Name: Metas de GPC3 tienen anticuerpos, GPC3-S-Fab, con potente citotoxicidad (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-07-12T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 13 s
Description: Aprende a producir el anticuerpo biespecífico GPC3-S-Fab en Escherichia coli y evaluar su citotoxicidad contra células de cáncer hepático positivas para GPC3. Este protocolo simplifica la purificación para aplicaciones terapéuticas.

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Este trabajo fue apoyado financieramente por el R & D Plan de la provincia de Guangdong (PR China) (2016A050503028).

Todos los procedimientos incluyendo la colección de sangre humana fueron aprobados por el Comité de ética de Universidad de Yat-sensor del sol.
1. estrategia de diseño GPC3-S-Fab
<ol><li>Diseño GPC3-S-Fab vinculando un Fab de anti-GPC3 (humanizado GC3313) con una anti-CD16 VHH14 (figura 1).</li>
	<li>Sintetizar y clonar el VH-CH1-CD16-VHH y VL-CL en los vectores pET26b y pET21a como previamente divulgados12.</li>
</ol>2. transformación y cultura
<ol><li>Añadir 100 ng de pET26b que contiene VH-CH1-CD16 (figura 1A) y 100 ng de pET21a con VL-CL (figura 1A) en 100 μl de competentes BL21 (DE3) células. Incubar en hielo durante 30 minutos incubar en un baño de agua de 42 ° C durante 45-90 s, transferencia, mezcla bien e incubar en hielo durante 3-5 minutos.</li>
	<li>Añadir 500 μl de medio de caldo (LB) Lisogenia en un tubo que contiene BL21 (DE3) de las células y luego incubar a 37 ° C, 150 rpm durante 45-60 minutos difundir 100 μl de BL21 (DE3) células en LB-agar las placas que contienen 50 μg/mL de kanamicina y 100 μg/mL de ampicilina y luego incubar a 37 ° C durante 12-16 h.<ol>
<li>Preparación de medio de caldo (LB) Lisogenia: 1% wt/vol triptona, extracto de levadura 0.5% wt/vol, 1% wt/vol NaCl.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Inocular las células de una sola Colonia en 5 mL de medio de caldo super (SB) que contiene 50 μg/mL de kanamicina y 100 μg/mL de ampicilinay de cultivo a 37 ° C, 220 rpm, durante la noche. Entonces, inocular 1 mL de cultivo en 100 mL de medio de SB que contiene 50 μg/mL de kanamicina y 100 μg/mL de ampicilina y de cultivo a 37 ° C, 220 rpm durante 4 horas. Luego, transferir 10 mL del cultivo en 1 L de medio de SB que contiene 50 μg/mL de kanamicina y 100 μg/mL de ampicilina y de cultivo a 37 ° C, 220 rpm.<ol>
<li>Preparación de medio de caldo super: 3,2% wt/vol triptona, extracto de levadura 2% wt/vol, 0.5% wt/vol NaCl.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Cuando el OD600 alcanza 0.6 - 0.8, añadir isopropil-b-D-thio-galactopiranosida (IPTG) a una concentración final de 0,2 mM. Cultura a 16 ° C, 180 rpm durante 36-48 h para la expresión periplasmic.</li>
</ol>3. GPC3-S-Fab Periplasmic purificación
<ol><li>Preparación de periplasmic fracción<ol>
<li>Recoger las células por centrifugación a 4.000 x g, 4 ° C por 30 min, descartar el medio y pesan las células.</li>
		<li>Resuspender las células completamente en 4 mL de solución de sacarosa helada (20 mM Tris-HCl, pH 7,5; 25% (peso/vol) de sacarosa y 1 mM EDTA) por gramo de las células e incubar en hielo por 15 min.</li>
		<li>Centrifugue a 8.500 x g (centrífuga de mesa, rotor de ángulo fijo), 4 ° C para 20 minutos Retire el sobrenadante (fracción de sacarosa) y guardarla en el hielo.</li>
		<li>Resuspender el pellet en una mezcla de helado 5 mM de MgCl2 y 1 mM PMSF (4 mL por gramo de células). Agregar 40 μl de la acción de la lisozima (15 mg/mL) por gramo e incubar en hielo durante 30 minutos.</li>
		<li>Centrifugue a 8.500 x g (centrífuga de mesa, fijada rotor angular), 4 ° C durante 20 min transferencia el sobrenadante (fracción periplasmic) y guárdelo en el hielo.</li>
		<li>Combinar la sacarosa fracción y fracción periplasmic y centrifugue a 30.000 x g, 4 ° C para 30 minutos Retire el sobrenadante y guardarlo en un tubo cónico de 50 mL en hielo.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Purificación de la afinidad de ni-NTA<ol>
<li>Resuspender 1 mL de agarosa de Ni-NTA mezclando bien para lograr una suspensión homogénea, retirar 1 mL de agarosa de Ni-NTA a un tubo cónico de 15 mL fresco y añadir el tampón de equilibrado de volumen (CV) de columna 10 (25 mM de Tris-HCl, pH 7,5; 1 M de NaCl) se equilibren.</li>
		<li>Centrifugar a 400 x g durante 5 minutos y retire con cuidado el sobrenadante. Luego, añada la agarosa de Ni-NTA en el tubo de 50 mL que contiene la sacarosa fracción y fracción periplasmic. Roca a 4 ° C por 2 h.</li>
		<li>Centrifugar la mezcla a 400 x g, 4 ° C por 5 minutos Retire con cuidado el sobrenadante a otro tubo helado fresco como la fracción no unida. Transferencia de la agarosa de Ni-NTA en una columna de gravedad.</li>
		<li>Añadir 10 CV de tampón de lavado (25 mM de Tris-HCl, pH 7,5; 1 M de NaCl, 20 mM, 30 mM o 40 mM de imidazol) a la columna y recoger el elute como la fracción de lavado. Nota: Estas soluciones se deben agregar en orden creciente de concentraciones de imidazol.</li>
		<li>Añadir 3 CV de elución a la columna de búfer (25 mM de Tris-HCl, pH 7,5; 300 mM de NaCl, 100 mM, 200 mM, 300 mM o 400 mM de imidazol) y recoger el elute como fracción de elución 1, 2, 3 y 4. Nota: Estas soluciones se deben agregar en orden creciente de concentraciones de imidazol.</li>
		<li>Diálisis las fracciones eluídas en 2 L de PBS (137 mM NaCl, 2,7 mM de KCl, 10 mM de Na2HPO4, 2 mM de KH2PO4, pH 7.4) usando tubo de diálisis (12,4 kDa) a 4 ° C por 2 h. comprobar la presencia de GPC3-S-Fab 12% SDS-PAGE y luego por Tinción azul de Coomassie.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Purificación de la afinidad de igG-CH1<ol>
<li>Transferir 1 mL de resina de afinidad de IgG-CH1 en un tubo cónico de 50 mL y los granos con PBS primero. Luego, añada la solución de dializado que contiene GPC3-S-Fab después paso 3.2.6. Roca a 4 ° C por 2 h.</li>
		<li>Centrifugar a 400 x g durante 5 min, 4 ° C. Con cuidado quite el sobrenadante a otro tubo helado fresco y transferencia de la resina a una columna de gravedad.</li>
		<li>Añadir 10 CV de lavado (PBS) de búfer a la columna y recoger la elución como la fracción de lavado.</li>
		<li>Preparar los tubos de la colección agregando 1 M Tris pH 9.0 (0,1 mL de cada fracción eluída por mL). Eluir con tampón de elución de 3 CV (0,1 M de glicina-HCl, pH 2.7) y recoger la fracción eluída; Repita 3 veces.</li>
		<li>Diálisis las fracciones eluídas en 2 L de PBS utilizando tubo de diálisis (12,4 kDa) a 4 ° C por 2 h. repetición dos veces.</li>
		<li>Determinar la concentración de proteína ultramicrospectrophotometer (coeficiente de extinción Molar: 91105. 1 A280 = 0,69 mg/L).</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. SDS-PAGE y Western-blotting análisis
<ol><li>Tomar 10 μl de la muestra en 5 x buffer de carga SDS y mezclar bien. Hervir la mezcla de proteína en 100 ° C durante 5 minutos.<ol>
