-secuencia (RNA-seq)) RNA, análisis de immunocytochemical y ensayo de reportero. Análisis posteriores se han descrito en nuestros anteriores informes20,26,27.</li>
</ol>

<ol><li>Sanchez-Duffhues, G., Garcia de Vinuesa, A., Ten Dijke, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endothelial-to-mesenchymal+transition+in+cardiovascular+diseases%3A+Developmental+signaling+pathways+gone+awry%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Dynamics%22%5BJournal%5D)">Endothelial-to-mesenchymal transition in cardiovascular diseases: Developmental signaling pathways gone awry.</a> Developmental Dynamics. , (2017).</li>
<li>Markwald, R. R., Fitzharris, T. P., Smith, W. N. <a target="_blank" href="https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/0012160675903218">Structural analysis of endocardial cytodifferentiation.</a> Developmental Biology. 42 (1), 160-180 (1975).</li>
<li>Eisenberg, L. M., Markwald, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+regulation+of+atrioventricular+valvuloseptal+morphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+Research%22%5BJournal%5D)">Molecular regulation of atrioventricular valvuloseptal morphogenesis.</a> Circulation Research. 77 (1), 1-6 (1995).</li>
<li>Chen, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endothelial+cells+are+progenitors+of+cardiac+pericytes+and+vascular+smooth+muscle+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Endothelial cells are progenitors of cardiac pericytes and vascular smooth muscle cells.</a> Nature Communications. 7, 12422(2016).</li>
<li>DeRuiter, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Embryonic+endothelial+cells+transdifferentiate+into+mesenchymal+cells+expressing+smooth+muscle+actins+in+vivo+and+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+Research%22%5BJournal%5D)">Embryonic endothelial cells transdifferentiate into mesenchymal cells expressing smooth muscle actins in vivo and in vitro.</a> Circulation Research. 80 (4), 444-451 (1997).</li>
<li>Arciniegas, E., Neves, C. Y., Carrillo, L. M., Zambrano, E. A., Ramirez, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endothelial-mesenchymal+transition+occurs+during+embryonic+pulmonary+artery+development%5BTitle%5D)+AND+%22Endothelium%22%5BJournal%5D)">Endothelial-mesenchymal transition occurs during embryonic pulmonary artery development.</a> Endothelium. 12 (4), 193-200 (2005).</li>
<li>Welch-Reardon, K. M., Wu, N., Hughes, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+role+for+partial+endothelial-mesenchymal+transitions+in+angiogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Arteriosclerosis%2C+Thrombosis%2C+and+Vascular+Biology%22%5BJournal%5D)">A role for partial endothelial-mesenchymal transitions in angiogenesis.</a> Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 35 (2), 303-308 (2015).</li>
<li>Zeisberg, E. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endothelial-to-mesenchymal+transition+contributes+to+cardiac+fibrosis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Endothelial-to-mesenchymal transition contributes to cardiac fibrosis.</a> Nature Medicine. 13 (8), 952-961 (2007).</li>
<li>Chen, P. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endothelial-to-mesenchymal+transition+drives+atherosclerosis+progression%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Endothelial-to-mesenchymal transition drives atherosclerosis progression.</a> Journal of Clinical Investigation. 125 (12), 4514-4528 (2015).</li>
<li>Bostrom, K. I., Yao, J., Guihard, P. J., Blazquez-Medela, A. M., Yao, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endothelial-mesenchymal+transition+in+atherosclerotic+lesion+calcification%5BTitle%5D)+AND+%22Atherosclerosis%22%5BJournal%5D)">Endothelial-mesenchymal transition in atherosclerotic lesion calcification.</a> Atherosclerosis. , 124-127 (2016).</li>
<li>Qiao, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endothelial+fate+mapping+in+mice+with+pulmonary+hypertension%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Endothelial fate mapping in mice with pulmonary hypertension.</a> Circulation. 129 (6), 692-703 (2014).</li>
<li>Ranchoux, B., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/25593290">Endothelial-to-mesenchymal transition in pulmonary hypertension.</a> Circulation. 131 (11), 1006-1018 (2015).</li>
<li>Maddaluno, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((EndMT+contributes+to+the+onset+and+progression+of+cerebral+cavernous+malformations%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">EndMT contributes to the onset and progression of cerebral cavernous malformations.</a> Nature. 498 (7455), 492-496 (2013).</li>
<li>Krenning, G., Zeisberg, E. M., Kalluri, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+origin+of+fibroblasts+and+mechanism+of+cardiac+fibrosis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Physiology%22%5BJournal%5D)">The origin of fibroblasts and mechanism of cardiac fibrosis.</a> Journal of Cell Physiology. 225 (3), 631-637 (2010).</li>
