Name: Generación de insulina libre de andamios, tridimensional expresar Pancreatoids de progenitores pancreáticos de ratón In Vitro (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-06-02T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 33 s
Description: Aprende a generar pancreatoides tridimensionales libres de andamios que expresan insulina a partir de progenitores pancreáticos de ratón e10.5. Este método permite estudiar la formación de células endocrinas en un entorno complejo con mesénquima.

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Agradecemos Jolanta Chmielowiec útil discusión sobre el protocolo y el manuscrito. También agradecemos a Benjamin Arenkiel acceso al microscopio confocal. Este trabajo fue financiado por los NIH (P30-DK079638 a m) y T32HL092332-13 de M.A.S. y M.B., la Fundación médica de McNair (a m) y el núcleo confocal en el BCM intelectual y discapacidades del desarrollo investigación centro (NIH U54 HD083092 de la Eunice Kennedy Shriver Instituto Nacional de salud infantil y desarrollo humano).

Todos los experimentos con animales se describe en este método fueron aprobados por el cuidado institucional de animales y uso Comité de Baylor College of Medicine.
1. preparación del ratón embrionario día 10,5 progenitores pancreáticos
Nota: Este Protocolo no necesita seguir en condiciones estériles hasta el paso 2, sin embargo, es óptima para esterilizar instrumentos de disección y rocíe con antes del etanol al 70% de uso.
<ol><li>Para configurar para la disección, llene un cubo de hielo y colocar un recipiente de tampón fosfato salino (PBS) en el hielo. Limpiar dos pinzas de punta fina y tijeras de disección con etanol al 70%. Situado cerca de la zona de disección, un recipiente con al menos tres borosilicate capilar tubos, una pipeta de boca, un encendedor y filtra las puntas de pipeta 1.000 μl.<ol>
<li>Preparar al menos 1 mL de dispase frío 1,25 mg/mL diluido en agua esterilizada y el lugar en el segundo pozo de una placa bien 12 en hielo. Poner PBS en la primera, tercera y cuarta pozos de 12 bien la placa. Colocar 1 mL de 0.05% tripsina de 1,5 mL tubo en hielo. Precaliente un incubador de agitación a 37 oC.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Eutanasia a ratones embarazadas tiempo e10.5 con arreglo a directrices IACUC. Rocíe el abdomen con etanol al 70% para limpiar la región antes de hacer una incisión en forma de V en el área genital del ratón usando tijeras y pinzas y continuar hasta el diafragma. Nota: La apariencia de un tapón vaginal en este protocolo indica día 0.5. Usando 5 - ratones de 6 semanas de edad, un aumento de peso de más de 2 g actúa como una medida secundaria de impregnación acertada.<ol>
<li>Suprimir cuidadosamente el útero, haciendo una incisión en las porciones lateral superiores del útero, tirando el órgano hacia arriba del ratón y después de esta incisión hasta la región genital antes de repetir en el lado opuesto. Colocar en una placa de Petri con PBS frío de 10 cm. Nota: Es posible obtener organoides de las células de e11.5 disociado, sin embargo a diferencia de la pancreatoids de e10.5, estos organoides no se caracterizan aún y así no podrán mantener la capacidad de diferenciarse en todos los tres principales linajes pancreáticos.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Bajo un microscopio de disección ligera, coloque la placa de Petri y abra con cuidado el tejido uterino colocando dos pinzas entre cada embrión y descamación del tejido de la vesícula vitelina. Transferencia de embriones agarrando el saco de yema de huevo suavemente con fórceps y colóquelos en una placa de Petri con fresco, de 10 cm PBS frío. Coloque el plato Petri en hielo. Nota: Es importante eliminar Washingtgon embriones, preferentemente mantenidos dentro del saco de yema de huevo, como contundente eliminación puede tirar el cordón umbilical, extraer tejido del embrión y comprometer la integridad estructural.</li>
	<li>Coloque varias gotas de PBS en una tapa de caja de Petri de 10 cm. Usar estas gotas para transferir el embrión durante la disección como extraembrionarias tejidos se quitan para asegurar visibilidad. Transferir un embrión a una gota de PBS y retire suavemente del saco de yema de huevo con unas pinzas, mientras que los embriones restantes permanecen en PBS en el hielo (figura 1A). Quitar la cabeza antes de mover el embrión de una nueva gota de PBS con unas pinzas sacar ligeramente el embrión, para no dañar el tejido (figura 1B). Nota: El tejido deba transferirse con mayor frecuencia a gotitas frescas de PBS que se describe aquí, dependiendo de la opacidad del líquido.<ol>
<li>En una nueva gota de PBS, quitar los brotes del miembro anterior con unas pinzas (figura 1B). Colocar pinzas en la abertura donde el esbozo estaba presente y rasgar suavemente sólo el tejido más externo anterior (figura 1B). Gire el embrión y repetir en la dirección posterior, en la yema del miembro posterior. En este punto, el tracto gastrointestinal debe ser visible (figura 1B).</li>
		<li>La región posterior del tracto gastrointestinal tiene una curva leve (Figura 1F). Insertar pinzas detrás de esta curva en la abertura entre el tracto gastrointestinal y de la región espinal de la pared del cuerpo. Extraer el tracto gastrointestinal, trabajando lentamente hacia arriba hasta alcanzar la región más anterior es DanDe la región cardíaca (figura 1B-E). OPCIONAL: Quitar el corazón primordial y los brotes del hígado de las regiones ventrales del tracto gastrointestinal, dejando solamente el tubo intestinal continuo. Las primeras veces que se realiza este protocolo podría ser más fácil dejar el corazón y el hígado como ventral hasta la morfología del tracto gastrointestinal y el brote pancreático dorsal son más familiar (figura 1C y D ).</li>
		<li>Traslado del tracto gastrointestinal a la dulce gota de PBS.</li>
		<li>Toma de fórceps y pellizcar suavemente el tejido debajo de la yema que sobresale y el intestino y levantar ligeramente el tejido exterior apagado (figura 1D-F). Nota: El brote pancreático dorsal está situado entre el estómago y el intestino (figura 1C-G). El brote pancreático debajo debería verse como una estructura redonda, lleno de protuberancias (figura 1G).</li>