<li>Preparar 5 x buffer de carga SDS: 250 mM de Tris-HCl, pH 6.8, 10% wt/vol SDS, 0,5% wt/vol azul de bromofenol, glicerol al 50% vol/vol, 5% vol/vol beta-mercaptoetanol.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Preparar un gel de SDS-PAGE con una carga de gel (5%) y el gel de separación (12%) como se describió anteriormente26,27,28.</li>
	<li>Cargar 10 μl de la mezcla de proteína hervida y marcador de proteína y ejecutar el SDS-PAGE.</li>
	<li>Manchar el gel por agitación durante 20 minutos con solución de azul brillante de Coomassie y entonces realizar la extracción.</li>
	<li>Para western blot, después de la transferencia a una membrana PVDF, bloquear la membrana con TBST (20 mM Tris-HCl, 150 mM de NaCl, 0,1% vol/vol Tween 20) + 5% wt/vol descremada leche por 1 h a temperatura ambiente agitando.</li>
	<li>Incubar la membrana con anticuerpos primarios (anti-su o Anti-Flag) diluido 1:2,000 en TBST + 5% de leche descremada de 1 h.</li>
	<li>Lavar con TBST por 5 min a temperatura ambiente y repita 3 veces.</li>
	<li>Incubar la membrana en 1:2,000 de anticuerpo secundario (ligados por la HRP anti-ratón Fc del anticuerpo) diluido en TBST + 5% de leche descremada de 1 h.</li>
	<li>Lavar con TBST por 5 min a temperatura ambiente y repita 3 veces.</li>
	<li>Añadir 1 mL de HPR sustrato por la película, desarrollar y tomar imágenes.</li>
</ol>5. gel filtración análisis
<ol><li>Utilice la siguiente columna: volumen de columna de 24 mL; Tampón de equilibrado de pH PBS 7,4; Tasa de flujo de 0,5 mL/min en sitio templado; Volumen de 200 μL de muestra.</li>
	<li>Utilice el siguiente volumen de proteína y la concentración: 500 μl de 1,2 mg/mL GPC3-S-Fab. Centrifugue a 20.000 x g durante 30 min y tomar 200 μL para la carga.</li>
	<li>Para la proteína marcador volumen y concentración, tomar 100 μl de citocromo C (2 mg/mL, kDa 12,4), 140 μl de anhidrasa carbónica (3 mg/mL, 29 kDa), 140 μl de albúmina (10 mg/mL, 66 kDa) y 200 μL de alcohol deshidrogenasa (5 mg/mL, 150 kDa) en un tubo. Centrifugue a 20.000 x g durante 30 min y tomar 200 μL para la carga.</li>
	<li>Antes de cada serie, lave con al menos 2 CV de agua destilada a un flujo de 0,5 mL/min.</li>
	<li>Equilibrar la columna con al menos 2 CV de tampón de equilibrado (PBS, pH 7,4) a una velocidad de flujo de 0,5 mL/min.</li>
	<li>Automáticamente le inyecte la muestra de 0,5 mL/min para cargar la muestra.</li>
	<li>Eluir con tampón de equilibrado a 0,5 mL/min y detección a 280 y 215 nm.</li>
</ol>6. Análisis de citometría de flujo de
<ol><li>Cultura la HepG2 Hep3B (GPC3 positivo), Huh7 (GPC3 positivos), (GPC3 positivo) y células MHCC - 97H (GPC3 negativo) en platos de plástico de 100 mm x 20 mm con medio DMEM con 10% suero bovino fetal (FBS), penicilina (100 μg/mL) y estreptomicina (50 μg/mL) a 37 ° C, 5% CO2.</li>
	<li>Células CHO (GPC3 negativo) de la cultura y las células CHO/GPC3 albergando el cDNA humano de GPC3 integral (GPC3 positivo) en platos de plástico de 100 mm x 20 mm con Medio RPMI 1640 con 10% FBS, penicilina (100 μg/mL) y estreptomicina (50 μg/mL) a 37 ° C, 5% CO2.</li>
	<li>La cultura la NK92/CD16 albergando el cDNA humano integral de CD16 (CD16 positivas) en frasco de2 de 25cm que contenga el Medio RPMI 1640 con 10% FBS, penicilina (100 μg/mL) y estreptomicina (50 μg/mL) a 37 ° C, 5% CO2.</li>
	<li>Cuando las células son 70-90% confluente, deseche el medio y lavar las células con 2 mL de PBS. Añadir 1 mL de tripsina 0,25% e incubar a 37 ° C durante 2-3 minutos (o hasta que las células comiencen a separarse de la superficie). Añadir 1 mL del medio de crecimiento completa para neutralizar la tripsina y resuspender las células transfiriendo suavemente hacia arriba y hacia abajo.</li>
	<li>Contar el número de celular utilizando un hemocitómetro de Neubauer y detectar la viabilidad de las células por el azul de tripano.</li>
	<li>Recoger 3 x 106 células de cada línea celular. Añadir 1 mL de PBS + 0.2% de BSA para resuspender las células. Centrífuga x 200 g, 4 ° C por 5 minutos repetir dos veces.</li>
	<li>Agregar 0,3 mL de PBS + 0.2% de BSA para resuspender las células y transferir 100 μl (aproximadamente 1 millón) a cada tubo 5 mL de fondo redondo poliestireno. Nota: Asegúrese de que todos los pasos desde aquí a los tubos deben conservarse frío en hielo. El anticuerpo es vinculante para el antígeno de superficie de la célula, el complejo empieza a interiorizar. Manteniéndolo frío, el proceso se ralentiza considerablemente.</li>
	<li>Añadir 10 μl de anticuerpos primarios (GPC3-S-Fab o humano IgG1, concentración final 5 μg/mL) a cada tubo e incubar en hielo durante 1 hora.</li>
	<li>Añadir 1 mL de PBS + BSA de 0,2% a lavado y centrifugar a 200 x g, 4 ° C por 5 min repetir tres veces.</li>
	<li>Resuspender en 100 μl de PBS + 0.2% BSA, Añadir 0,5 μl de anticuerpo secundario (anti-humano IgG(H+L)-488, final concentración de 10 μg/mL) e incubar en hielo por 1 h. Nota: de este paso, por favor mantenga las células de la luz.</li>
	<li>Añadir 1 mL de PBS + BSA de 0,2% a lavado y centrifugar a 200 x g, 4 ° C por 5 min repetir tres veces.</li>
	<li>Análisis de las células por citometría de flujo según el protocolo estándar29. Adquirir las células con láser 488 nm para la excitación.</li>
</ol>7. citotóxicos ensayos
<ol><li>Preparación de las células del tumor.<ol>
<li>Cultura HepG2, Hep3B, Huh7, MHCC - 97H y CHO de células como se describe en pasos 6.1-6.5.</li>
		<li>Diluir las células 0,5/ml de5× 10 y 100 μl (células 5.000 por pozo) en placas de 96 pocillos de la placa. 6-8 h para permitir que las células unir la cultura.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Preparar las células mononucleares de sangre periférica (PBMCs).<ol>
<li>Diluir sangre fresca preparada con un volumen igual de PBS en un tubo cónico de 50 mL. Por ejemplo, diluir 10 mL de sangre con 10 mL de PBS.</li>
		<li>Tomar 15 mL de medio de separación de linfocitos en un tubo cónico de 50 mL fresco. Transferencia de la sangre diluida en el medio de separación de linfocitos a lo largo del lado del tubo lentamente. Nota: Mantenga el tubo vertical. No rompa la superficie del medio de separación de linfocitos.</li>
		<li>Centrifugar a 400 x g durante 35 min a temperatura ambiente con el freno de.</li>
		<li>Lentamente retire la capa superior de plasma y tomar la capa de blancos de la sangre que contiene PBMCs en la interfaz medio de separación de linfocitos de plasma.</li>
		<li>Diluir del PBMCs con un doble volumen de PBS + 2% FBS. Centrifugar a 400 x g durante 5 minutos.</li>
		<li>Lavan las células dos veces con PBS + 2% FBS. Centrifugar a 400 x g durante 5 minutos cuenta el número de células como se describe en el paso 6.5.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Preparación de las células NK.<ol>
<li>Preparar la suspensión de PBMCs en una concentración de 5 x 107 células/mL en PBS + 2% FBS y el lugar en un tubo de fondo redondo poliestireno de 5 mL.</li>
		<li>Añadir células NK humanas enriquecimiento cóctel 50 μl/ml de células. Mezcla bien e incubar a temperatura ambiente durante 10 minutos.</li>