<li>Cooley, B. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TGF-beta+signaling+mediates+endothelial-to-mesenchymal+transition+%28EndMT%29+during+vein+graft+remodeling%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Translational+Medicine%22%5BJournal%5D)">TGF-beta signaling mediates endothelial-to-mesenchymal transition (EndMT) during vein graft remodeling.</a> Science Translational Medicine. 6 (227), 227ra234(2014).</li>
<li>Wang, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transforming+Growth+Factor-beta1+Induces+Endothelial-to-Mesenchymal+Transition+via+Akt+Signaling+Pathway+in+Renal+Transplant+Recipients+with+Chronic+Allograft+Dysfunction%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+Transplantation%22%5BJournal%5D)">Transforming Growth Factor-beta1 Induces Endothelial-to-Mesenchymal Transition via Akt Signaling Pathway in Renal Transplant Recipients with Chronic Allograft Dysfunction.</a> Annals of Transplantation. 21, 775-783 (2016).</li>
<li>Xu-Dubois, Y. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Markers+of+Endothelial-to-Mesenchymal+Transition%3A+Evidence+for+Antibody-Endothelium+Interaction+during+Antibody-Mediated+Rejection+in+Kidney+Recipients%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Society+of+Nephrology%22%5BJournal%5D)">Markers of Endothelial-to-Mesenchymal Transition: Evidence for Antibody-Endothelium Interaction during Antibody-Mediated Rejection in Kidney Recipients.</a> Journal of the American Society of Nephrology. 27 (1), 324-332 (2016).</li>
<li>Zeisberg, E. M., Potenta, S., Xie, L., Zeisberg, M., Kalluri, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Discovery+of+endothelial+to+mesenchymal+transition+as+a+source+for+carcinoma-associated+fibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Discovery of endothelial to mesenchymal transition as a source for carcinoma-associated fibroblasts.</a> Cancer Research. 67 (21), 10123-10128 (2007).</li>
<li>Pardali, E., Sanchez-Duffhues, G., Gomez-Puerto, M. C., Ten Dijke, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TGF-beta-Induced+Endothelial-Mesenchymal+Transition+in+Fibrotic+Diseases%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Sciences%22%5BJournal%5D)">TGF-beta-Induced Endothelial-Mesenchymal Transition in Fibrotic Diseases.</a> International Journal of Molecular Sciences. 18 (10), (2017).</li>
<li>Mihira, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TGF-beta-induced+mesenchymal+transition+of+MS-1+endothelial+cells+requires+Smad-dependent+cooperative+activation+of+Rho+signals+and+MRTF-A%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">TGF-beta-induced mesenchymal transition of MS-1 endothelial cells requires Smad-dependent cooperative activation of Rho signals and MRTF-A.</a> Journal of Biochemistry. 151 (2), 145-156 (2012).</li>
<li>Hashimoto, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endothelial-mesenchymal+transition+in+bleomycin-induced+pulmonary+fibrosis%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Respiratory+Cell+and+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Endothelial-mesenchymal transition in bleomycin-induced pulmonary fibrosis.</a> American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 43 (2), 161-172 (2010).</li>
<li>Suzuki, H. I., Miyazono, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamics+of+microRNA+biogenesis%3A+crosstalk+between+p53+network+and+microRNA+processing+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+Medicine+%28Berl%29%22%5BJournal%5D)">Dynamics of microRNA biogenesis: crosstalk between p53 network and microRNA processing pathway.</a> Journal of Molecular Medicine (Berl). 88 (11), 1085-1094 (2010).</li>
<li>Suzuki, H. I., Miyazono, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Emerging+complexity+of+microRNA+generation+cascades%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Emerging complexity of microRNA generation cascades.</a> Journal of Biochemistry. 149 (1), 15-25 (2011).</li>
<li>Nicoloso, M. S., Spizzo, R., Shimizu, M., Rossi, S., Calin, G. A. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/19262572">MicroRNAs--the micro steering wheel of tumour metastases.</a> Nature Reviews Cancer. 9 (4), 293-302 (2009).</li>
<li>Lagendijk, A. K., Goumans, M. J., Burkhard, S. B., Bakkers, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNA-23+restricts+cardiac+valve+formation+by+inhibiting+Has2+and+extracellular+hyaluronic+acid+production%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+Research%22%5BJournal%5D)">MicroRNA-23 restricts cardiac valve formation by inhibiting Has2 and extracellular hyaluronic acid production.</a> Circulation Research. 109 (6), 649-657 (2011).</li>
<li>Katsura, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNA-31+is+a+positive+modulator+of+endothelial-mesenchymal+transition+and+associated+secretory+phenotype+induced+by+TGF-beta%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Cells%22%5BJournal%5D)">MicroRNA-31 is a positive modulator of endothelial-mesenchymal transition and associated secretory phenotype induced by TGF-beta.</a> Genes Cells. 21 (1), 99-116 (2016).</li>