		<li>Colocar pinzas donde la yema se conecta con el intestino y el sujetador hacia arriba para aflojar el brote (figura 1G). Lavar una vez en una nueva burbuja de PBS antes de transferir la yema en el primer pocillo de la placa de la pozo 12 en PBS frío en hielo. Repita hasta que todos los brotes obtenidos de embriones y colocados en el primer pocillo de la placa de la pozo 12.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Coloque el plato bien 12 bajo el microscopio de disección ligera. Cuenta el número de yemas pancreáticas disecado con éxito más tarde calcular el cociente de la división.<ol>
<li>Lugar filtrada 1.000 μl Punta de una pipeta dentro de la pipeta de boca con un tubo capilar conectado. Llama esterilizar el tubo capilar y crear una curva en el tubo para la facilidad de uso. Utilizan el tubo capilar para transferir cogollos a la segunda solución fría dispase bien contiene por 2 min antes de transferir al tercer pozo con PBS limpio (figura 1G). Nota: Durante la transferencia de los brotes del dispase a PBS, evite tocar el tejido de la punta del tubo capilar. Si el tejido se atasca en la punta del tubo, pipetear arriba y abajo o agite en la solución de PBS limpiarla hasta que afloja.</li>
		<li>Pipetear los brotes hacia arriba y hacia abajo y traslado a la cuarta bien con PBS limpio. Por último, utilizando la transferencia del dispositivo capilar brotes al tubo de 1,5 mL con 0.05% tripsina. Coloque el tubo en la coctelera de 37 oC precalentado y agitar a 1.500 rpm durante 4 minutos.</li>
		<li>Vortex para aproximadamente 10 s inmediatamente Coloque el tubo en una centrifugadora y centrifugado durante 5 minutos a 200 g. Quite todo pero aproximadamente 50 μl de solución con cautela para no molestar las células centrifugadas (figura 1G).</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. cultivo de progenitores disociados para formar Pancreatoids
Nota: Lo siguiente debe realizarse en un ambiente estéril en una campana de cultivo de tejidos estándar, empleando los procedimientos estándar estériles.
<ol><li>De cada yema recogido, añadir 400 μL organogénesis medios16,17 (tabla 1) a las células centrifugadas. Vórtice de pulso tres veces y bien placa de placa 100 μl por pozo de una fijación baja 96, División de brotes en una proporción de 1:4 (figura 1G).</li>
	<li>Ver bajo el microscopio visualizar disocia las células flotan libremente (figura 1H). Coloque la placa de cultivo en un incubador de 37 oC con 5% CO2 en un eje de balancín a velocidad media.</li>
	<li>Supervisar el progreso de pancreatoids diariamente. Reemplazar con 100 μl de frescos medios cada 3 días, Pipetear cuidadosamente bajo control microscópico en la campana para quitar dejando pancreatoid en el pozo. Alternativamente, fresco 100 μl de los medios de comunicación pueden agregarse a un nuevo pozo y pancreatoid transferidos usando el tubo capilar de borosilicato atado pipeta de boca y 1000 μl filtrado punta de pipeta.</li>
</ol>3. proceso Pancreatoids para la proyección de imagen inmunofluorescente
<ol><li>Para procesar pancreatoids para imágenes de inmunofluorescencia, en primer lugar preparar 4% paraformaldehido/PBS, solución pH7.4 (PFA). Colocar 50 μl de PFA en pozos de una 96 placa bien el 4%.<ol>
<li>Utilizando los tubos de borosilicato al capilar y pipeta de boca con la punta de filtrado pipeta de 1000 μl, transferencia pancreatoids de teniendo medios tan poco como sea posible en el pozo fresco con 4% de medio de cultivo PDA. Situado en el eje de balancín a temperatura ambiente durante 15 minutos.</li>
		<li>Pancreatoids de transferencia de 4% rock PFA en un pozo con 100 μl de PBS fresco, a temperatura ambiente durante 5-10 min Repita para un total de tres frescos lavados de PBS. Nota: El protocolo se puede pausarse aquí, con pancreatoids almacenados en 100 μl de PBS a 4 oC durante hasta una semana.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Para la proyección de imagen de wholemount (recomendado si los anticuerpos son adecuado, la alternativa en la sección 3.3. microscopia en 3.4 y.), transferencia de PBS en el suero de 5% burro de 50 μl de PBS 1 x con 0,1% detergente no iónico (SAFT) al bloque. Rock toda la noche a 4 oC o 4 h a temperatura ambiente.<ol>
<li>Transferencia de pancreatoids a un nuevo pozo que contiene anticuerpos primarios diluidos en 50 μl de suero 5% burro en 1 x PBST. Óptimamente, roca durante 24 h a 4 oC (menos de 12 h pero hasta 36 h). Nota: Anticuerpos indicadas en la Tabla de materiales contra Chga (1: 100), DBA (1: 400), Vim (1: 400) y Pdx1 (1: 100) son adecuados para la tinción de wholemount; otros anticuerpos pueden requerir optimización.</li>
		<li>Transferencia de pancreatoids a un pozo con 100 μl de SAFT fresca para lavar y rock durante 30 min a temperatura ambiente. Repita este paso para un total de tres frescos lavados de SAFT.</li>
		<li>Transferencia de pancreatoids a un nuevo pozo que contiene anticuerpos contra secundario diluido en 50 μl de suero 5% burro en 1 x PBST. Proteja la placa de la luz y en 4 oC, mecedora para óptimo 24 h (por lo menos 12 h pero hasta 36 h). Nota: Todos los anticuerpos secundarios enumerados en la Tabla de materiales y DAPI contratinción nuclear son adecuados para la tinción de wholemount.</li>
		<li>Transferencia de pancreatoids a un nuevo pozo con 100 μl de 1 x Saft y roca a temperatura ambiente durante 30 minutos Repita para un total de tres lavados en 1 x PBST. En el tercer y último lavado, agregar 300 nM DAPI.</li>
		<li>Por último, coloque 100 μl de PBS y conservar a 4 oC protegido de la luz por hasta una semana antes de la proyección de imagen por microscopía confocal, aunque los mejores resultados provienen de la proyección de imagen inmediatamente después de la tinción. Para evitar el movimiento de pancreatoids durante la proyección de imagen, pero evitar que se sequen, coloque cada pancreatoid en una gota de 20 μl de PBS. Si pancreatoids no permanecen aún, reducir el volumen de PBS.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Para secciones congeladas, transferencia pancreatoids de PBS en solución de sacarosa de 30% durante la noche a 4 oC.<ol>
<li>Añadir medio de inclusión en una burbuja debajo de un microscopio de disección. Utilizando fórceps bajo control microscópico, poner en remojo pancreatoids empujando suavemente a través de los medios de comunicación empotrar varias veces para eliminar la sacarosa residual antes de transferir a un bloque de tejido con medio congelado de inclusión.</li>