		<li>Resuspender las partículas magnéticas de la célula NK kit de enriquecimiento y mezcla bien para que uniformemente se suspenden mediante pipeteo arriba y abajo con fuerza más de 5 veces. Transferencia de las partículas magnéticas resuspendidos en 100 μl/mL de la suspensión de células. Mezcla bien e incubar a temperatura ambiente durante 5 minutos.</li>
		<li>Traer la suspensión de células hasta un volumen total de 2,5 mL agregando PBS + 2% FBS. Mezclar las células en el tubo mediante pipeteo suavemente arriba y abajo 2 - 3 veces. Coloque el tubo (sin tapa) en el imán. Deje que las bolas magnéticas asentarse durante 2,5 min a temperatura ambiente.</li>
		<li>Retirar el imán. En un movimiento continuo, invertir el tubo de vertido de la suspensión de células enriquecidas en un tubo nuevo.</li>
		<li>Contar el número de células como se describe en el paso 6.5.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Establecer la reacción citotóxica.<ol>
<li>Diluir las células NK a 5 × 105 células/mL: usando el medio de cultivo correspondiente. Añadir 100 μl de suspensión de la célula NK a las células del tumor sobre una placa de 96 pocillos.</li>
		<li>Añadir 10 μl de GPC3-S-Fab en diferentes concentraciones, con la mayor dosis a una concentración final de 30 μg/mL, 3-fold dilución, 9 puntos (tres repeticiones).</li>
		<li>Incubar a 37 ° C, 5% CO2 para 72 h.</li>
		<li>Después de 72 h de incubación, quitarlo del medio, añada 100 μl de medio DMEM con 10 μl de reactivo CCK8 a cada pocillo, en placas de 96 pocillos y luego incubar a 37 ° C.</li>
		<li>Leer la placa a 450 nm en 1, 2, 3 y 4 h después de agregar el reactivo CCK8.</li>
		<li>Analizar los datos. Calcular la tasa de supervivencia (OD450 GPC3-S-Fab + efectos + tumor - OD450 medio) / (OD450 tumor - OD450 medio) × 100% y (OD450 GPC3-S-Fab + tumor - OD450 medio) / (OD450 tumor - OD450 medio) × 100%. Las células efectoras son las células NK.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Weiner, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Building+better+monoclonal+antibody-based+therapeutics%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Cancer%22%5BJournal%5D)">Building better monoclonal antibody-based therapeutics.</a> Nature Reviews Cancer. 15 (6), 361-370 (2015).</li>
<li>Rathi, C., Meibohm, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clinical+pharmacology+of+bispecific+antibody+constructs%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Clinical+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">Clinical pharmacology of bispecific antibody constructs.</a> The Journal of Clinical Pharmacology. 55, Suppl 3. S21-S28 (2015).</li>
<li>Weidle, U. H., Kontermann, R. E., Brinkmann, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor-antigen-binding+bispecific+antibodies+for+cancer+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22Seminars+in+Oncology%22%5BJournal%5D)">Tumor-antigen-binding bispecific antibodies for cancer treatment.</a> Seminars in Oncology. 41 (5), 653-660 (2014).</li>
<li>Demarest, S. J., Glaser, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antibody+therapeutics%2C+antibody+engineering%2C+and+the+merits+of+protein+stability%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Drug+Discovery+and+Development%22%5BJournal%5D)">Antibody therapeutics, antibody engineering, and the merits of protein stability.</a> Current Opinion in Drug Discovery and Development. 11 (5), 675-687 (2008).</li>
<li>Mabry, R., Snavely, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Therapeutic+bispecific+antibodies%3A+The+selection+of+stable+single-chain+fragments+to+overcome+engineering+obstacles%5BTitle%5D)+AND+%22IDrugs%22%5BJournal%5D)">Therapeutic bispecific antibodies: The selection of stable single-chain fragments to overcome engineering obstacles.</a> IDrugs. 13 (8), 543-549 (2010).</li>
<li>Rothlisberger, D., Honegger, A., Pluckthun, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Domain+interactions+in+the+Fab+fragment%3A+a+comparative+evaluation+of+the+single-chain+Fv+and+Fab+format+engineered+with+variable+domains+of+different+stability%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Domain interactions in the Fab fragment: a comparative evaluation of the single-chain Fv and Fab format engineered with variable domains of different stability.</a> Journal of Molecular Biology. 347 (4), 773-789 (2005).</li>
<li>Kijanka, M., Dorresteijn, B., Oliveira, S., van Bergen en Henegouwen, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanobody-based+cancer+therapy+of+solid+tumors%5BTitle%5D)+AND+%22Nanomedicine+%28London%29%22%5BJournal%5D)">Nanobody-based cancer therapy of solid tumors.</a> Nanomedicine (London). 10 (1), 161-174 (2015).</li>
<li>Muyldermans, S., Cambillau, C., Wyns, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recognition+of+antigens+by+single-domain+antibody+fragments%3A+the+superfluous+luxury+of+paired+domains%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Biochemical+Sciences%22%5BJournal%5D)">Recognition of antigens by single-domain antibody fragments: the superfluous luxury of paired domains.</a> Trends in Biochemical Sciences. 26 (4), 230-235 (2001).</li>
<li>Gonzalez-Sapienza, G., Rossotti, M. A., Tabares-da Rosa, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-Domain+Antibodies+As+Versatile+Affinity+Reagents+for+Analytical+and+Diagnostic+Applications%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Single-Domain Antibodies As Versatile Affinity Reagents for Analytical and Diagnostic Applications.</a> Frontiers in Immunology. 8, 977(2017).</li>
<li>Fernandes, C. F. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Camelid+Single-Domain+Antibodies+As+an+Alternative+to+Overcome+Challenges+Related+to+the+Prevention%2C+Detection%2C+and+Control+of+Neglected+Tropical+Diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Camelid Single-Domain Antibodies As an Alternative to Overcome Challenges Related to the Prevention, Detection, and Control of Neglected Tropical Diseases.</a> Frontiers in Immunology. 8, 653(2017).</li>
<li>Li, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+bispecific+antibody%2C+S-Fab%2C+induces+potent+cancer+cell+killing%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunotherapy%22%5BJournal%5D)">A novel bispecific antibody, S-Fab, induces potent cancer cell killing.</a> Journal of Immunotherapy. 38 (9), 350-356 (2015).</li>
<li>Li, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+single-domain+antibody-linked+Fab+bispecific+antibody+Her2-S-Fab+has+potent+cytotoxicity+against+Her2-expressing+tumor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22AMB+Express%22%5BJournal%5D)">A single-domain antibody-linked Fab bispecific antibody Her2-S-Fab has potent cytotoxicity against Her2-expressing tumor cells.</a> AMB Express. 6 (1), 32(2016).</li>