<li>Suzuki, H. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+TGF-beta-mediated+endothelial-mesenchymal+transition+by+microRNA-27%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Regulation of TGF-beta-mediated endothelial-mesenchymal transition by microRNA-27.</a> Journal of Biochemistry. 161 (5), 417-420 (2017).</li>
<li>Camenisch, T. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Temporal+and+distinct+TGFbeta+ligand+requirements+during+mouse+and+avian+endocardial+cushion+morphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Temporal and distinct TGFbeta ligand requirements during mouse and avian endocardial cushion morphogenesis.</a> Developmental Biology. 248 (1), 170-181 (2002).</li>
<li>Krenning, G., Moonen, J. R., van Luyn, M. J., Harmsen, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vascular+smooth+muscle+cells+for+use+in+vascular+tissue+engineering+obtained+by+endothelial-to-mesenchymal+transdifferentiation+%28EnMT%29+on+collagen+matrices%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Vascular smooth muscle cells for use in vascular tissue engineering obtained by endothelial-to-mesenchymal transdifferentiation (EnMT) on collagen matrices.</a> Biomaterials. 29 (27), 3703-3711 (2008).</li>
<li>Medici, D., Potenta, S., Kalluri, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transforming+growth+factor-beta2+promotes+Snail-mediated+endothelial-mesenchymal+transition+through+convergence+of+Smad-dependent+and+Smad-independent+signalling%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+Journal%22%5BJournal%5D)">Transforming growth factor-beta2 promotes Snail-mediated endothelial-mesenchymal transition through convergence of Smad-dependent and Smad-independent signalling.</a> Biochemical Journal. 437 (3), 515-520 (2011).</li>
<li>Krizbai, I. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endothelial-mesenchymal+transition+of+brain+endothelial+cells%3A+possible+role+during+metastatic+extravasation%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Endothelial-mesenchymal transition of brain endothelial cells: possible role during metastatic extravasation.</a> PLoS One. 10 (3), e0119655(2015).</li>
<li>Arciniegas, E., Sutton, A. B., Allen, T. D., Schor, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transforming+growth+factor+beta+1+promotes+the+differentiation+of+endothelial+cells+into+smooth+muscle-like+cells+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Science%22%5BJournal%5D)">Transforming growth factor beta 1 promotes the differentiation of endothelial cells into smooth muscle-like cells in vitro.</a> Journal of Cell Science. 103 (Pt 2), 521-529 (1992).</li>
<li>Deissler, H., Deissler, H., Lang, G. K., Lang, G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TGFbeta+induces+transdifferentiation+of+iBREC+to+alphaSMA-expressing+cells%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Medicine%22%5BJournal%5D)">TGFbeta induces transdifferentiation of iBREC to alphaSMA-expressing cells.</a> International Journal of Molecular Medicine. 18 (4), 577-582 (2006).</li>
<li>Paranya, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aortic+valve+endothelial+cells+undergo+transforming+growth+factor-beta-mediated+and+non-transforming+growth+factor-beta-mediated+transdifferentiation+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Pathology%22%5BJournal%5D)">Aortic valve endothelial cells undergo transforming growth factor-beta-mediated and non-transforming growth factor-beta-mediated transdifferentiation in vitro.</a> American Journal of Pathology. 159 (4), 1335-1343 (2001).</li>
<li>Maleszewska, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IL-1beta+and+TGFbeta2+synergistically+induce+endothelial+to+mesenchymal+transition+in+an+NFkappaB-dependent+manner%5BTitle%5D)+AND+%22Immunobiology%22%5BJournal%5D)">IL-1beta and TGFbeta2 synergistically induce endothelial to mesenchymal transition in an NFkappaB-dependent manner.</a> Immunobiology. 218 (4), 443-454 (2013).</li>
<li>Ubil, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mesenchymal-endothelial+transition+contributes+to+cardiac+neovascularization%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Mesenchymal-endothelial transition contributes to cardiac neovascularization.</a> Nature. 514 (7524), 585-590 (2014).</li>
<li>Xu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epigenetic+balance+of+aberrant+Rasal1+promoter+methylation+and+hydroxymethylation+regulates+cardiac+fibrosis%5BTitle%5D)+AND+%22Cardiovasc+Research%22%5BJournal%5D)">Epigenetic balance of aberrant Rasal1 promoter methylation and hydroxymethylation regulates cardiac fibrosis.</a> Cardiovasc Research. 105 (3), 279-291 (2015).</li>
<li>Xiao, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor+Endothelial+Cells+with+Distinct+Patterns+of+TGFbeta-Driven+Endothelial-to-Mesenchymal+Transition%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Tumor Endothelial Cells with Distinct Patterns of TGFbeta-Driven Endothelial-to-Mesenchymal Transition.</a> Cancer Research. 75 (7), 1244-1254 (2015).</li>
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Los autores no tienen nada que revelar.