		<li>Coloque el bloque de tejido en hielo seco hasta que congelado y la sección en el criostato a 8 μm. Nota: Las secciones pueden almacenarse a-80 oC o immunostained inmediatamente.</li>
		<li>Permiten que las secciones de-80 oC se descongele a temperatura ambiente durante aproximadamente 5 minutos hasta que se seque. Dibujar una barrera hidrofóbica al usar el lápiz hidrofóbico pap en el tejido y el bloque utilizando suero de burro 5% diluido en 1 x PBST por 30 min a temperatura ambiente.</li>
		<li>Quitar los medios de comunicación y reemplace inmediatamente con anticuerpos primarios diluidos en suero de burro 5% diluido en 1 x SAFT durante la noche a 4 oC.</li>
		<li>La principal solución de quitar y lavar los tejidos tres veces con 1 x PBST de 10 minutos cada uno. A continuación, agregue una solución de anticuerpo secundario diluido en suero de burro 5% diluido en 1 x PBST por 1 h a temperatura ambiente y proteja los portaobjetos de la luz.</li>
		<li>Retirar la solución secundaria y lavar portaobjetos tres veces en 1 x PBST de 10 minutos cada uno. En el último lavado, agregar 300 nM DAPI.</li>
		<li>Quitar los medios de comunicación y agregar medios de montaje y un cubreobjetos. Tienda se desliza lejos de la luz en 4 oC hasta que esté listo a la imagen.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. aislamiento de ARN de Pancreatoids para el análisis de la transcripción
<ol><li>Recoger pancreatoids con capilar de borosilicato unido a una pipeta de boca con un filtrado 1.000 μl Punta de pipeta para esterilidad y lugar en 500 μl de solución de ácido Guanidinio tiocianato-fenol-cloroformo en un tubo de 1,5 mL. Almacenar a-80 oC o proceder de inmediato al aislamiento de RNA.</li>
	<li>Para el aislamiento de RNA, descongelar las muestras en hielo si es necesario y añadir 100 μl de cloroformo. Mezclar bien y lugar en 4 oC por 15 minutos pre-enfriarán una centrifugadora a 4 oC.<ol>
<li>Colocar tubos en la centrífuga y vuelta por 20 min a 12.000 g a 4 oC.</li>
		<li>Retire con cuidado los tubos para no molestar a la separación de las capas. Usando una pipeta μl 200, recoge la solución acuosa clara y colocar en un tubo nuevo de 1.5 mL, dejando una pequeña cantidad al búfer de la capa de la proteína blanco y rosa capa de ADN. No toque la punta de la pipeta a nada en este proceso y no toque las paredes del tubo de 1,5 mL.</li>
		<li>Añadir 500 μl de isopropanol 100% a tubo nuevo que contiene la capa acuosa y vortex. Deje reposar a temperatura ambiente durante 20 minutos, más tiempo en el hielo, o para dejar de precipitación máxima durante la noche a-20 oC.</li>
		<li>Centrifugar a 12.000 g durante 15 min a 4 oC para el RNA de la pelotilla. Remover el isopropanol sin perturbar el pellet. Nota: Como pancreatoids son pequeñas, es probable que la pastilla no será visible.</li>
		<li>Frío, añadir etanol al 75% e invertir el tubo varias veces. En la centrifugadora y la vuelta a 9.000 x g por 10 min a 4 oC. eliminar el etanol y centrifugado por 2 min a 9.000 x g.</li>
		<li>Utilice una pipeta de 200 μL para eliminar cualquier resto etanol en el tubo, sin contacto con la región en que la pelotilla reside. Deje la tapa abierta en el tubo durante 5-10 min a temperatura ambiente para asegurar la evaporación de etanol residual.</li>
		<li>Resuspender el precipitado en todo con un vórtex en 20 μl de agua libre de nucleasa. Opcional: Calor del RNA a 65 oC por 3 minutos e inmediatamente volver al hielo. RNA puede ser almacenado a-80 oC o inmediatamente utilizado para transcripción reversa y qPCR.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modeling+Development+and+Disease+with+Organoids%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Modeling Development and Disease with Organoids.</a> Cell. 165 (7), 1586-1597 (2016).</li>
<li>Akkerman, N., Defize, L. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dawn+of+the+organoid+era%3A+3D+tissue+and+organ+cultures+revolutionize+the+study+of+development%2C+disease%2C+and+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Bioessays%22%5BJournal%5D)">Dawn of the organoid era: 3D tissue and organ cultures revolutionize the study of development, disease, and regeneration.</a> Bioessays. 39 (4), (2017).</li>
<li>Guo, T., Landsman, L., Li, N., Hebrok, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Factors+expressed+by+murine+embryonic+pancreatic+mesenchyme+enhance+generation+of+insulin-producing+cells+from+hESCs%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Factors expressed by murine embryonic pancreatic mesenchyme enhance generation of insulin-producing cells from hESCs.</a> Diabetes. 62 (5), 1581-1592 (2013).</li>
<li>Landsman, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pancreatic+mesenchyme+regulates+epithelial+organogenesis+throughout+development%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biology%22%5BJournal%5D)">Pancreatic mesenchyme regulates epithelial organogenesis throughout development.</a> PLoS Biology. 9 (9), 1001143(2011).</li>
<li>Lammert, E., Cleaver, O., Melton, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+pancreatic+differentiation+by+signals+from+blood+vessels%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Induction of pancreatic differentiation by signals from blood vessels.</a> Science. 294 (5542), 564-567 (2001).</li>
<li>Barker, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lgr5%28%2Bve%29+stem+cells+drive+self-renewal+in+the+stomach+and+build+long-lived+gastric+units+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Lgr5(+ve) stem cells drive self-renewal in the stomach and build long-lived gastric units in vitro.</a> Cell Stem Cell. 6 (1), 25-36 (2010).</li>
<li>Sato, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+Lgr5+stem+cells+build+crypt-villus+structures+in+vitro+without+a+mesenchymal+niche%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche.</a> Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).</li>
<li>Spence, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Directed+differentiation+of+human+pluripotent+stem+cells+into+intestinal+tissue+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Directed differentiation of human pluripotent stem cells into intestinal tissue in vitro.</a> Nature. 470 (7332), 105-109 (2011).</li>