<li>Nakano, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anti-glypican+3+antibodies+cause+ADCC+against+human+hepatocellular+carcinoma+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+and+Biophysical+Research+Communications%22%5BJournal%5D)">Anti-glypican 3 antibodies cause ADCC against human hepatocellular carcinoma cells.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 378 (2), 279-284 (2009).</li>
<li>Behar, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+characterization+of+anti-FcgammaRIII+%28CD16%29+llama+single-domain+antibodies+that+activate+natural+killer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Engineering%2C+Design%2C+and+Selection%22%5BJournal%5D)">Isolation and characterization of anti-FcgammaRIII (CD16) llama single-domain antibodies that activate natural killer cells.</a> Protein Engineering, Design, and Selection. 21 (1), 1-10 (2008).</li>
<li>Baral, T. N., Arbabi-Ghahroudi, M. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/22886257">Expression of single-domain antibodies in bacterial systems.</a> Methods in Molecular Biology. 911, 257-275 (2012).</li>
<li>Arbabi-Ghahroudi, M., Tanha, J., MacKenzie, R. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/16408159">Prokaryotic expression of antibodies.</a> Cancer and Metastasis Reviews. 24 (4), 501-519 (2005).</li>
<li>Spiess, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bispecific+antibodies+with+natural+architecture+produced+by+co-culture+of+bacteria+expressing+two+distinct+half-antibodies%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Bispecific antibodies with natural architecture produced by co-culture of bacteria expressing two distinct half-antibodies.</a> Nature Biotechnology. 31 (8), 753-758 (2013).</li>
<li>Filmus, J., Selleck, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glypicans%3A+proteoglycans+with+a+surprise%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Glypicans: proteoglycans with a surprise.</a> Journal of Clinical Investigation. 108 (4), 497-501 (2001).</li>
<li>Baumhoer, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glypican+3+expression+in+human+nonneoplastic%2C+preneoplastic%2C+and+neoplastic+tissues%3A+a+tissue+microarray+analysis+of+4%2C387+tissue+samples%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Clinical+Pathology%22%5BJournal%5D)">Glypican 3 expression in human nonneoplastic, preneoplastic, and neoplastic tissues: a tissue microarray analysis of 4,387 tissue samples.</a> American Journal of Clinical Pathology. 129 (6), 899-906 (2008).</li>
<li>Llovet, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+molecular+signature+to+discriminate+dysplastic+nodules+from+early+hepatocellular+carcinoma+in+HCV+cirrhosis%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">A molecular signature to discriminate dysplastic nodules from early hepatocellular carcinoma in HCV cirrhosis.</a> Gastroenterology. 131 (6), 1758-1767 (2006).</li>
<li>Zhu, Z. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+glypican-3+expression+differentiates+the+majority+of+hepatocellular+carcinomas+from+benign+hepatic+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22Gut%22%5BJournal%5D)">Enhanced glypican-3 expression differentiates the majority of hepatocellular carcinomas from benign hepatic disorders.</a> Gut. 48 (4), 558-564 (2001).</li>
<li>Hsu, H. C., Cheng, W., Lai, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cloning+and+expression+of+a+developmentally+regulated+transcript+MXR7+in+hepatocellular+carcinoma%3A+biological+significance+and+temporospatial+distribution%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Cloning and expression of a developmentally regulated transcript MXR7 in hepatocellular carcinoma: biological significance and temporospatial distribution.</a> Cancer Research. 57 (22), 5179-5184 (1997).</li>
<li>Flaherty, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nonclinical+evaluation+of+GMA161--an+antihuman+CD16+%28FcgammaRIII%29+monoclonal+antibody+for+treatment+of+autoimmune+disorders+in+CD16+transgenic+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicological+Sciences%22%5BJournal%5D)">Nonclinical evaluation of GMA161--an antihuman CD16 (FcgammaRIII) monoclonal antibody for treatment of autoimmune disorders in CD16 transgenic mice.</a> Toxicological Sciences. 125 (1), 299-309 (2012).</li>
<li>Sharma, R., Das, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organ-specific+phenotypic+and+functional+features+of+NK+cells+in+humans%5BTitle%5D)+AND+%22Immunological+Research%22%5BJournal%5D)">Organ-specific phenotypic and functional features of NK cells in humans.</a> Immunological Research. 58 (1), 125-131 (2014).</li>
<li>Li, X. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+CD16a%2C+the+surface+receptor+of+Kupffer+cells%2C+on+the+growth+of+hepatocellular+carcinoma+cells%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Medicine%22%5BJournal%5D)">Effect of CD16a, the surface receptor of Kupffer cells, on the growth of hepatocellular carcinoma cells.</a> International Journal of Molecular Medicine. 37 (6), 1465-1474 (2016).</li>
<li>Fiala, G. J., Schamel, W. W., Blumenthal, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blue+native+polyacrylamide+gel+electrophoresis+%28BN-PAGE%29+for+analysis+of+multiprotein+complexes+from+cellular+lysates%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Blue native polyacrylamide gel electrophoresis (BN-PAGE) for analysis of multiprotein complexes from cellular lysates.</a> Journal of Visualized Experiments. (48), (2011).</li>
<li>Hwang, A. C., Grey, P. H., Cuddy, K., Oppenheimer, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pouring+and+running+a+protein+gel+by+reusing+commercial+cassettes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Pouring and running a protein gel by reusing commercial cassettes.</a> Journal of Visualized Experiments. (60), (2012).</li>
<li>Laemmli, U. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cleavage+of+structural+proteins+during+the+assembly+of+the+head+of+bacteriophage+T4%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4.</a> Nature. 227 (5259), 680-685 (1970).</li>
<li>Menon, V., Thomas, R., Ghale, A. R., Reinhard, C., Pruszak, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow+cytometry+protocols+for+surface+and+intracellular+antigen+analyses+of+neural+cell+types%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Flow cytometry protocols for surface and intracellular antigen analyses of neural cell types.</a> Journal of Visualized Experiments. (94), (2014).</li>
<li>Feng, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Therapeutically+targeting+glypican-3+via+a+conformation-specific+single-domain+antibody+in+hepatocellular+carcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Science+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Therapeutically targeting glypican-3 via a conformation-specific single-domain antibody in hepatocellular carcinoma.</a> Proceedings of the National Academy of Science U S A. 110 (12), E1083-E1091 (2013).</li>
</ol>