Se ha divulgado que activado tratamiento Ras y TGF-β durante 24 h inducida por EndMT en células de MS-1, mientras que TGF-β solo ha podido inducir EndMT en este corto período21. Constantemente, observamos que TGF-β sustancialmente inducida por EndMT después de un tratamiento más largo (48-72 h) en MS-1 células20. EndMT se ha observado repetidamente después de tratamiento prolongado con TGF-β (2-6 días) en diversas células endoteliales como umbilical humana de las células en...

Transición mesenquimal endotelial (EndMT) es el proceso por el que un distinguido de la célula endotelial sufre una variedad de cambios moleculares, lo que resulta en un fibroblasto-como de células mesenquimales1. EndMT fue descrito inicialmente como una transformación de la célula endotelial durante el desarrollo del corazón2,3. En el temprano desarrollo del corazón, el tubo del corazón consiste en un endocardio interno y un externo miocardio. Estas dos capas están separadas por una capa de matriz extracelular llamada la gelatina cardiaca. Las células embrionarias del Canal auriculoventricular, que adquieren marcadores de células endoteliales, tránsito en las células mesenquimales, invaden la gelatina cardiaca subyacente y promoción la formación de las almohadillas cardiacas, proporcionando la base para las válvulas auriculoventriculares y tabique y las válvulas semilunares. Además, EndMT ha sugerido que las fuentes del pericitos y células musculares lisas vasculares en otros sistemas vasculares embrionarios incluyendo los vasos coronarios, aorta abdominal y arteria pulmonar4,5,6. Además, EndMT está implicado en angiogénicos fisiológicos germinación7.
Acumulación de evidencia ha sugerido que EndMT también está implicado en varias enfermedades cardiovasculares y otras enfermedades1,8. Afecciones asociadas con la EndMT incluyen calcificación vascular, aterosclerosis, hipertensión arterial pulmonar, malformación cavernosa, fibrosis del órgano, remodelación de injerto de vena, disfunción del aloinjerto en trasplante de riñón y cáncer8, 9,10,11,12,13,14,15,16,17, 18. un informe reciente describió que varios marcadores moleculares de EndMT pueden ser una herramienta para la predicción del diagnóstico y pronóstico de la disfunción del injerto renal en riñón trasplante17. Modulación de vías de señalización celulares relacionados con el EndMT se han demostrado para mejorar varias condiciones de enfermedad incluyendo fibrosis cardiaca y vena del injerto remodelación en animales modelos8,15. Por lo tanto, comprensión de los mecanismos EndMT subyacente es importante desarrollar estrategias diagnósticas y terapéuticas dirigidas a EndMT.
EndMT se caracteriza por la pérdida de las ensambladuras de la célula, aumento en el potencial migratorio, desregulación de genes endoteliales específicos como VE-cadherina y upregulation de los genes mesenquimales incluyendo la actinia del músculo liso de α (α-SMA). Además, EndMT y transición epitelial-mesenquimal (EMT), un proceso similar que convierte las células epiteliales para las células mesenquimales, se asocian con producción alterada de los diversos componentes de la matriz extracelular, que pueden contribuir al desarrollo de tejido fibrosis8,19.
Recientemente, varios estudios en vitro de EndMT han aclarado los detalles de los mecanismos moleculares de la EndMT15,20. EndMT es inducida por varias vías de señalización como transformación de factor de crecimiento (TGF)-β, Wnt y muesca1. Entre ellos, TGF-β juega un papel fundamental en la inducción de la EMT y EndMT. En EndMT, la exposición prolongada a resultados de TGF-β en EndMT en diversas células endoteliales, mientras que el corto de la exposición parece ser insuficiente21. Aquí describimos un protocolo sencillo para la inducción de EndMT, en que 1 milla de SVEN (MS-1) células endoteliales microvasculares pancreáticas de ratón se someten a EndMT en vitro después de la exposición prolongada a TGF-β20. En este modelo, se pueden realizar múltiples análisis aguas abajo para investigar características del sello de EndMT, incluyendo cambios morfológicos, downregulation de marcadores endoteliales, upregulation de los genes inflamatorios, citoesqueleto y marcadores mesenquimales los cambios y contracción del gel de colágeno.
MicroRNAs (miRNAs) son ~ 22 nt small RNAs reguladoras que represión postranscripcional de varios mRNA objetivos22,23. A través del reconocimiento de semillas mediada por la secuencia blanco, miRNAs suprimir cientos de genes diana y modula diversas funciones celulares como la diferenciación celular, proliferación y motilidad. Este es también el caso para la regulación de la EMT y EndMT, y varios miRNAs se han divulgado como reguladores de la EMT y EndMT24,25. El modelo de EndMT presentado en esta revisión se puede combinar fácilmente con procedimientos de la modulación de miRNA para probar las funciones de miRNAs en EndMT. La presente revisión resume los procedimientos experimentales para investigar EndMT inducida por el TGF-β en las células MS-1 y también incluye la comparación de las condiciones de inducción de EndMT por TGF-β en otras células endoteliales.

