Name: Electroquímico detección de deuterio cinético isótopo efecto en extracelular transporte de electrones en la Shewanella oneidensis MR-1 (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-04-16T14:30:00.000+00:00
Duration: 9 min
Description: Aprende a detectar el efecto isotópico cinético de deuterio en el transporte de electrones extracelular usando Shewanella oneidensis MR-1. Este método electroquímico revela el impacto del transporte de protones en la cinética de EET.

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Este trabajo fue apoyado financieramente por un subvenciones de investigación promovido especialmente de la sociedad japonesa para la promoción de la ciencia (JSPS) KAKENHI número de concesión 24000010, 17H 04969 y JP17J02602, el nos oficina de Naval investigación Global (N62909-17-1-2038). Y.T. es un investigador de JSP y apoyado por JSP a través del programa escuelas de graduados principales (mérito).

1. formación de una monocapa de Biofilm de S. oneidensis MR-1 en un electrodo ITO (figura 1)
Nota: Para evitar la contaminación del reactor electroquímico con otros microbios, todos los medios, instrumentos y componentes del reactor electroquímico deben esterilizarse previamente. Cuando utilizando células de S. oneidensis MR-1 y la construcción de los reactores electroquímicos, todos los procedimientos deben realizarse en una mesa de trabajo limpia.
<ol><li>Cultivo de células de S. oneidensis MR-1 Nota: Un monocapa biofilm de S. oneidensis MR-1 se constituyó en un ITO electrodo siguiendo las condiciones anteriormente registrados4.<ol>
<li>Para hacer crecer células de S. oneidensis MR-1, agregar una colonia de S. oneidensis MR-1 cultivadas en una placa de agar que Luria-Bertani (LB) (20 g/L) y bacto agar (15 g/L) en 15 mL de medio LB (20 g/L) a 30 ° C por 24 h en condiciones aeróbicas con agitación a 160 rpm.</li>
		<li>Centrifugue la suspensión de células en 6.000 × g por 10 min y resuspender el precipitado celular resultante en 15 mL de medio definido (pH 7.8) (DM: NaHCO3 [2, 5 g/L], CaCl2·2H2O [0,08 g/L], NH4Cl [1.0 g/L], MgCl2· 6 H2O [0,2 g/L], NaCl [10 g/L] y 2-[4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazinyl] ácido (n-2-hidroxietilpiperazina-N'-2-ácido [HEPES; 7,2 g/L]), suplementado con lactato de 10 mM y 0,5 g/L Extracto de levadura como fuente de carbono y oligoelementos para S. oneidensis MR-1 , respectivamente.</li>
		<li>Además cultivar la suspensión celular aeróbica a 30 ° C por 12 h con agitación a 160 rpm y centrifugar nuevamente a 6.000 × g por 10 minutos lavar el precipitado de células resultante dos veces con medio de DM por centrifugación durante 10 minutos a 6.000 × g antes de la electroquímica experimento.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Construcción de un reactor electroquímico de tres electrodos (figura 1)<ol>
<li>Poner un sustrato ITO como el electrodo de trabajo en la parte inferior del reactor.</li>
		<li>Posteriormente, coloque un cilindro de vidrio (diámetro de 2 cm) y una cubierta de politetrafluoroetileno (PTFE). Luego inserte (KCl saturado) de Ag/AgCl y un alambre de platino en el reactor como los electrodos de referencia y contador, respectivamente. Nota: Para evitar la fuga de aire y solución, inserte una hoja de goma de butilo entre cada componente.</li>
		<li>Añadir 4,0 mL de MS suplementados con lactato de 10 mM y extracto de levadura 0.5 g/L en el reactor electroquímico.</li>
		<li>Después de confirmar que no hay ninguna salida desde el reactor electroquímico, flujo del gas del nitrógeno en el reactor electroquímico durante 20 min para mantener condiciones anaeróbicas en el reactor electroquímico. Nota: Para evitar la contaminación con otros microbios, el gas debe filtrarse antes de que fluya en el reactor electroquímico.</li>
		<li>Conectar el reactor electroquímico con un potenciostato y aplicar +0.4 V (versus electrodo de hidrógeno estándar, ella) al electrodo ITO, manteniendo la temperatura del reactor electroquímico a 30 ° C mediante un sistema de circulación de agua exterior. Nota: Para evitar el efecto de un campo eléctrico externo, el reactor electroquímico debe colocarse en una jaula de Faraday.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Cultivo electroquímico de S. oneidensis MR-1 células (figura 1 y figura 2)<ol>