Los autores no declaran conflictos de interés.

En este estudio, presentamos una estrategia para la construcción de un nuevo formato de la bsAbs, GPC3-S-Fab, que puede reclutar las células NK a las células del tumor positivo GPC3. S-Fab se basa en la Fab natural formato añadiendo una anti-CD16 VHH11,12. En comparación con la región de Fc que contienen bsAbs, GPC3-S-Fab puede fácilmente producir en el periplasma de bacterias en gran escala.
Utilizando la estrategia de expresión y pur...

Anticuerpos monoclonales se utilizan ampliamente para el tratamiento de cáncer1. Debido a la flexibilidad de los anticuerpos, se han explorado activamente varios formatos basados en anticuerpos. En comparación con los anticuerpos monoclonales, bsAbs tienen dos módulos de enlace de antígeno diferentes, lo que les permite reconocer dos objetivos diferentes simultáneamente y eficiente accionar el reclutamiento de las células efectoras inmunes para atacar y matar a las células de tumor2.
Formatos actuales bsAb recombinantes pueden ser asignados generalmente a dos clases: bsAbs que contiene Fc y bsAbs sin una región Fc. En comparación con formatos que contienen el Fc que se producen sobre todo en células de mamíferos, bsAbs sin una región Fc tienen las ventajas de menor tamaño, se producen más fácilmente en sistemas de expresión de microorganismos y puede penetrar los tejidos del tumor más eficientemente 3.
bsAbs sin una región Fc comúnmente se forman uniendo partes de enlace individuales, tales como fragmentos de variable de cadena simple (scFvs) o Fab3. Sin los dominios estabilizadoras bsAbs basados a menudo en fragmentos scFv han comprometido estabilidad térmica, baja solubilidad y un potencial aumento de agregación4,5. En cambio, son más estables debido al heterodimerization de CH1 y CL en la parte nativa de la Fab4,6bsAbs basada en Fab.
Dominio variable de la pesado-cadena-sólo anticuerpos (VHHs, también conocidos como anticuerpos de dominio único) es el fragmento de unión a antígeno activado de anticuerpos de cadena pesada natural7. VHHs tiene las características de alta afinidad, especificidad de IgGs convencionales8, inmunogenicidad baja y altos rendimientos en expresión bacteriana9. En comparación con fragmentos Fv, VHHs tienen mayor estabilidad térmica10. En comparación con fracciones Fab, VHHs tienen tamaños más pequeños debido a la falta de CH1 y CL. Por lo tanto, S-Fab, el formato bsAb obtenido mediante la vinculación de la Fab con un anticuerpo de dominio único, VHH, fue diseñado y estudiado por sus efectos antitumorales11,12.
En este estudio, se describe la construcción de GPC3-S-Fab vinculando la Fab de hGC3313 con un anti-CD16a VHH14 . La Fab GPC3-S puede producir eficientemente por periplasmic expresión en Escherichia coli (e. coli). Estudios funcionales de GPC3-S-Fab sugieren que GPC3-S-Fab es una estrategia prometedora para el tratamiento de cáncer de hígado. Así, las ventajas de GPC3-S-Fab sobre técnicas alternativas con referencias aplicables a estudios anteriores incluyen fácil producción y purificación y más estable bsAbs.
Sistemas de expresión mamífero y sistemas de expresión procariotas se han utilizado para expresar diversos formatos de la BsAbs. En contraste con sistemas de expresión mamífero, e. coli-sistemas de expresión de proteínas en base tienen muchos beneficios, incluyendo alto rendimiento, bajo costo y ahorro de trabajo, la facilidad de manipulación genética y transformación alta eficiencia15. Para la bsAbs expresión en e. coli, hay dos estrategias básicas: expresión en el citoplasma y la expresión en el periplasma entre el citoplasma y el exterior de las membranas celulares15. Comparado con el ambiente reductor del citoplasma, el periplasma es un oxidante más ambiente, que promueve el correcto plegamiento y coexpresión de proteínas16. Plegamiento correcto juega un papel clave en la generación de solubilidad, la estabilidad y la función de la bsAbs. Por lo tanto, ha añadido un pelB de secuencia señal N-terminal de la S-Fab para dirigir la secreción en el periplasma de e. coli17. Para asegurar correcto plegamiento, solubilidad, estabilidad térmica y estabilidad conformacional, reduciendo la complejidad y el tamaño de un anticuerpo es empleado con frecuencia16. El formato S-Fab consta de una fabulosa y un VHH, que se expresa muy bien en sistemas bacterianos probablemente debido a la estructura simple y tamaño pequeño.
GPC3 fue elegido en este formato de anticuerpo tienen GPC3-S-Fab. Glypican-3 (GPC3) es un miembro de la familia de proteoglicanos de sulfato (HS) de heparina que está anclada a la superficie de la célula a través de glicosilfosfatidilinositol (GPI)18. GPC3 es sobreexpresada en el 70% de los casos de carcinoma (HCC) hepatocelular, que representan la mayoría de los cánceres del hígado19,20,21,22. Porque GPC3 raramente se expresa en los tejidos normales, GPC3 se ha propuesto como un objetivo potencial para el CHC. Se han producido múltiples ratón mAbs contra GPC3. Sin embargo, sólo GC33 exhiben actividad antitumoral limitada 22y no pudo exhibir la eficacia clínica en pacientes. En este estudio, GPC3-S-Fab fue demostrado para ser capaz de reclutar las células NK para matar GPC3 tumor células14.
Para reclutar a las células NK, se utilizó anti-CD16 VHH. CD16a es un receptor de IgG de baja afinidad, expresado principalmente en las células natural killer (NK), macrófagos, monocitos y algunos subtipos de células T. Está implicado en la citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos (CMCDA) por las células NK23. Las células NK humanas pueden clasificarse en dos tipos, CD56 - CD16 + y CD16 + CD56-. En contraste con las células NK CD56 + CD16−, CD56-las células NK CD16 + pueden liberar niveles más altos de perforin y granzyme B y así presentan una citotoxicidad fuerte24. Las células de Kupffer (KCs), expresando CD16a, son los macrófagos residentes en el hígado. Las células de Kupffer juegan un papel importante en la supresión del cáncer de hígado25. Así, la bsAbs targeting CD16a puede ser una estrategia más prometedora que la participación de células T contra el cáncer de hígado.

