A11-positivo β-amiloide oligómero preparación y evaluación mediante Dot blot análisis
22 de mayo de 2018
Este protocolo describe cómo preparar oligómeros de Aß de un péptido sintético en vitro y evaluar cantidades relativas de oligómero Aβ mediante un punto de análisis el borrar.
Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo neurofarmacológico. La principal ventaja de esta técnica es que es sencilla, fiable y reproducible para formar oligómero beta-amiloide. Mostramos que la demostración de este método es fundamental ya que los pasos para preparar el oligómero beta son difíciles de aprender.
Primero, ajuste la concentración de la solución de monómero A-beta a 0,25 miligramos por mililitro agregando 900 microlitros de agua bidestilada al tubo. Luego continúe evaporando la solución de monómero con gas nitrógeno de alta pureza hasta que el volumen alcance aproximadamente 850 microlitros con una concentración de aproximadamente 0,29 miligramos por mililitro. La presencia de HR5P afecta a la formación de oligómero A-beta.
Por lo tanto, evaporar tanto como sea posible es un paso crítico de este procedimiento. A continuación, utilice agua bidestilada para diluir la solución madre de curcumina y preparar una solución de trabajo de 0,2 y dos micromolares. Mantenga una proporción de uno a uno y mezcle la solución A-beta con curcumina para lograr la concentración final de curcumina en 0,1 y un micromolar.
Luego, deje la solución en un agitador magnético. Conecte una caja divisoria de plástico al agitador magnético. Coloque dos barras de agitación magnéticas en las dos esquinas de la caja, luego coloque los tubos con las muestras en el centro de la caja.
Continúe agitando la caja a temperatura ambiente durante 48 horas a 60 revoluciones por minuto, luego centrifugue el tubo a 18, 000 veces G durante 15 minutos a cuatro grados centígrados. Después de la centrifugación, recoja el sobrenadante. Para el análisis de transferencia de puntos, tome una membrana de nitrocelulosa y córtela en tiras de un centímetro de ancho, luego coloque dos microlitros de la muestra de manera uniforme en las tiras uno y dos con cada intervalo de puntos a 0,5 centímetros.
Al rociar la muestra sobre la membrana, es necesario esparcir uniformemente y las diferentes gotas se controlan para que las diferentes muestras no se unan entre sí. A continuación, incuba las tiras a temperatura ambiente durante cinco minutos para que las gotas se sequen. Después de cinco minutos, incubar las tiras con 5% de albúmina sérica bovina durante 30 minutos a temperatura ambiente.
Una vez finalizada la incubación, lave las tiras con tampón TBST durante cinco minutos. Aspire el tampón una vez finalizado el lavado, luego incube la tira uno con el anticuerpo antioligómero A11 y la tira dos con la solución del anticuerpo anti-A-beta 6E10 durante una hora. Después de una hora, lave las tiras con TBST durante cinco minutos cada tres veces, luego aspire el tampón e incube las tiras con una solución de anticuerpos secundarios durante 40 minutos.
Después de la incubación secundaria de anticuerpos, vuelva a lavar las tiras con TBST durante cinco minutos cada tres veces. Luego, agregue aproximadamente 300 microlitros de líquido ECL mezclado a la superficie de las tiras húmedas, luego exponga las tiras en un sistema automático de imágenes de quimioluminiscencia. Los estudios TEM muestran la ausencia de agregados visibles en la solución de monómero A-beta disuelto en HFIP, sin embargo, después de 48 horas de incubación, el mismo monómero forma oligómeros, que son principalmente agregados globulares con un diámetro de 10 a 80 nanómetros.
Al someter las muestras ricas en monómeros y oligómeros A-beta a un análisis de transferencia de puntos, muestra la presencia de oligómeros A-beta positivos A11 en muestras ricas en oligómeros A-beta. Curiosamente, los péptidos A-beta 6E10 positivos están presentes tanto en el monómero A-beta como en las muestras ricas en oligómeros. A continuación, también se realiza un análisis semicuantitativo para expresar las muestras específicas de monómero A-beta beta y oligómero positivas para anticuerpos como un porcentaje de control.
Los péptidos A-beta positivos A11 son significativamente más altos en las muestras ricas en oligómeros A-beta en comparación con los monómeros. Por el contrario, el péptido A-beta 6E10 positivo A-beta está presente tanto en las muestras ricas en monómeros como en oligómeros. De hecho, los oligómeros A-beta también se incuban conjuntamente con la curcumina y el inhibidor de los oligómeros A-beta.
La curcumina conduce a una reducción significativa en la cantidad relativa de oligómero A-beta positivo A11 con una disminución de la tinción de A11 en las muestras de oligómero A-beta co-incubadas con curcumina. Sin embargo, las concentraciones variables de curcumina no afectan el número de péptidos A-beta en las muestras ricas en monómeros y oligómeros positivos para 6E10 en comparación con las muestras positivas para A11. Una vez dominada, esta técnica se puede realizar en varias horas si se realiza correctamente.
Tras su desarrollo, esta técnica allanó el camino para que los investigadores exploraran candidatos a fármacos para trastornos neurodegenerativos como la enfermedad de Alzheimer. Después de ver este video, debe tener una buena comprensión de cómo preparar el oligómero A-beta y evaluar su cantidad.
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Descripción general
Este protocolo describe la preparación de oligómeros de Aβ a partir de un péptido sintético in vitro y la evaluación de sus cantidades relativas mediante análisis de inmunotransferencia por puntos (dot blotting). Este método es sencillo, fiable y reproducible, lo que lo hace esencial para la investigación neurofarmacológica.