<table><tbody><tr><td>Células MS-1 Colección de</td><td>cultivos tipo americano</td><td>CRL-2279</td><td></td></tr><tr><td>MEM-alpha</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>32571036</td><td></td></tr><tr><td>TGF-beta2</td><td>R& D</td><td>302-B2-002</td><td></td></tr><tr><td>4 pocillos Lab-Tek II Chamber Slide Thermo</td><td>Fisher Scientific</td><td>154526</td><td></td></tr><tr><td>Y-27632&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Y0503</td><td></td></tr><tr><td>Bloqueo One</td><td>nacalai tesque</td><td>03953-95</td><td></td></tr><tr><td>faloidina-tetrametilrodamina B isotiocianato</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P1951</td><td></td></tr><tr><td>TOTO-3</td><td>yoduro Thermo Fisher Scientific</td><td>T3604</td><td></td></tr><tr><td>VE anticuerpo monoclonal cadherina (BV13)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>14-1441-82</td><td></td></tr><tr><td>alfa-SMA Anticuerpo monoclonal Cy3 (1A4)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C6198</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 cabra anti-ratón IgG (H+L)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A-11001</td><td></td></tr><tr><td>Cubreobjetos</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>174934</td><td></td></tr><tr><td>Solución de colágeno</td><td>Nitta gelatin Inc.</td><td>Cellmatrix I-P</td><td></td></tr><tr><td>Tampón de dilución de colágeno</td><td>Nitta gelatina Inc.</td>Inhibidor de miRNA de ARN <td>Cellmatrix I-P</td><td></td></tr><tr><td>LNA</td><td>EXIQON&nbsp;</td><td>miRCURY LNAinhibidor de potencia de microARN (control negativo B y miARN diana)</td><td></td></tr><tr><td>miARN sintético dúplex</td><td>Qiagen&nbsp;</td><td>miScript miRNA Mimic</td><td></td></tr><tr><td>Lipofectamine RNAiMAX</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>13778030</td><td></td></tr><tr><td>Lipofectamine 2000</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11668027</td><td></td></tr></tbody></table>

análisis molecular de transición endotelio-mesénquima inducida por transformación de señalización del factor de crecimiento β

Molecular Analysis of Endothelial-mesenchymal Transition Induced by Transforming Growth Factor-&#946; Signaling