<li>Eiraku, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Self-organizing+optic-cup+morphogenesis+in+three-dimensional+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Self-organizing optic-cup morphogenesis in three-dimensional culture.</a> Nature. 472 (7341), 51-56 (2011).</li>
<li>Xia, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+generation+of+kidney+organoids+by+differentiation+of+human+pluripotent+cells+to+ureteric+bud+progenitor-like+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">The generation of kidney organoids by differentiation of human pluripotent cells to ureteric bud progenitor-like cells.</a> Nature Protocols. 9 (11), 2693-2704 (2014).</li>
<li>Takasato, M., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/26444236">Kidney organoids from human iPS cells contain multiple lineages and model human nephrogenesis.</a> Nature. 526 (7574), 564-568 (2015).</li>
<li>Lancaster, M. A., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/23995685">Cerebral organoids model human brain development and microcephaly.</a> Nature. 501 (7467), 373-379 (2013).</li>
<li>Loftus, S. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acinar+cell+apoptosis+in+Serpini2-deficient+mice+models+pancreatic+insufficiency%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genetics%22%5BJournal%5D)">Acinar cell apoptosis in Serpini2-deficient mice models pancreatic insufficiency.</a> PLoS Genetics. 1 (3), 38(2005).</li>
<li>Kleeff, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chronic+pancreatitis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Dis+Primers%22%5BJournal%5D)">Chronic pancreatitis.</a> Nat Rev Dis Primers. 3, 17060(2017).</li>
<li>Murtaugh, L. C., Melton, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genes%2C+signals%2C+and+lineages+in+pancreas+development%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Cell+and+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Genes, signals, and lineages in pancreas development.</a> Annual Review of Cell and Developmental Biology. 19, 71-89 (2003).</li>
<li>Greggio, C., De Franceschi, F., Figueiredo-Larsen, M., Grapin-Botton, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+pancreas+organogenesis+from+dispersed+mouse+embryonic+progenitors%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">In vitro pancreas organogenesis from dispersed mouse embryonic progenitors.</a> Journal of Visualized Experiments. (89), 51725(2014).</li>
<li>Greggio, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Artificial+three-dimensional+niches+deconstruct+pancreas+development+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Artificial three-dimensional niches deconstruct pancreas development in vitro.</a> Development. 140 (21), 4452-4462 (2013).</li>
<li>Sneddon, J. B., Borowiak, M., Melton, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Self-renewal+of+embryonic-stem-cell-derived+progenitors+by+organ-matched+mesenchyme%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Self-renewal of embryonic-stem-cell-derived progenitors by organ-matched mesenchyme.</a> Nature. 491 (7426), 765-768 (2012).</li>
<li>Scavuzzo, M. A., Yang, D., Borowiak, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organotypic+pancreatoids+with+native+mesenchyme+develop+Insulin+producing+endocrine+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Organotypic pancreatoids with native mesenchyme develop Insulin producing endocrine cells.</a> Scientific Reports. 7 (1), 10810(2017).</li>
<li>Murtaugh, L. C., Stanger, B. Z., Kwan, K. M., Melton, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Notch+signaling+controls+multiple+steps+of+pancreatic+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Notch signaling controls multiple steps of pancreatic differentiation.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (25), 14920-14925 (2003).</li>
<li>Nelson, S. B., Schaffer, A. E., Sander, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+transcription+factors+Nkx6.1+and+Nkx6.2+possess+equivalent+activities+in+promoting+beta-cell+fate+specification+in+Pdx1%2B+pancreatic+progenitor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">The transcription factors Nkx6.1 and Nkx6.2 possess equivalent activities in promoting beta-cell fate specification in Pdx1+ pancreatic progenitor cells.</a> Development. 134 (13), 2491-2500 (2007).</li>
<li>Seymour, P. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SOX9+is+required+for+maintenance+of+the+pancreatic+progenitor+cell+pool%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">SOX9 is required for maintenance of the pancreatic progenitor cell pool.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (6), 1865-1870 (2007).</li>
<li>Kawaguchi, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+the+transcriptional+regulator+Ptf1a+in+converting+intestinal+to+pancreatic+progenitors%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Genetics%22%5BJournal%5D)">The role of the transcriptional regulator Ptf1a in converting intestinal to pancreatic progenitors.</a> Nature Genetics. 32 (1), 128-134 (2002).</li>
<li>Hara, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transgenic+mice+with+green+fluorescent+protein-labeled+pancreatic+beta+-cells%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology%3A+Endocrinology+and+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Transgenic mice with green fluorescent protein-labeled pancreatic beta -cells.</a> American Journal of Physiology: Endocrinology and Metabolism. 284 (1), 177-183 (2003).</li>
<li>Holthofer, H., Schulte, B. A., Spicer, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+binding+sites+for+Dolichos+biflorus+agglutinin+at+the+apical+aspect+of+collecting+duct+cells+in+rat+kidney%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+and+Tissue+Research%22%5BJournal%5D)">Expression of binding sites for Dolichos biflorus agglutinin at the apical aspect of collecting duct cells in rat kidney.</a> Cell and Tissue Research. 249 (3), 481-485 (1987).</li>