Componentes Clave del Estudio
Área de la ciencia
- Neurociencia
- Neurofarmacología
- Bioquímica
Antecedentes
- Se sospecha que los oligómeros de Aβ están implicados en enfermedades neurodegenerativas.
- Comprender su formación es crucial para el desarrollo de terapias.
- Los métodos actuales para preparar estos oligómeros pueden ser complejos.
- Este protocolo tiene como objetivo simplificar el proceso para los investigadores.
Objetivo del estudio
- Proporcionar un método confiable para la preparación de oligómeros de Aβ.
- Facilitar la evaluación de las concentraciones de oligómeros.
- Mejorar la reproducibilidad en experimentos neurofarmacológicos.
Métodos Utilizados
- Ajustar la concentración del monómero de A-beta a 0,25 mg/mL.
- Evaporar la solución con gas de nitrógeno de alta pureza.
- Monitorear los efectos del HR5P sobre la formación de oligómeros.
- Utilizar el análisis por inmunotransferencia sobre membrana para la evaluación.
Resultados principales
- El método produce con éxito oligómeros de Aβ.
- El análisis por inmunotransferencia en punto cuantifica eficazmente las cantidades de oligómeros.
- La presencia de HR5P influye significativamente en la formación de oligómeros.
- El protocolo demuestra una alta fiabilidad y reproducibilidad.
Conclusiones
- Este protocolo simplifica la preparación de oligómeros de Aβ.
- Proporciona una herramienta valiosa para la investigación neurofarmacológica.
- Estudios futuros pueden basarse en este método confiable.
Preguntas frecuentes
Relevancia Ejecutiva para la Industria
La preparación y cuantificación confiable de oligómeros de β-amiloide positivos para A11 es fundamental para la validación de dianas en etapas tempranas de neurodegeneración y para el cribado de inhibidores en la investigación de la enfermedad de Alzheimer. Este protocolo permite la generación reproducible y la evaluación semicuantitativa de especies oligoméricas tóxicas, lo que respalda la confianza predictiva en la prueba de hipótesis terapéuticas. El método aborda directamente un punto crítico clave para la desestimación mecanicista y la selección de carteras en la I+D neurofarmacológica.
Aplicaciones Estratégicas en I+D de Biotecnología Farmacéutica
Descubrimiento Temprano y Validación de Blancos
- Permite investigar la formación de oligómeros de β-amiloide como un factor mecanicista en la patología del Alzheimer.
- Permite la validación funcional de especies neurotóxicas mediante la especificidad del anticuerpo A11.
- Facilita la reducción de riesgos en hipótesis terapéuticas dirigidas a la inhibición de oligómeros.
- Proporciona un flujo de trabajo reproducible para el análisis comparativo de inhibidores candidatos.
Desarrollo de Pruebas y Cribado
- Prepara muestras ricas en oligómeros validadas para campañas de cribado de inhibidores posteriores.
- Proporciona resultados semicuantitativos en inmunoensayos por puntos para lecturas de ensayos estandarizadas.
- Permite la detección reproducible de oligómeros positivos para A11 en la evaluación de compuestos.
- Apoya la escalabilidad y el reutilización de plataformas en los flujos de trabajo de cribado para neurodegeneración.
Investigación Traductiva y Preclínica
- Alinea la caracterización in vitro de oligómeros con especies neurotóxicas relevantes para la enfermedad.
- Proporciona continuidad desde la validación en fase de descubrimiento hasta la evaluación preclínica de inhibidores.
- Permite el avance ajustado al riesgo de moléculas candidatas basado en evidencia mecanicista.
- Apoya el desarrollo de biomarcadores traslacionales para intervenciones dirigidas a oligómeros.
Integración de la canalización y flujo de trabajo
Este protocolo se integra en la interfaz entre el descubrimiento inicial y la identificación de compuestos activos, permitiendo pruebas de hipótesis sólidas y el desarrollo de ensayos para carteras de enfermedades neurodegenerativas.
- Biología del Descubrimiento: Apoya la validación mecanicista de la toxicidad de los oligómeros de β-amiloide y los efectos de los inhibidores.
- Tamizaje: Proporciona resultados estandarizados y semicuantitativos mediante inmunotransferencia en punto para protocolos de tamizaje de compuestos.
- Análisis: Permite la cuantificación comparativa de especies positivas para A11 y 6E10 para la toma de decisiones basada en datos.
- Investigación Traducional: Conecta la evaluación de oligómeros in vitro con modelos de neurotoxicidad relevantes para la enfermedad.
- Reutilización Empresarial: Establece un protocolo reproducible y escalable para iniciativas continuas de investigación en neurodegeneración.
Impacto Operativo y Empresarial
- Valor científico: Aumenta la confianza predictiva en la validación de objetivos y la reducción de riesgos mecanicistas para la enfermedad de Alzheimer.
- Valor operativo: Proporciona una preparación y cuantificación estandarizadas, reproducibles y escalables de oligómeros.
- Valor estratégico: Mejora las decisiones de avance/no avance y la eficiencia del capital al permitir cribados robustos de inhibidores.
- Impacto en la cartera: Apoya la priorización ajustada al riesgo de candidatos terapéuticos para la neurodegeneración.
Consideraciones de Implementación
- Requiere experiencia en el manejo de péptidos y técnicas de inmunodetección.
- Necesita acceso a instrumentación para el ensayo de dot blot y sistemas de imagen quimioluminiscente.
- Exige estandarización entre equipos para la preparación y análisis de muestras reproducibles.
- Adaptable a diversos candidatos inhibidores y sistemas de péptidos oligoméricos.
- Depende de la especificidad del anticuerpo y de las limitaciones del análisis semi-cuantitativo.