Plasticidad fenotípica de las células endoteliales es la base de desarrollo del sistema cardiovascular, enfermedades cardiovasculares y diversas condiciones asociadas con fibrosis del órgano. En estas condiciones, las células endoteliales diferenciadas adquieren mesenquimales como fenotipos. Este proceso se llama transición endotelio-mesénquima (EndMT) y se caracteriza por el downregulation de marcadores endoteliales, upregulation de marcadores mesenquimales y cambios morfológicos. EndMT es inducida por varias vías de señalización, incluyendo transformación de factor de crecimiento (TGF)-β, Wnt y Notch y regulados por mecanismos moleculares similares a los de transición epitelial-mesenquimal (EMT) importante para el gastrulation, fibrosis del tejido, y metástasis del cáncer. Comprensión de los mecanismos de EndMT es importante para desarrollar enfoques diagnósticos y terapéuticos dirigidos a EndMT. Fuerte inducción de EndMT en vitro es útil para caracterizar las firmas de expresión de genes comunes, identificar los mecanismos moleculares druggable y pantalla para moduladores de EndMT. Aquí, describimos un método en vitro para la inducción de EndMT. Células endoteliales microvasculares pancreático de ratón MS-1 se someten a EndMT después de la exposición prolongada a TGF-β y mostrar upregulation de marcadores mesenquimales y cambios morfológicos, así como la inducción de citoquinas y quimiocinas inflamatorias múltiples. También se incluyen métodos para el análisis de microARN (miARN) modulación. Estos métodos proporcionan una plataforma para investigar mecanismos subyacentes a EndMT y el aporte de miRNAs a EndMT.

TGF-β es un potente inductor de EndMT en diversas células endoteliales. Después del tratamiento de 24 h con TGF-β en las células MS-1, tinción para actina F muestra reorganización de la actina estrés las fibras (figura 1A)20. Tratamiento previo con un inhibidor de la roca Y-27632 inhibe la inducción de actina reorganización20. Las células endoteliales MS-1 cambian de una clásica morfología de adoquines-como a un...

Se describe un protocolo para la inducción en vitro de transición endotelio-mesénquima (EndMT), que es útil para la investigación de vías de señalización celulares involucradas en EndMT. En este modelo experimental, EndMT es inducida por el tratamiento con TGF-β en las células endoteliales MS-1.

Análisis molecular de transición endotelio-mesénquima inducida por transformación de señalización del Factor de crecimiento β

Phenotypic plasticity of endothelial cells underlies cardiovascular system development, cardiovascular diseases, and various conditions associated with ...

Este método puede ayudar a responder preguntas clave en los campos de la biología vascular y del cáncer, como los mecanismos de plasticidad endotelial en diversas condiciones patológicas, incluido el cáncer. La principal ventaja de esta técnica es que la inducción robusta de EndMT in vitro se logra mediante el tratamiento con TGF-en células endoteliales MS-1. En primer lugar, cultive las células MS-1 en condiciones de cultivo estándar y evite que el cultivo sea confluente.A continuación, en un plato de 10 cm, lave las células MS-1 con solución salina tamponada con fosfato 1x. A continuación, añada 1 ml de tripsina a la placa e incube la placa a 37 grados centígrados durante cinco minutos. A continuación, añada 9 mL de medio de cultivo a las células tripsinizadas para su desprendimiento.A continuación, recoja la suspensión celular tripsinizada en un tubo de 15 ml. Centrifugar la suspensión celular a 300 a 400 x G durante cinco minutos a temperatura ambiente. A continuación, utilice un contador automático de células para contar el número de células viables.A continuación, coloque las células MS-1 en placas de cultivo estándar sin recubrimiento para el cultivo a largo plazo. Después d

molecular-analysis-endothelial-mesenchymal-transition-induced

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Investigación

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Biology

Biología

Un método directo se describe para la inducción de la transición epitelial a mesenquimal (EMT) en una variedad de tipos de células. Se incluyen métodos para el análisis de células en estados EMT por inmunocitoquímica.

Inducción y Análisis de epitelial a mesenquimal de transición

Se ha demostrado que la regulación alternativa del empalme contribuye a la transición epitelio-mesenquimal (EMT), un programa celular esencial en diversos procesos fisiológicos y patológicos. Aquí describimos un método que utiliza un modelo de EMT inducible para la detección de empalme alternativo durante EMT.