<li>Reichert, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation%2C+culture+and+genetic+manipulation+of+mouse+pancreatic+ductal+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Isolation, culture and genetic manipulation of mouse pancreatic ductal cells.</a> Nature Protocols. 8 (7), 1354-1365 (2013).</li>
<li>Winkler, H., Fischer-Colbrie, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+chromogranins+A+and+B%3A+the+first+25+years+and+future+perspectives%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">The chromogranins A and B: the first 25 years and future perspectives.</a> Neuroscience. 49 (3), 497-528 (1992).</li>
<li>Burcelin, R., Knauf, C., Cani, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pancreatic+alpha-cell+dysfunction+in+diabetes%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes+and+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Pancreatic alpha-cell dysfunction in diabetes.</a> Diabetes and Metabolism. 34, Suppl 2 49-55 (2008).</li>
<li>Del Prato, S., Marchetti, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Beta-+and+alpha-cell+dysfunction+in+type+2+diabetes%5BTitle%5D)+AND+%22Hormone+and+Metabolic+Research%22%5BJournal%5D)">Beta- and alpha-cell dysfunction in type 2 diabetes.</a> Hormone and Metabolic Research. 36 (11-12), 775-781 (2004).</li>
<li>Piciucchi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exocrine+pancreatic+insufficiency+in+diabetic+patients%3A+prevalence%2C+mechanisms%2C+and+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Exocrine pancreatic insufficiency in diabetic patients: prevalence, mechanisms, and treatment.</a> International Journal of Endocrinology. 2015, 595649(2015).</li>
<li>Campbell-Thompson, M., Rodriguez-Calvo, T., Battaglia, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Abnormalities+of+the+Exocrine+Pancreas+in+Type+1+Diabetes%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Diabetes+Reports%22%5BJournal%5D)">Abnormalities of the Exocrine Pancreas in Type 1 Diabetes.</a> Current Diabetes Reports. 15 (10), 79(2015).</li>
<li>Shivaprasad, C., Pulikkal, A. A., Kumar, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pancreatic+exocrine+insufficiency+in+type+1+and+type+2+diabetics+of+Indian+origin%5BTitle%5D)+AND+%22Pancreatology%22%5BJournal%5D)">Pancreatic exocrine insufficiency in type 1 and type 2 diabetics of Indian origin.</a> Pancreatology. 15 (6), 616-619 (2015).</li>
</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

La progresión de los modelos de cultura de célula es fundamental para desarrollo de modelos de correctamente, producir tipos de células clínicamente relevantes, prueba de eficacia de los medicamentos o incluso trasplante a los pacientes. Sin embargo, recapitulando artificialmente el desarrollo en un plato es todo un reto ya que estamos todavía lejos de comprender los mecanismos de la organogénesis y la fisiología en vivo. Así en vitro de las células son ineficaz generado, no completamente funcional, inc...

Delinear los mecanismos del desarrollo normal y la fisiología es primordial para entender la etiología de la enfermedad y, en definitiva, cultivar métodos de tratamiento. Mientras que el cultivo y diferenciación de células madre permiten el análisis rápido y alto rendimiento de desarrollo, está limitada por el cuerpo existente de conocimientos sobre mecanismos de regulación sino de la célula y artificialmente recapitula el desarrollo en un relativamente Estado homogéneo bidimensional1,2. En vivo desarrollo afectado por influencias extrínsecas, con diferentes tipos de células en el lugar y entorno proporciona señales paracrinas y apoyo organizativo para orientar la organogénesis, no sólo la función de estas células también se basa en su alrededores de dirección3,4,5. Dada la importancia de estos estímulos externos, las limitaciones de los protocolos de diferenciación y la naturaleza laboriosa de modelos de ratón en vivo , nuevos sistemas se necesitan para investigar experimentalmente la fisiología y los procesos básicos del desarrollo.
La aparición de protocolos para generar organitas tridimensional, complejo proporciona un sistema conveniente y congruente para el estudio de la organogénesis, fisiología, eficacia de los medicamentos e incluso patogenia. Establecer organitas murino para diferentes sistemas como el estómago intestino y6 7 han ampliado nuestra comprensión de la organogénesis, proporcionando una herramienta para estudiar las complejidades del desarrollo con menos restricciones que en vivo y en vitro modelos. Debido a estos avances en el organoide murino la formación y el advenimiento de humanas pluripotentes células, intestinal humano8, retina9, renal10,11, y organitas cerebral12 se han producido y esto repertorio es limitado solamente por el conocimiento existente respecto de los mecanismos de desarrollo.
De particular interés es la generación de pancreático organoides, como una miríada de enfermedades plagas diferentes pancreático tipos celulares, incluyendo células acinares y conductos en la escasez pancreática exocrine13, las células acinares en pancreatitis14, y células beta en la diabetes15. Adquirir conocimiento sobre el desarrollo de estos diferentes tipos de células podría ayudar en la comprensión de su patología y puede, también, actuar como una plataforma de screening de drogas personalizada o trasplante. Previamente, Greggio et al desarrollaron un método para crear murino organitas pancreático que recapitulan en vivo morfogénesis y desarrollan estructuras organizadas, tridimensionales, complejas compuesto por las principales células epiteliales pancreáticas los tipos de16,17. Este es un gran paso adelante en el área pancreático, sobre todo lo que hacen las células en vitro puede permitir investigación biológica del desarrollo de la célula beta. Sin embargo, una escasez de células endocrinas formados en este protocolo a menos que los organoides se trasplantaron en el tejido, donde el nicho podría interactuar y proporcionar señales de instrucción17. El mesénquima constituye la mayor parte del nicho, muy envolvente el epitelio en desarrollo desde etapas iniciales de la organogénesis para etapas posteriores incluyendo delaminación endocrino y diferenciación3,4, 18. La interacción de la mesénquima con el páncreas en desarrollo es otro ejemplo de señales extrínsecas y la importancia de mantener en vivo la complejidad celular para el estudio de la organogénesis.