<li>Ajustar la densidad celular de la suspensión obtenida en el paso 1.1 a una densidad óptica de 1,43 a 600 nm (OD600) con DM complementado por levadura de lactato y 0,5 g/L de 10 mM del extracto. Nota: Para obtener el correcto OD600, aplicar la suspensión de OD600 ≤ 0,8 a un espectrómetro de UV-vis antes de ajustar el OD600 a 1,43.</li>
		<li>Agregar 0,3 mL de la suspensión de células en el reactor electroquímico a través del puerto de inyección con una jeringa: OD600 en el reactor cambia a 0.1. Nota: La adición de la suspensión celular de 0.3 mL con OD600 = 1,43 en el reactor electroquímico que contiene 4,0 mL resultado medio en 4,3 mL de solución con un OD600 = 0.1. Cuando utilice otros reactores con volúmenes distintos, el cálculo de la densidad celular se requiere.</li>
		<li>Continuar la aplicación en +0.4 V (frente a ella) al electrodo ITO para 25 h. Nota: Para la formación de una monocapa de biopelícula en un electrodo ITO, asegúrese de que la corriente producida exhibe una desviación inferior al 50% de la figura 2.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. reemplazo del sobrenadante con medio fresco de DM con 10 mM de lactato (figura 3)
<ol><li>Detener la aplicación potencial y desconectar el reactor electroquímico el potenciostato y el sistema de circulación de agua.</li>
	<li>Reemplazo del sobrenadante con medio fresco de DM con 10 mM de lactato<ol>
<li>Flujo de nitrógeno gas en un frasco que contenga DM con lactato de 10 mM más de 20 minutos para quitar el oxígeno del medio.</li>
		<li>Lentamente Quite todo el sobrenadante dentro el reactor electroquímico utilizando una jeringa, en que fluye el gas del nitrógeno (figura 3a, b). Nota: Para evitar romper el biofilm en el electrodo ITO por el gas del nitrógeno, el gas debe fluir sobre la superficie del líquido.</li>
		<li>Añadir 4,0 mL de MS dulce que contiene lactato de 10 mM utilizando una jeringa (Figura 3C). Nota: Para evitar romper el biofilm en el electrodo ITO, inyecte lentamente el medio a lo largo de la pared del reactor electroquímico. Para mantener la biopelícula húmeda, se debe agregar el medio inmediatamente después de la eliminación del sobrenadante. Inyección de la media hasta 1 min después de la eliminación del sobrenadante no afecte la producción actual de biofilm de S. oneidensis MR-1.</li>
		<li>Incline el reactor electroquímico para quitar todo el sobrenadante fijado a la pared del reactor electroquímico.</li>
		<li>Repita los pasos 2.2.2-2.2.4 tres veces en total.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Detener el flujo de gas y conectar el reactor electroquímico para el potenciostato, aplicando +0.4 V (frente a ella) al electrodo ITO a 303 K.</li>
</ol>3. adición de deuterio agua para medir el KIE en el proceso EET (figura 4)
<ol><li>Confirman que la producción actual de una monocapa de biofilm de S. oneidensis MR-1 es estable y no aumenta rápidamente. Si la corriente aumenta abruptamente, espere hasta que la corriente se estabiliza dentro de un aumento de 5% durante 10 minutos. Nota: La formación de una monocapa de biopelícula en un electrodo ITO sin contaminación de otras cepas microbianas fue confirmada por secuencias del rDNA y una escaneo imagen microscópica electrónica de la biopelícula en un electrodo ITO, como se informó anteriormente4. Para la confirmación de la limitación de la tasa por el proceso EET, monitorear el efecto de la adición de mover electrones mediadores como 100 μm antraquinona-1-sulfonato (α-AQS). Ver la sección de Resultados de representante y de referencia15 para más detalles.</li>
	<li>Agregar 40 μl de anoxia 50% (v/v) D2O en el reactor electroquímico utilizando una jeringa de tal manera que la concentración es de 0.5% (v/v) D2O en el reactor. Nota: Para evitar daños en el biofilm por la adición de2O de D, inyectar D2O mediante goteo.</li>
	<li>Espera para que estabilizar la corriente y posteriormente añadir el D2O hasta un 4.0% (v/v). Nota: Para obtener el valor KIE (el ratio de producción actual en presencia D2O y H2O), verificar el efecto del mismo volumen de adición de H2O en la producción actual.</li>
</ol>