Detección de splicing alternativo Durante epitelial-mesenquimal de transición

Aquí, describimos el desarrollo y la aplicación de un ensayo de contracción en gel para evaluar la función contráctil en células mesenquimales que experimentaron una transición epitelio-mesenquimatosa.

Desarrollo de una<em&gt; In Vitro</em&gt; Ensayo para evaluar la función contráctil de las células mesenquimales que la transición epitelio-mesenquimal Sufrió

Este manuscrito describe un ensayo de formación de tubos para cuantificar los efectos de un determinado compuesto o condición sobre la angiogénesis mediante el uso de la formación de tubos de células endoteliales en un entorno controlado.

Tubo de Ensayo de la célula endotelial Formación estratégica: Comparación de la matriz extracelular y el factor de crecimiento reducido de la matriz extracelular

Presentamos aquí un método de cultivo celular para inducir transiciones mesenquimales-epitelial (MET) en células de sarcoma en base a la expresión ectópica combinado de miembros de la familia microRNA-200 y Grainyhead-como 2 (GRHL2). Este método es adecuado para una mejor comprensión del impacto biológico de la plasticidad fenotípica de la agresividad del cáncer y los tratamientos.

La inducción de la mesenquimales-epitelial Transitions en células de sarcoma

miRNA la terapéutica tienen un potencial significativo en la regulación de la progresión del cáncer. Demostrado aquí son enfoques analíticos utilizados para la identificación de la actividad de un miRNA combinatoria tratamiento en detener el ciclo celular y la angiogénesis.

Análisis de miRNA combinatoria tratamientos para regular el ciclo de celular y la angiogénesis

Describimos un flujo de trabajo sistemático para investigar la señalización β TGF y la EMT inducida por TGF-β mediante el estudio de la proteína y la expresión génica implicadas en esta vía de señalización. Los métodos incluyen hinchazón occidental, un ensayo de reportero luciferasa, qPCR y tinción de inmunofluorescencia.

Estudio de la señalización β TGF y la transición epitelial a mesenquimal inducida por TGF-β en cáncer de mama y células normales

Se describen métodos para investigar TGF-β2 inducida por EndMT en células endoteliales mediante la observación de los cambios en la morfología celular y el examen de la expresión endMT relacionados con los cambios de marcador utilizando la tinción de inmunofluorescencia. La edición del gen CRISPR/Cas9 fue descrita y utilizada para agotar el gen que codifica el caracol para investigar su papel en endMT inducido por TGF-β2.

TGF-β mediada por la transición endotelial a mesenquimal (EndMT) y la evaluación funcional de los efectores endMT utilizando la edición de genes CRISPR / Cas9

Aquí, establecemos un protocolo para visualizar y analizar simultáneamente múltiples complejos SMAD utilizando el ensayo de ligadura de proximidad (PLA) en células endoteliales expuestas a condiciones patológicas y fisiológicas de estrés por cizallamiento de fluidos.

Visualización y cuantificación de la señalización TGFβ/BMP/SMAD bajo diferentes condiciones de tensión por cizallamiento de fluidos mediante ensayo de ligadura de proximidad

En este trabajo se presenta un modelo animal de fibrosis inducida por transición endotelial-mesenquimatosa, como se observa en defectos cardíacos congénitos como la estenosis aórtica crítica o el síndrome del corazón izquierdo hipoplásico, que permite la evaluación histológica detallada del tejido, la identificación de vías de señalización reguladoras y la prueba de opciones de tratamiento.

Un modelo de trasplante de corazón de rata heterotópico neonatal para el estudio de la transición endotelial a mesenquimal

El presente protocolo permite la recuperación de estructuras en forma de tubo formadas en el ensayo clásico de formación de tubos de angiogénesis in vitro , donde las células, como las células trofoblásticas, se organizan en estructuras similares a capilares sobre una capa de matriz de membrana basal extracelular. Las estructuras recuperadas se utilizan para el aislamiento de ARN y proteínas para diversos análisis bioquímicos.

Ensayo de recuperación de células trofoblásticas de angiogénesis y formación de tubos para el análisis de la expresión de marcadores de diferenciación

Aprende a inducir la transición endotelio-mesénquima en células MS-1 usando TGF-β2. Este protocolo permite analizar cambios morfológicos y moleculares, incluyendo la modulación de microRNAs, para estudiar mecanismos en biología vascular.

Análisis molecular de transición endotelio-mesénquima inducida por transformación de señalización del Factor de crecimiento β

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