Aquí, describimos cómo generar tridimensional organitas pancreático, llamado pancreatoids, de progenitores pancreáticos murinos disociado los e10.5. Estos pancreatoids retener mesénquima nativo, uno mismo-montar en condiciones libres y generar todos los tipos de células pancreáticas principales, incluyendo un número sólido de células endocrinas beta19. Este enfoque es más adecuado para el análisis del desarrollo endocrino, como protocolos anteriores carecen de diferenciación endocrina robusta. Sin embargo, usando el protocolo para páncreas organoides de Greggio et al. , es más adecuado para el análisis de la ramificación epitelial pancreático y morfogénesis, como ramificación es más limitada en pancreatoids.

<table><tbody><tr><td>2-Mercaptoetanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M6250</td><td></td></tr><tr><td>Conjuntos de tubos de aspiración para pipetas microcapilares calibradas</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A5177</td><td></td></tr><tr><td>BarnStead NanoPure Agua sin nucleasas</td><td>ThermoFisher</td><td>D119</td><td></td></tr><tr><td>Tubos capilares de borosilicato</td><td>Sutter Instruments</td><td>GB1007515</td><td>diámetro exterior 1 mm, diámetro interno 0,75 mm, 1,5 cm de longitud</td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C5080</td><td></td></tr><tr><td>Repelente de células Microplaca de 96 pocillos</td><td>Greiner Bio-One</td><td>650970</td> Centrífuga <td>de fondo en U</td></tr><tr><td>5424 R</td><td>Eppendorf</td><td>5401000013</td><td></td></tr><tr><td>Cloroformo</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>233306</td><td></td></tr><tr><td>Anticuerpo de cromogranina-A</td><td>Abcam</td><td>ab15160</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio estereoscópico compacto y modular M60</td><td>Leica</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Countess Contador de Células Automatizado</td><td>Invitrogen</td><td>C10310</td><td></td></tr><tr><td>Countess Contador de Células Portaobjetos</td><td>Invitrogen</td><td>C10312</td><td></td></tr><tr><td>CryoStar NX70</td><td>ThermoFisher</td><td>957000L</td><td></td></tr><tr><td>D-(+)-Glucosa</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G7528</td><td></td></tr><tr><td>DAPI (4',6-diamidina-2'-fenilindol-diclorhidrato)</td><td>Roche</td><td>10 236 276 001</td><td>Polvo</td></tr><tr><td>DBA anticuerpo</td><td>Vector Lab</td><td>RL-1032</td><td></td></tr><tr><td>Dispasa II, Polvo</td><td>Gibco</td><td>17105041</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F-12, HEPES</td><td>Gibco</td><td>11330032</td><td></td></tr><tr><td>Dnase I</td><td>Invitrogen</td><td>18068-015</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #5 Pinzas</td><td>Fine Science Tools</td><td>11251-10</td><td>0,05 x 0,02 mm; Titanio; Consejo de biología</td></tr><tr><td>EGF (factor de crecimiento epidérmico)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E9644</td><td></td></tr><tr><td>Etanol, 200 Proof</td><td>Decon Laboratories</td><td>2716</td><td></td></tr><tr><td>Incubadoras de CO2 de ciclo estéril ThermoFisher</td><td></td><td>370</td><td></td></tr><tr><td>Fluoromount-G</td><td>Southern Biotech</td><td>OB10001</td><td></td></tr><tr><td>Heparina sal sódica de la mucosa intestinal porcina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3149-10KU</td><td></td></tr><tr><td>Anticuerpo INSM1</td><td>Santa Cruz BioTechnology</td><td>sc-271408</td><td>Isopropanol policlonal de ratón IgG</td></tr><tr><td></td><td>Fisher</td><td>A4164</td><td></td></tr><tr><td>Isothesia Isoflurano, USP</td><td>Henry Schein</td><td>11695-6776-2</td><td></td></tr><tr><td>Anticuerpo de insulina</td><td>Dako</td><td>A056401</td><td>conejillo de indias policlonal</td></tr><tr><td>KAPA SYBR FAST Universal</td><td>KAPA Biosystems</td><td>KK4618</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>KaryoMax</td><td>10575090</td><td></td></tr><tr><td>KnockOut Serum Reemplazo</td><td>Invitrogen</td><td>10828028</td><td></td></tr><tr><td>Leica TCS SPE Espectral de Alta Resolución Confocal</td><td>Leica</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>442615</td><td></td></tr><tr><td>Ratón C-Péptido ELISA</td><td>ALPCO</td><td>80-CPTMS-E01</td><td></td></tr><tr><td>Ratón Ultrasensible Insulina ELISA</td><td>ALPCO</td><td>80-INSMSU-E01</td><td></td></tr><tr><td>MX35 Cuchillas de micrótomo</td><td>ThermoFisher</td><td>3052835</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7653</td><td></td></tr><tr><td>NaHCO3</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S3817</td><td></td></tr><tr><td>NaH2PO4</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Suero de burro normal</td><td>Jackson Immuno Research</td><td>017-000-121</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehído</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>158127</td><td></td></tr><tr><td>PBS 1X</td><td>Corning</td><td>21-040-CV</td><td></td></tr><tr><td>Anticuerpo Pdx1</td><td>DSHB</td><td>F6A11</td><td>Ratón monoclonal MIgG1</td></tr><tr><td>Peel-A-Way Moldes de inclusión desechables</td><td>VWR</td><td>15160-157</td><td></td></tr><tr><td>Solución de penicilina-estreptomicina</td><td>Corning</td><td>MT30002CI</td><td></td></tr><tr><td>PMA (Forbol 12-Miristato 13- Acetato)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P1585</td><td></td></tr><tr><td>Protein LoBind Tubos de microcentrífuga</td><td>Eppendorf</td><td>22431081</td><td>1,5 mL de capacidad</td></tr><tr><td>FGF-10 