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</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

Nuestro análisis electroquímico de células completas tiene varias ventajas técnicas en comparación con electroquímica de proteína. Mientras que la purificación de proteínas requiere varios pasos lentos procedimientos, nuestro método de celulares toma un día de formación del biofilm auto-organizada después de cultivo celular. Para lograr una interacción estable entre OM c- Cyts y el electrodo, necesitamos sólo la esterilización y limpieza de la superficie del electrodo; no requiere modificación de electrodo para ...

Recientemente han surgido técnicas electroquímicas para caracterizar directamente una proteína redox en una célula bacteriana intacta desde el descubrimiento del metal reduciendo las cepas microbianas, como Geobacter sulfurreducens PCA, S. oneidensis MR-1 que tienen complejos de citocromo tipo c de membrana externa (OM c-Cyts) expuestos a la célula exterior1,2,3,4,5. El OM c- Cyts mediar transporte de electrones de la cadena respiratoria a sustratos sólidos situados extracelularmente. Este transporte se denomina transporte de electrones extracelular (EET)1,6 y es un proceso crítico para las biotecnologías emergentes, tales como las células de combustible microbianas6. Por lo tanto, para comprender la cinética subyacente de EET y mecanismos y su relación con la fisiología microbiana, OM c -Cyts han investigado usando celulares electroquímica4,7, combinado con microscopía 8 , 9, espectroscopia10,11y biología molecular2,4. En contraste, los métodos para investigar el impacto del transporte de cationes asociados de EET, por ejemplo, protones, en la cinética de la EET en las células vivas apenas establecidos, a pesar de transporte de protones a través de las membranas bacterianas tienen un papel fundamental señalización, homeostasis y energía producción12,13,14. En el presente estudio, describimos una técnica para examinar el impacto del transporte de protones en la cinética de la EET en la S. oneidensis MR-1 célula usando células completas medidas electroquímicas, que requiere la identificación del paso tarifa-limitador en la microbiana de producción actual15.
Una forma directa de evaluar la contribución del transporte de protones en la OTA asociada es efecto cinético del isótopo deuterio (KIE). El KIE es observable como el cambio en la cinética de transferencia de electrones sobre el reemplazo de protones con los iones de deuterio, que representa el impacto del transporte del protón en electrón transferencia cinética16. La teoría de KIE sí mismo se ha establecido bien con medidas electroquímicas de enzimas purificadas17. Sin embargo, ya que la producción actual en S. oneidensis MR-1 resultado de múltiples procesos diversos y fluctuantes18, uno no puede simplemente identificar EET como el proceso de limitación de velocidad. Para observar el KIE en procesos de transporte de protones junto con EET, tenemos que confirmar que la actual producción microbiana está limitada por el transporte de electrones a través de OM c- Cyts al electrodo. Para ello, sustituimos la solución sobrenadante con medio fresco que contiene una alta concentración de lactato como un donante del electrón en el pH óptimo y la temperatura antes de la medición de KIE; este reemplazo sirve dos funciones: (1) mejora la tasa de los procesos metabólicos por aguas arriba en comparación con la OTA y (2) omite las células de la natación en el sobrenadante del monocapa biofilm de S. oneidensis MR-1 en el (electrodo de trabajo electrodos de óxido de estaño dopado (ITO) de indio). El protocolo detallado presentado pretende ayudar a los nuevos profesionales mantener y confirmar que el proceso EET es la etapa de determinación de tasa.