<table><tbody><tr><td>incubadora de agitación</td><td>Thermo Fisher</td><td>MAXQ 4000</td><td></td></tr><tr><td>incubadora de agitación</td><td>Zhicheng</td><td>ZWYR-D2402</td><td></td></tr><tr><td>Centrífuga</td><td>Cence</td><td>GL-10MD</td><td></td></tr><tr><td>Centrífuga</td><td>Beckman Coulter</td><td>Avanti J-26S Centrífuga XPI</td><td></td></tr><tr><td></td><td>eppendorf</td><td>5810R</td><td></td></tr><tr><td>Espectrofotómetro ultravioleta</td><td>Thermo Fisher</td><td>Nanodrop</td><td></td></tr><tr><td>Aparato analítico de electroforesis en gel de poliacrilamida</td><td>Mini-PROTEAN&reg; Aparato Tetra</td><td>Bio-rad</td><td></td></tr><tr><td>Trans-blot</td><td>Criterion</td><td>Bio-rad Sistema de imagen Bio-rad</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td>chemidoc tm XRS+</td><td></td></tr><tr><td>Fast Protein Cromatograma líquido</td><td>GE Healthcare</td><td>Columna AKTA avant</td><td></td></tr><tr><td>GF</td><td>GE Healthcare</td><td>28-9909-44 Superdex 200 Increase 10/300 GL</td><td></td></tr><tr><td>Citómetro de flujo</td><td>Beckman</td><td>Centrífuga FC500</td><td></td></tr><tr><td></td><td>eppendorf</td><td>5702R</td><td></td></tr><tr><td>Envision lector de placas</td><td>TECAN</td><td>Infinite F50</td><td></td></tr><tr><td>Anti His-tag</td><td>eBioscience</td><td>14-6657-82</td><td></td></tr><tr><td>anti-Flag-tag</td><td>Sigma</td><td>F1804</td><td></td></tr><tr><td>anti-humano (H& L)-488</td><td>A11013</td><td>Invitrogen</td><td></td></tr><tr><td>Anticuerpo ligado a HRP IgG de ratón</td><td>Cell Signaling</td><td>7076S</td><td></td></tr><tr><td>Ni-NTA-Agarose</td><td>Tribioscience</td><td>TBS9202-100</td><td></td></tr><tr><td>IgG-CH1 resina de afinidad</td><td>Thermo Fisher</td><td>194320005</td><td></td></tr><tr><td>Ficoll-Plaque Plus GE</td><td>Healthcare</td><td>17-1440-03</td><td></td></tr><tr><td>Kit de enriquecimiento de células NK</td><td>Stemcell</td><td>19055</td><td></td></tr><tr><td>Célula madre</td><td>magnética</td><td>18000</td><td></td></tr><tr><td>CCK8 kit</td><td>Dojindo</td><td>CK04</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Gibco</td><td>C11995500CP</td><td></td></tr><tr><td>RPMI-1640</td><td>Gibco</td><td>C11875500CP</td><td></td></tr><tr><td>Suero Fetal Bovino (FBS)</td><td>Sigma</td><td>F2442</td><td></td></tr><tr><td>Tripsina</td><td>Gibco</td><td>15050-057</td><td></td></tr><tr><td>Penicilina-estreptomicina</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td>Cultivo celular</td></tr><tr><td>Marcador patrón</td><td>Sigma Aldrich MWGF200</td><td></td><td>Filtración en gel</td></tr><tr><td>Isopropil-b-D-tio-galactopiranósido (IPTG)</td><td>Productos químicos de VWR</td><td>VWRC0487-100G</td><td></td></tr><tr><td>Tubo de diálisis</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D0655-100FT</td><td></td></tr><tr><td>Knanamycina</td><td>VWR</td><td>VWRC0408-100G</td><td></td></tr><tr><td>Ampicilina</td><td>VWR</td><td>VWRC0339-100G</td><td></td></tr><tr><td>Triptona</td><td>Thermo Fisher</td><td>LP0042B</td><td></td></tr><tr><td>Extracto de levadura</td><td>Thermo Fisher</td><td>LP0021B</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sangon Biotech</td><td>A100241</td><td></td></tr><tr><td>Trizma base</td><td>Sigma</td><td>Aldrich T6791-1KG</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma Aldrich</td><td>V900106</td><td></td></tr><tr><td>Glicina</td><td>aladdin</td><td>A110752-500g</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>aladdin</td><td>P112134-500g</td><td></td></tr><tr><td>MgCl</td><td>Sigma Aldrich V900020</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Agar</td><td>Sangon Biotech</td><td>A505255-0250</td><td></td></tr><tr><td>Fosfato de potasio, monobásico anhidro (KH2PO4)</td><td>VWR</td><td>7778-77-0</td><td></td></tr><tr><td>Fosfato de sodio, dibásico, anhidro (Na2HPO4)</td><td>VWR</td><td>7558-79-4</td><td></td></tr><tr><td>2-Mercaptoetanol</td><td>VWR</td><td>60-24-2</td><td></td></tr><tr><td>Fluoruro de fenilmetilsulfonilo (PMSF)</td><td>VWR</td><td>329-98-6</td><td></td></tr><tr><td>Lisozima</td><td>Sigma Aldrich</td><td>L6876-25G</td><td></td></tr><tr><td>Coomassie Azul Brillante R250</td><td>VWR</td><td>VWRC0472-50G</td><td></td></tr><tr><td>Azul de bromofenol</td><td>Sangon Biotech</td><td>A500922-25G</td><td></td></tr><tr><td>Albúmina sérica bovina (BSA)</td><td>VWR</td><td>VWRC0332-100G</td><td></td></tr><tr><td>Glycerol</td><td>Sigma Aldrich</td><td>V900122</td><td></td></tr><tr><td>plato de plástico de 100 mm x 20 mm</td><td>Matraz de</td><td></td> 430167 <td></td></tr><tr><td>Corning de 25 cm2</td><td>Corning</td><td>430639</td><td></td></tr><tr><td>clúster de cultivo celular de 96 pocillos</td><td>Corning</td><td>3599</td><td></td></tr><tr><td>Sacarosa</td><td>Sangon Biotech</td><td>A610498-0005</td><td></td></tr><tr><td>CHO</td><td>La Colección de Cultura Tipo de la Academia China de Ciencias</td><td>GNHa 3</td><td></td></tr><tr><td>MHCC-97H</td><td>La Colección de Cultura Tipo de la Academia</td> China de Ciencias <td>SCSP-528</td><td></td></tr><tr><td>HepG2</td><td>La Colección de Cultura Tipo de la Academia China de Ciencias</td><td>TCHu 72</td><td></td></tr><tr><td>Huh7</td><td>La Colección de Cultura Tipo de la Academia China de Ciencias</td><td>TCHu182</td><td></td></tr><tr><td>Hep3B</td><td>la Colección de Cultura Tipo de la Academia China de Ciencias</td><td>TCHu106</td><td></td></tr><tr><td>NK92</td><td>ATCC</td><td>CRL2408</td><td></td></tr></tbody></table>