humano recombinante Proteína</td><td>R& D Systems</td><td>345-FG</td><td></td></tr><tr><td>FGF humano recombinante-Ácido</td><td>Peprotech</td><td>100-17A</td><td></td></tr><tr><td>R-Spondin I humano recombinante Proteína</td><td>R& D Systems</td><td>4546-RS</td><td></td></tr><tr><td>BenchRocker 2D</td><td>Benchmark</td><td>BR2000</td><td></td></tr><tr><td>Sacarosa 500g</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S0389</td><td></td></tr><tr><td>SuperFrost Plus Portaobjetos de microscopio</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-550-15</td><td></td></tr><tr><td>Super Pap Pen</td><td>Microscopía Electrónica Sciences</td><td>71310</td><td></td></tr><tr><td>Thermomixer R</td><td>Eppendorf</td><td>05-412-401</td><td></td></tr><tr><td>Tissue Tek O.C.T. Compuesto</td><td>Sakura</td><td>4583</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8787</td><td></td></tr><tr><td>TRIzol Reactivo</td><td>Invitrogen</td><td>15596018</td><td></td></tr><tr><td>TrypLE Express</td><td>Invitrogen</td><td>12604039</td><td>(1x), sin Rojo Fenol</td></tr><tr><td>Tinción Azul de Tripán</td><td>Invitrogen 15250061</td><td></td><td>Para portaobjetos de recuento de células</td></tr><tr><td>Tripsina-EDTA (0,05% )</td><td>Corning</td><td>25-052-CI</td><td></td></tr><tr><td>Tripsina-EDTA (0,25%)</td><td>Gibco</td><td>25200072</td><td>rojo fenol</td></tr><tr><td>Placa de 24 pocillos de fijación ultrabaja</td><td>Corning</td><td>3473</td><td></td></tr><tr><td>Placa de esferoide de fijación ultrabaja</td><td>Corning</td><td>4520</td><td></td>de 96 pocillos</tr><tr><td>Anticuerpo de Vimentina</td><td>EMD Millipore</td><td>AB5733</td><td>Pollo policlonal IgY</td></tr><tr><td>Vortex Genie</td><td>BioExpres</td><td>S-7350-1</td><td></td></tr><tr><td>Y-27632 Dihidrocloruro</td><td>R& D Systems</td><td>1254</td><td>También conocido como inhibidor de ROCK</td></tr><tr><td>Zeiss 710 Microscopio confocal</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

generación de insulina libre de andamios, tridimensional expresar pancreatoids de progenitores pancreáticos de ratón in vitro

Generation of Scaffold-free, Three-dimensional Insulin Expressing Pancreatoids from Mouse Pancreatic Progenitors In Vitro

El páncreas es que un órgano complejo compuesto de muchos diferentes tipos de células que trabajan juntas para regular la digestión y la homeostasis de la glucosa de sangre. Estos tipos de células son las células acinares secretoras de enzimas, un sistema ductal arborized responsable para el transporte de las enzimas de las células endocrinas de las tripas y la producción de hormonas.
Endocrino de las células beta son el tipo celular único en el cuerpo que producen insulina para bajar los niveles de glucemia. Diabetes, una enfermedad caracterizada por una pérdida o disfunción de células beta, está alcanzando proporciones epidémicas. Por lo tanto, es indispensable establecer protocolos para investigar el desarrollo de las células beta que puede utilizarse para fines de investigación para obtener los medicamentos y terapias basadas en células. Mientras que la investigación experimental del desarrollo del ratón es esencial, en vivo los estudios son laboriosos y lentos. Las células cultivadas ofrecen una plataforma más conveniente para la investigación; sin embargo, no son capaces de mantener la diversidad celular, organización arquitectónica y las interacciones celulares que se encuentran en vivo. Por lo tanto, es esencial para desarrollar nuevas herramientas para investigar la fisiología y la organogénesis pancreática.
Pancreáticas células epiteliales se desarrollan en la asociación cercana con el mesénquima del inicio de la organogénesis como células organizan y diferencian en el complejo órgano adulto fisiológicamente competente. El mesénquima pancreático proporciona señales importantes para el desarrollo endocrino, muchos de los cuales no son bien entendidos todavía, por lo tanto difícil recapitular durante el cultivo en vitro . Aquí, describimos un protocolo cultura ratón complejo tridimensional, celular organoides que retienen mesenchyme, denominado pancreatoids. El brote pancreático murino e10.5 es disecado, disociado y cultivado en un ambiente libre de andamio. Estos flotan células auto montan con mesénquima que envuelven el desarrollo pancreatoid y un número sólido de endocrina las células beta en desarrollo junto con el acinar y las células del conducto. Este sistema puede ser utilizado para estudiar las interacciones de célula célula célula sino determinación, organización estructural y morfogénesis, organogénesis, o de drogas, de molécula pequeña o screening genético.

Disección cuidadosa de embriones de ratón en e10.5 desde el cuerno uterino debe producir embriones indemnes en PBS para más la disección (figura 1A). El tracto gastrointestinal puede eliminarse eficientemente del embrión (figura 1B), que permite el discernimiento del brote pancreático dorsal en la ensambladura del intestino y el estómago (figura 1C-F...

Aquí, presentamos un protocolo para generar insulina expresando 3D pancreatoids murino de e10.5 flotante disociado progenitores pancreático y el mesenchyme asociado.

Generación de insulina libre de andamios, tridimensional expresar Pancreatoids de progenitores pancreáticos de ratón In Vitro

The pancreas is a complex organ composed of many different cell types that work together to regulate blood glucose homeostasis and digestion. These cell ...