<table><tbody><tr><td>Cilindro de vidrio</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>Hecho a medida, utilizado como reactor electroquímico</td></tr><tr><td>Cubierta y base de PTFE</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>Hecho a medida, utilizado como cubierta y base del reactor electroquímico</td></tr><tr><td>Caucho butílico</td><td>N/A</td><td>N/A Hecho a</td><td>medida, insertado entre cada componente del reactor electroquímico</td></tr><tr><td>Septa</td><td>GL Science</td><td>3007-16101</td><td>Utilizado como puerto de inyección del reactor electroquímico</td></tr><tr><td>Electrodo de óxido dopado con indio y estaño (ITO)</td><td>GEOMATEC</td><td>No.0001</td><td>Utilizado como electrodo de trabajo, 5&Omega;/sq</td></tr><tr><td>Ag/AgCl Electrodo saturado de KCAl</td><td>HOKUTO DENKO</td><td>HX-R5</td><td>Utilizado como electrodo de referencia, &Phi; Alambre de platino de 0,30 mm</td></tr><tr><td></td><td>La Corporación Nilaco</td><td>PT-351325</td><td>Utilizado como contraelectrodo</td></tr><tr><td>Caldo Luria-Bertani (LB), Miller</td><td>Becton, Dichkinson and Company</td><td>244620</td><td>Medio para el precultivo de S. oneidensis MR-1</td></tr><tr><td>Bacto agar</td><td>Becton, Dichkinson and Company</td><td>214010</td><td></td></tr><tr><td>Antraquinona-1-sulfonato (&alpha;-AQS)</td><td>TCI</td><td>A1428</td><td></td></tr><tr><td>Mononucleótido de flavina (FMN)</td><td>Wako</td><td>184-00831</td><td></td></tr><tr><td>NaHCO3</td><td>Wako</td><td>191-01305</td><td>Utilizado para medio definido (DM)</td></tr><tr><td>CaCl2 &middot; 2H2O</td><td>Wako</td><td>031-00435</td><td>Utilizado para DM</td></tr><tr><td>NH4Cl</td><td>Wako</td><td>011-03015</td><td>Utilizado para DM</td></tr><tr><td>MgCl2 &middot; 6H2O</td><td>Wako</td><td>135-00165</td><td>Utilizado para DM</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Wako</td><td>191-01665</td><td>Utilizado para DM</td></tr><tr><td>2-[4-(2-hidroxietil)-1-piperazinil] ácido etanosulfónico (HEPES)</td><td>DOJINDO</td><td>346-08235</td><td>Utilizado para DM</td></tr><tr><td>Solución de lactato de sodio</td><td>Wako</td><td>195-02305</td><td></td></tr><tr><td>Extracto de levadura Bacto</td><td>Becton, Dichkinson and Company</td><td>212750</td><td></td></tr><tr><td>Óxido de deuterio (D, 99,9%)</td><td>Cambridge Isotope Laboratories, Inc.</td><td>DLM-4-PK</td><td>Aditivo para experimentos de efecto cinético de isótopos</td></tr><tr><td>Incubadora</td><td>TOKYO RIKAKIKAI CO., LTD.</td><td>LTI-601SD</td><td>Utilizado para precultivo</td></tr><tr><td>Agitador</td><td>TAITEC</td><td>NR-3</td><td>Utilizado para precultivo</td></tr><tr><td>Máquina de autoclave</td><td>TOMY SEIKO CO. LTD.</td><td>LSX-500</td><td>Se utiliza para la esterilización del reactor electroquímico y el medio</td></tr><tr><td>Banco limpio</td><td>SANYO</td><td>MCV-91BNF</td><td>Se utiliza para prevenir la contaminación del reactor electroquímico y el medio con otros microbios</td></tr><tr><td>Separador de centrífuga</td><td>Eppendorf</td><td>5430R</td><td>Velocidad de rotación de hasta 6000 veces; g se requiere</td></tr><tr><td>generador de gas nitrógeno</td><td>Puequ CO. LTD.</td><td>PNTN-2</td><td>El cilindro de gas nitrógeno también se puede utilizar en lugar del generador de gas</td></tr><tr><td>espectrómetro UV-vis</td><td>SHIMADZU</td><td>UV-1800</td><td>Se utiliza para la optimización de la densidad celular</td></tr><tr><td>Potenciostat</td><td>BioLogic</td><td>VMP3</td><td>Se utiliza para la formación de biopelículas y experimentos de efecto cinético de isótopos</td></tr><tr><td>Circulador de agua térmica</td><td>AS ONE</td><td>TR-1A</td><td>Se utiliza para el mantenimiento de la temperatura del reactor electroquímico</td></tr><tr><td>Jaula de Faraday</td><td>HOKUTO DENKO</td><td>HS-201S</td><td>Utilizada para experimentos electroquímicos</td></tr></tbody></table>