metas de gpc3 tienen anticuerpos, gpc3-s-fab, con potente citotoxicidad

A GPC3-targeting Bispecific Antibody, GPC3-S-Fab, with Potent Cytotoxicity

Este protocolo describe la construcción y estudios funcionales de un anticuerpo tienen (bsAb), GPC3-S-Fab. bsAbs puede reconocer dos epitopos diferentes a través de sus dos brazos diferentes. bsAbs han sido estudiados activamente por su capacidad para contratar directamente a las células inmunes para matar las células tumorales. Actualmente, la mayoría de la bsAbs se produce en forma de proteínas recombinantes, como que contiene Fc bsAbs o como pequeños bsAb derivados sin la región Fc. En este estudio, GPC3-S-Fab, un anticuerpo de base tienen anticuerpos fragmento (Fab), fue diseñado por vincular la Fab del anticuerpo anti-GPC3 GC33 con un anticuerpo de anti-CD16 solo dominio. GPC3-S-Fab puede ser expresado en Escherichia coli y purificado de dos cromatografías de afinidad. GPC3-S-Fab purificado puede específicamente unirse a y matar a las células de cáncer de hígado positivo GPC3 reclutando células de asesino naturales, lo que sugiere una posible aplicación de GPC3-S-Fab en terapia de cáncer de hígado.

Purificación de GPC3-S-Fab
GPC3-S-Fab fue purificada de e. coli por una purificación de la afinidad de dos etapas, primero con Ni-NTA-agarosa, seguido por la purificación de la afinidad de IgG-CH1. Después de la purificación de la afinidad de dos etapas, GPC3-S-Fab fue purificada a homogeneidad con las dos cadenas cerca de 1:1 (figura 2A). La presencia de polipéptidos VHH C...

Aquí, presentamos un protocolo para producir un anticuerpo tienen GPC3-S-Fab en Escherichia coli. GPC3-S-Fab purificado tiene potente citotoxicidad contra las células de cáncer de hígado positivo GPC3.

Metas de GPC3 tienen anticuerpos, GPC3-S-Fab, con potente citotoxicidad

This protocol describes the construction and functional studies of a bispecific antibody (bsAb), GPC3-S-Fab. bsAbs can recognize two different epitopes ...

Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de los anticuerpos biespecíficos, como cómo producir un anticuerpo biespecífico en bacterias y determinar la función del anticuerpo purificado. La principal ventaja de esta técnica es que GPC3-S-Fab se puede producir y purificar fácilmente a partir de E. coli. Para preparar la fracción periplásmica, primero centrifugar la suspensión celular a 4.000 g durante 30 minutos a cuatro grados centígrados.Luego, expulse el medio y pese las células. Después de la centrifugación, disuelva el pellet de celda en cuatro mililitros de solución de sacarosa helada por cada gramo de células. Incubar la suspensión celular en hielo durante 15 minutos.Después de 15 minutos, centrifugar la suspensión celular a 8.500 g durante 20 minutos a cuatro grados centígrados. A continuación, pipetee el sobrenadante que contiene la fracción de sacarosa y guárdelo en hielo. Vuelva a suspender el pellet celular en una mezcla helada de cloruro de magnesio de cinco milimolares y PMSF de un milimolar.A continuación, añada 40 microlitros de 15 miligramos por mililitro de la reserva de lisosoma a la suspensión celular. Después de agregar el caldo de lisosomas, deje la suspensión celular en hielo durante 30 minutos. Una vez finalizado el período de incubación, combine la sacarosa y las fracciones periplásmicas.A continuación, centrifugar la fracción sacarosa-periplásmica a 30.000 g durante 30 minutos a cuatro grados centígrados. Una vez finalizada la centrifugación, transfiera el sobrenadante en un tubo cónico de 50 mililitros sobre hielo. A continuación, mezcle y vuelva a suspender un mililitro de níquel-NTA agarosa con el sobrenadante para obtener una suspensión homogénea, luego un mililitro de níquel-NTA agarosa en un tubo cónico fresco de 15 mililitros.A la agarosa, agregue 10 volúmenes de columna del búfer de equilibrio. A continuación, centrifugar la agarosa a 400 g durante cinco minutos. Después de la centrifugación, retire con cuidado el sobrenadante y agregue la agarosa de níquel-NTA a la fracción sacarosa-periplásmica.A continuación, balancee el tubo que contiene la fracción periplásmica de sacarosa a cuatro grados centígrados durante dos horas. De nuevo, centrifuga la mezcla. Luego, retire con cuidado el sobrenadante a un tubo fresco helado, ya que esta es la fracción no unida.Después de transferir el sobrenadante, agregue la agarosa de níquel-NTA en la columna de gravedad. A continuación, agregue tres volúmenes de columna de búfer de elución a la columna. A continuación, recoja el eluido como fracciones de elución uno, dos, tres y cuatro, respectivamente.Diluir y sembrar 5.000 células en 100 microlitros en cada pocillo de una placa de 96 pocillos. Incubar la placa a 37 grados centígrados durante seis a ocho horas para su fijación. Para preparar las PBMC, primero diluya la sangre recién preparada con un volumen igual de solución salina tamponada con fosfato en un tubo cónico de 50 mililitros.Pipetear 15 mililitros de medio de separación de linfocitos en un tubo cónico fresco de 50 mililitros. A continuación, transfiera con cuidado la sangre diluida a lo largo de las paredes del tubo al medio de separación de linfocitos. Centrifugar las células a 400 g durante 35 minutos a temperatura ambiente con los frenos apagados.Después de la centrifugación, extraiga con cuidado la capa superior de plasma. A continuación, pipetear la capa de sangre blanca que contiene las PBMC y diluir estas PBMC obtenidas con el doble del volumen de solución salina tamponada con fosfato con un 2% de suero bovino fetal.Luego, centrifuga la suspensión PBMC. Lave el pellet celular con solución salina tamponada con fosfato que contenga un 2% de suero bovino fetal y vuelva a centrifugar. Después de la centrifugación, cuente el número de células.Para preparar las células asesinas naturales, reconstituya las PBMC en solución salina tamponada con fosfato con un 2% de solución salina bovina fetal. Luego, transfiera la mezcla en un tubo de poliestireno de fondo redondo. Agregue 50 microlitros por mililitro de cóctel de enriquecimiento de células asesinas naturales a la mezcla de PBMC.Mezcle el contenido y deje el tubo durante 10 minutos. A continuación, vuelva a suspender y mezcle las partículas magnéticas presentes en el cóctel de enriquecimiento pipeteando varias veces, de modo que las partículas se suspendan uniformemente. Luego, agregue 100 microlitros por mililitro de partículas magnéticas a la suspensión celular.Mezcle las partículas magnéticas de la suspensión celular e incube a temperatura ambiente durante cinco minutos. Después de cinco minutos, agregue 2,5 mililitros de solución salina tamponada con fosfato con 2% de suero bovino fetal a la suspensión celular. Pipetear suavemente dos o tres veces para mezclar las células en el tubo.Coloque el tubo en el imán y deje que las perlas magnéticas se asienten durante 2,5 minutos a temperatura ambiente. Luego, en un solo golpe de acción, invierta el tubo y vierta la suspensión celular enriquecida en un tubo nuevo. De nuevo, cuenta el número de celdas.Una vez finalizado el recuento, diluya las células asesinas naturales en el medio de cultivo. Luego, agregue 100 microlitros de la suspensión celular a las células tumorales colocadas en una placa de 96 pocillos. Para configurar los ensayos de citotoxicidad, agregue 10 microlitros de concentraciones variables del anticuerpo GPC3-S-Fab a la placa de 96 pocillos.Luego, incuba la placa a 37 grados centígrados durante 72 horas. Después del tiempo de incubación designado, aspire el medio. A continuación, añada 100 microlitros de medio DMEM que contengan 10 microlitros de reactivo CCK en cada pocillo de la placa de 96 pocillos.De nuevo, incuba la placa a 37 grados centígrados. Después de la incubación, lea la placa a 450 nanómetros cada hora consecutiva hasta cuatro horas después de la adición del reactivo CCK8. El anticuerpo GPC3-S-Fab se purifica mediante una purificación de afinidad en dos pasos.Aquí, los dos paneles muestran que el anticuerpo se purifica utilizando las columnas de purificación de afinidad de níquel-NTA agarosa e IgG-CH1, respectivamente. A continuación, se evalúa la afinidad de unión del anticuerpo GPC3-S-Fab utilizando líneas celulares cancerosas GPC3 positivas y negativas. La GPC3-S-Fab se une a todas las células GPC3 positivas, como Hep3B, Huh7, Hep2G y CHO/GPC3.Curiosamente, se observa una unión mínima o nula cuando se utilizan células GPC3 negativas, como MHCC-97H y CHO. También se estudia la citotoxicidad de GPC3-S-Fab en presencia de células tumorales incubadas con células asesinas naturales frescas. El anticuerpo GPC3-S-Fab provoca una fuerte citotoxicidad contra las células HepG2, Hep3B y Huh7 siete de forma dependiente de la dosis en presencia de las células asesinas naturales.Sin embargo, no se observa tal citotoxicidad en ausencia de las células asesinas naturales en las células MHCC-97H. Una vez dominada, esta técnica se puede realizar en seis horas, si se realiza correctamente. Al intentar este procedimiento, es importante recordar mantener los escalones en hielo.Siguiendo este procedimiento, se pueden realizar otros métodos, como el modelado de xenoinjertos, para responder a preguntas adicionales, como el efecto tumoral in vivo. Tras su desarrollo, esta técnica allanó el camino para que los investigadores en el campo de los anticuerpos biespecíficos exploraran los efectos antitumorales in vitro. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo producir un anticuerpo biespecífico funcional dirigido a las células tumorales, especialmente el aislamiento de las células NK.

a-gpc3-targeting-bispecific-antibody-gpc3-s-fab-with-potent

Research

Investigación

JoVE Journal

Cancer Research

Investigación del cáncer

Eliminar células específicas sin dañar otras células es extremadamente difícil, especialmente en tejido establecido, sin embargo, existe una necesidad urgente de un método de eliminación celular en el campo de la ingeniería de tejidos. Aquí, presentamos un método para la eliminación de células específicas a partir de un cultivo celular mixto en 3D utilizando fotoinmunoterapia de infrarrojo cercano (NIR-PIT).

La eliminación selectiva de células de Cultura mezclada 3D mediante técnica de infrarrojo cercano Photoimmunotherapy

Describimos un sistema de ensayo cuantitativo de citolisis in vitro en tiempo real para evaluar la potencia de las células T del receptor de antígeno quimérico dirigidas a células tumorales líquidas y sólidas. Este protocolo se puede ampliar para evaluar otras células efector inmune, así como tratamientos combinados.

Un ensayo de potencia en tiempo real para células T receptores de antígeno quimérico dirigido a células cancerosas sólidas y hematológicas

Este trabajo describe la síntesis y caracterización de un homo-PROTAC bifuncional basado en pomalidomida como un enfoque novedoso para inducir la ubiquitinación y degradación de la e3 ubiquitina ligreblon (CRBN), el objetivo de los análogos de la talidomida.

Inactivación química del E3 Ubiquitin Ligase Cereblon por Homo-PROTACs basados en Pomalidomida

El desarrollo de un conjugado dual-funcional de péptido antigénico y miméticos Fc-III (DCAF) es novedoso para la eliminación de anticuerpos dañinos. Aquí, describimos un protocolo detallado para la síntesis de la molécula DCAF1, que puede bloquear selectivamente el anticuerpo 4G2 para eliminar el efecto de mejora dependiente de anticuerpos durante la infección por el virus del dengue.

Bloqueo de anticuerpos dirigido por un conjugado dual-funcional de péptido antigénico y méticos Fc-III (DCAF)

Aquí presentamos un protocolo para estudiar la localización in vivo de anticuerpos en modelos de xenoinjertos tumorales en ratones.

Análisis de la distribución de tumores y tejidos de anticuerpos terapéuticos específicos del antígeno objetivo

Aquí, describimos un método para transducir células T humanas con luciferasa para facilitar el seguimiento in vivo del tráfico de células T inducido por anticuerpos biespecíficos a tumores en estudios para evaluar la eficacia antitumoral y el mecanismo de anticuerpos biespecíficos que involucran a las células T.

Seguimiento del tráfico de células T inducido por anticuerpos biespecíficos utilizando células T humanas transducidas por luciferasa

Este protocolo presenta una técnica automatizada de alto rendimiento basada en imágenes para identificar compuestos que modulan la destrucción de células de cáncer de mama mediada por células asesinas naturales en presencia de un anticuerpo terapéutico anti-HER-2.

Ensayo de cribado de alto contenido para la identificación de compuestos modificadores de citotoxicidad celular dependientes de anticuerpos

Aquí, presentamos un método para identificar compuestos que modulan el mecanismo ADCC, un importante mecanismo de destrucción de células cancerosas de anticuerpos antitumorales. El efecto citotóxico de las células NK se mide en esferoides de células de cáncer de mama en presencia de trastuzumab. El análisis de imágenes identifica células asesinas y diana vivas y muertas en esferoides.

Cuantificación de la citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos en un modelo de esferoide tumoral: aplicación para el descubrimiento de fármacos

Aquí, presentamos un método para diferenciar y expandir las células asesinas naturales que expresan el receptor de antígeno quimérico (CAR) derivado de iPSC humano con una matanza mejorada contra varias neoplasias malignas. Este protocolo demuestra la diferenciación y expansión de células CAR-NK derivadas de iPSC optimizadas para asesinos naturales (NK) y la medición de la actividad antitumoral frente a varias líneas celulares tumorales.

Avances en células asesinas naturales que expresan receptores de antígenos quiméricos derivados de células madre pluripotentes humanas

Aquí, describimos un método para crear gotas de doble emulsión que encapsulan una célula T y una célula diana cancerosa para examinar la muerte celular a nivel de una sola célula. Este método permite la cuantificación dual de las moléculas citotóxicas y la apoptosis de las células diana dentro de una gran población de células T.

Ensayo de citotoxicidad basado en gotas para evaluar las células T receptoras de antígenos quiméricos a nivel de una sola célula

Aprende a producir el anticuerpo biespecífico GPC3-S-Fab en Escherichia coli y evaluar su citotoxicidad contra células de cáncer hepático positivas para GPC3. Este protocolo simplifica la purificación para aplicaciones terapéuticas.

Metas de GPC3 tienen anticuerpos, GPC3-S-Fab, con potente citotoxicidad

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