electroquímico detección de deuterio cinético isótopo efecto en extracelular transporte de electrones en la shewanella oneidensis mr-1

Electrochemical Detection of Deuterium Kinetic Isotope Effect on Extracellular Electron Transport in Shewanella oneidensis MR-1

Directa detección electroquímica de c-tipo complejos citocromo incrustados en la membrana externa bacteriana (membrana externa c-tipo complejos citocromo; OM c- Cyts) recientemente ha surgido como un método de análisis de celulares nuevos para caracterizar el transporte de electrones bacteriano de la cadena respiratoria al exterior de la célula, conocido como el transporte de electrones extracelular (EET). Mientras que la vía y cinética del flujo del electrón durante la reacción de EET se han investigado, un método electroquímico de la célula entera para examinar el impacto del transporte de cationes asociado con EET todavía no se ha establecido. En el presente estudio, se describe un ejemplo de una técnica bioquímica para examinar el efecto de cinética isótopos de deuterio (KIE) sobre EET mediante OM c- Cyts usando un microbio modelo, Shewanella oneidensis MR-1. El KIE en el proceso EET puede obtenerse si la OTA a través de OM c- Cyts actúa como el paso tarifa-limitador en la actual producción microbiana. Para ello, antes de la adición de D2O, la solución sobrenadante fue reemplazada con medio fresco que contiene una cantidad suficiente de la donante del electrón para apoyar la tasa de reacciones metabólicas por aguas arriba y para eliminar las células planctónicas de un uniforme monocapa biofilm en el electrodo de trabajo. Métodos alternativos para confirmar la limitación de velocidad se paso en actual producción microbiana como EET mediante OM c- Cyts también se describen. Nuestra técnica de un análisis electroquímico de células completas para investigar la cinética del transporte de protones se puede aplicar a otras cepas microbianas electroactivos.

Después de 25 h de potencial aplicación en +0.4 V (contra ella), se formó una biopelícula de monocapa en el electrodo de trabajo de vidrio de ITO, que previamente fue confirmado por una microscopía electrónica o la microscopia confocal4. El curso del tiempo representativo de la producción actual de la S. oneidensis MR-1 durante la formación de una biopelícula de monocapa se muestra en la figura 2. Aunque la corriente altera en...

Aquí presentamos un protocolo de los experimentos electroquímicos celulares para estudiar la contribución del transporte de protones a la velocidad de transporte de electrones extracelular a través de los citocromos de la membrana externa de Shewanella oneidensis MR-1.

Electroquímico detección de deuterio cinético isótopo efecto en extracelular transporte de electrones en la Shewanella oneidensis MR-1

Direct electrochemical detection of c-type cytochrome complexes embedded in the bacterial outer membrane (outer membrane c-type cytochrome complexes; OM ...

El objetivo general de este protocolo es observar la contribución del transporte de protones a la tasa de transporte de electrones extracelulares bacterianos mediante la detección del efecto del isótopo cinético de deuterio. Nuestro método revela el impacto del transporte de protones en la cinética del transporte de electrones extracelulares o EET de las bacterias a un electrodo a través de citocromos de tipo c de membrana externa. Nuestro ensayo refleja el manejo de protones nativos en EET porque utilizamos bacterias vivas en lugar de enzimas purificadas.Sin embargo, nuestro reto consistía en eliminar los ruidos de otros procesos celulares. El efecto del isótopo cinético de deuterio, denominado KIE, es una de las mejores técnicas para examinar la contribución del transporte de protones en el proceso de transporte de electrones asociado. Para cultivar células Shewanella MR-1, transfiera una colonia de células cultivadas en una placa de agar a 15 mililitros de medio LB.Haga crecer las células a 30 grados centígrados durante 24 horas en condiciones aeróbicas con agitación a 160 rpm. Centrifugar la suspensión de la célula a 6.000 veces la gravedad durante 10 minutos. A continuación, vuelva a suspender el pellet celular resultante en 15 mililitros de Defined Medium, suplementado con 10 milimolares de lactato como fuente de carbono y 0,5 gramos por litro de extracto de levadura como oligoelementos para las células.Después de cultivar la suspensión celular aeróbicamente a 30 grados centígrados durante 12 horas con agitación a 160 rpm, centrifugar nuevamente a 6.000 veces la gravedad durante 10 minutos. Lave el pellet de celda resultante dos veces con medio DM por centrifugación durante 10 minutos a 6.000 veces la gravedad antes del experimento electroquímico. Para construir un reactor electroquímico de tres electrodos, coloque un sustrato ITO como electrodo de trabajo en la parte inferior del reactor.A continuación, inserte un cilindro de vidrio y una cubierta de politetrafluoroetileno e inserte un alambre de platino como contraelectrodo. Luego, inserte un electrodo de cloruro de plata en el reactor como electrodo de referencia. A continuación, agregue cuatro mililitros de DM suplementado con lactato de 10 milimolares y 0,5 gramos por litro de extracto de levadura en el reactor electroquímico.Después de confirmar que no hay fugas en el reactor electroquímico, haga fluir el gas nitrógeno en el reactor electroquímico durante 20 minutos para mantener las condiciones aneróbicas dentro del reactor electroquímico. Conecte el reactor electroquímico a un potenciostato y aplique 0,4 voltios positivos al electrodo ITO, manteniendo la temperatura del reactor electroquímico a 30 grados centígrados mediante un sistema de circulación de agua externo. Para realizar el cultivo electroquímico, primero ajuste la densidad celular de la suspensión a una densidad óptica de 1,43 a 600 nanómetros con DM complementado con 10 milimolares de lactato y 0,5 gramos por litro de extracto de levadura.Agregue 0,3 mililitros de la suspensión de la celda al reactor electroquímico a través del puerto de inyección con una jeringa. El diámetro exterior 600 en el reactor cambia a 0,1. Continúe la aplicación de potencial a 0,4 voltios positivos al electrodo ITO durante 25 horas.Detenga la aplicación potencial y desconecte el reactor electroquímico del potenciostato y del sistema de circulación de agua. Fluya el gas nitrógeno en una botella que contenga DM con 10 milimolares de lactato durante 20 minutos para eliminar el oxígeno del medio. Ahora, de forma extremadamente lenta y suave, retire todo el sobrenadante del interior del reactor electroquímico con una jeringa bajo el flujo de gas nitrógeno.A continuación, añadir cuatro mililitros de MS fresca que contenga 10 milimolares de lactato con una jeringa. Incline el reactor electroquímico para eliminar todo el sobrenadante de la pared del reactor. Repita estos pasos tres veces en total.Detenga el flujo de gas y vuelva a conectar el reactor electroquímico al potenciostato, aplicando un positivo de 0,4 voltios al electrodo ITO a 303 Kelvin. Confirmar que la producción actual de una biopelícula monocapa de Shewanella MR-1 es estable y no aumenta rápidamente. Si la corriente aumenta bruscamente, espere hasta que la corriente se estabilice con un aumento del 5% durante 10 minutos.Extremadamente lenta y suavemente, agregue 40 microlitros de D2O anóxico al 50 por ciento de volumen en el reactor electroquímico usando una jeringa de tal manera que la concentración sea del 0,5 por ciento de volumen de D2O en el reactor. Para evitar daños en la biopelícula por la adición de D20, inyecte el D2O gota a gota. Espere a que la corriente se estabilice y, posteriormente, agregue el D2O hasta el 4,4 por ciento de volumen para obtener el valor KIE, que es la relación entre la producción de corriente y la presencia de D2O y H2O.Compruebe el efecto del mismo volumen de adición de H2O en la producción actual. Aquí, la línea continua es el resultado representativo del cambio de corriente microbiana inducido por la adición de D2O. La adición de D2O disminuyó drásticamente la corriente microbiana en 10 segundos, mientras que H20 casi no tuvo disminución de corriente como se muestra con la línea punteada.Para confirmar que la disminución de corriente observada por D2O es atribuible al transporte de electrones a través de los citocromos de la membrana externa, se utilizó un mediador de electrones difuso. En este caso, la adición de 100 micromolares de alfa-AQS aumentó la producción actual en más de cinco veces, y la producción actual no se vio afectada por la adición de D2O. Estos resultados indican que la cinética de las reacciones metabólicas es lo suficientemente rápida como para que el proceso de transferencia de electrones extracelular sea limitante de la velocidad.Un método alternativo para evaluar esto es la adición de la molécula de flavina en el reactor electroquímico. Un aumento instantáneo de la corriente anódica por adición de flavina indica una limitación de velocidad por el proceso de transporte de electrones a través de los citocromos de la membrana externa. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo examinar el efecto cinético de los isótopos en el proceso de transporte de electrones extracelulares.El punto más crítico para obtener con éxito el efecto cinético del isótopo es aclarar y confirmar la condición en la que el transporte de electrones a través de los citocromos de la membrana externa limita la tasa de producción de corriente. En este video, presentamos dos métodos para confirmar esta condición, la observación del cambio de corriente por adición de flavina y por la adición de un mediador adicional difusor, como alfa-AQS. Una vez confirmada la limitación de la tasa, este sistema puede utilizarse no sólo para el experimento con deuterio, sino también para la caracterización bioquímica de los citocromos de la membrana externa.Además, este protocolo podría ser aplicable al examen de otros microbios electroactivos, siempre que el proceso de transporte de electrones extracelulares sea limitante en la velocidad. Nuestra metodología proporciona una técnica básica y general para investigar el proceso de transporte de electrones extracelulares a través de citocromos de membrana externa in vivo.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Biochemistry

Bioquímica

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Fuente: Tokunou, Y., et al, Detección electroquímica del efecto del isótopo cinético de deuterio sobre el transporte de electrones extracelulares en Shewanella oneidensis MR-1. J. Vis. Exp. (2018)Este video demuestra un método electroquímico de célula completa para evaluar cómo la transferencia de protones afecta el transporte extracelular de electrones (EET) en bacterias electroactivas. Al reemplazar los protones con deuterones usando óxido de deuterio, el método mide los cambios en la...

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Electroquímico detección de deuterio cinético isótopo efecto en extracelular transporte de electrones en la Shewanella oneidensis MR-1 (Video) | JoVE Journal

Electroquímico detección de deuterio cinético isótopo efecto en extracelular transporte de electrones en la Shewanella oneidensis MR-1

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