Este método podría ayudar a responder preguntas clave en el campo del páncreas mediante el uso de estos pancreatoides, para comprender cómo se forman las células endocrinas en un entorno complejo desde el punto de vista arquitectónico y celular. La principal ventaja de esta técnica es que los pancreatoideos desarrollan células endocrinas debido a la inclusión del mesénquima circundante. Por lo general, las personas nuevas en este método tendrán dificultades porque el páncreas es muy pequeño con e10.5.Y la disección es crucial para la formación de pancreadoras para obtener suficiente tejido no contaminante. Para preparar la disección, llene una cubeta de hielo y coloque un recipiente de solución salina tamponada con fosfato en el hielo. Limpie dos pinzas de punta fina y unas tijeras de disección con etanol al 70%.Cerca del área de disección, coloque un recipiente con al menos tres tubos capilares de borosilicato, un encendedor y puntas de pipeta filtradas de 1000 microlitros. A continuación, pipetee al menos un mililitro de 1,25 miligramos por mililitro de dispasa fría diluido en agua esterilizada en el segundo pocillo de una placa de 12 pocillos sobre hielo. Pipetear PBS en el primer, tercer y cuarto pozo de la placa de 12 pocillos.Además, pipetea un mililitro de tripsina al 0,05% en un tubo de 1,5 mililitros sobre hielo. Después de sacrificar ratones preñados con e10.5 cronometrados de acuerdo con las pautas de la IACUC, rocíe el abdomen con etanol al 70% para limpiar la región. Luego, haga una incisión en forma de V en el área genital del ratón con tijeras y pinzas y continúe la incisión hasta el diafragma.Extirpe cuidadosamente el útero haciendo una incisión en las partes laterales superiores del útero, tirando del órgano hacia arriba, alejándolo del ratón y siguiendo esta incisión hasta la región genital antes de repetir en el lado opuesto. Coloque el útero extirpado en una placa de Petri de 10 centímetros con el PBS frío. Bajo un microscopio de disección óptica, coloque la placa de Petri y abra cuidadosamente el tejido uterino colocando dos pinzas entre cada embrión y separando el tejido del saco vitelino.Transfiera los embriones agarrando suavemente el saco vitelino con pinzas y colocándolos en una placa de Petri de 10 centímetros con PBS fresco y frío. Coloque la placa de Petri sobre hielo. A continuación, coloque varias gotas de PBS en la tapa de la placa de Petri de 10 centímetros.Utilice estas gotitas para transferir el embrión durante la disección, ya que se eliminan los tejidos extraembrionarios para garantizar la visibilidad. Transfiera un embrión a una gota de PBS y retírelo suavemente del saco vitelino con pinzas mientras los embriones restantes permanecen en PBS en hielo. Retire la cabeza antes de mover el embrión a una nueva gota de PBS usando fórceps para recoger ligeramente el embrión sin dañar el tejido.En una nueva gota de PBS, retire las yemas de las cuatro extremidades con fórceps. Coloque las pinzas en la abertura donde estaba presente la yema de la extremidad y rasgue suavemente solo el tejido más externo de la parte anterior. Rotar el embrión y repetir en dirección posterior, deteniéndose en la yema de la extremidad posterior.En este punto, el tracto gastrointestinal debe ser visible. La región posterior del tracto gastrointestinal tiene una ligera curvatura; Inserte pinzas detrás de este pliegue en la abertura entre el tracto gastrointestinal y la región espinal en la pared del cuerpo. Separe el tracto gastrointestinal, trabajando lentamente hacia arriba hasta llegar a la región más anterior, donde se conecta la región cardíaca.En los siguientes pasos, es fundamental evitar el tejido circundante en el cultivo, para no contaminar los pancreatos con tejido no pancreático. Sin embargo, si no agarra todo el brote pancreático, el número y el tamaño de los panheloides se verán afectados. Transfiera el tracto gastrointestinal a la gotita fresca de PBS.Continúe extirpando el tejido externo que rodea el tracto gastrointestinal. Una vez que se extrae este tejido externo, la yema pancreática se puede visualizar posterior a las yemas hepáticas, entre el estómago y el intestino. Luego, tome pinzas y pellizque suavemente el tejido debajo de la yema que sobresale en el intestino y levante ligeramente la yema pancreática.Después de pellizcar la región donde el brote se conecta con el intestino, el brote se separa. Lavar una vez en una nueva burbuja de PBS antes de transferir el cogollo al primer pocillo de la placa de 12 pocillos y enfriar PBS en hielo. Repita hasta que se recojan todos los brotes de los embriones y se coloquen en el primer pocillo de la placa de 12 pocillos.A continuación, coloque el plato de 12 pocillos bajo el microscopio de disección óptica. Cuente el número de yemas pancreáticas diseccionadas con éxito para calcular posteriormente la proporción de división. Coloque una punta de pipeta filtrada de 1000 microlitros en la pipeta con el tubo capilar conectado.La llama esteriliza el tubo capilar y crea una curva en el tubo para facilitar su uso. Use el capilar para transferir los brotes al segundo pocillo que contiene una solución fría de dispasa durante dos minutos antes de transferirlos al tercer pocillo que contiene PBS limpio. Pipetea los cogollos hacia arriba y hacia abajo y transfiérelos al cuarto pocillo que contiene PBS limpio.Finalmente, usando el dispositivo capilar, transfiera los cogollos al tubo de 1,5 mililitros con 0,05% de tripsina. Coloque el tubo en el agitador precalentado a 37 grados centígrados y agite a 1, 500 RPM durante cuatro o cinco minutos. Después de agitar el vórtice durante aproximadamente 10 segundos, coloque inmediatamente el tubo en la centrífuga y gire durante cinco minutos a 200 g.Retire con cuidado todos los microlitros de solución, excepto aproximadamente 50, para no alterar las celdas centrifugadas. Por cada yema recolectada a 400 microlitros de medio de organogénesis a las células centrifugadas, pulse el vórtice tres veces y coloque 100 microlitros por pocillo de una placa de 96 pocillos de baja fijación, dividiendo las yemas en una proporción de uno a cuatro. Revise bajo el microscopio para visualizar las células disociadas flotando libremente.A continuación, coloque la placa de cultivo en una incubadora a 37 grados centígrados con un 5% de dióxido de carbono sobre un balancín a velocidad media. La disección cuidadosa de embriones de ratón en e10.5 desde el asta uterina debería producir embriones no dañados en PBS para una disección posterior. El tracto gastrointestinal puede ser removido eficientemente del embrión, permitiendo el discernimiento de la yema pancreática dorsal en la unión del intestino y el estómago.En la organogénesis media, estas células flotantes y libres de andamio se autoensamblan y organizan en pancreadoras tridimensionales que crecen y persisten durante al menos 10 días en cultivo. La aplicación de un activador de la proteína quinasa C en altas concentraciones altera la morfología de los pancreatoides, lo que da lugar a células epiteliales poco asociadas y a un aumento de la ramificación. Además, el uso de animales transgénicos permite la visualización de las células a medida que se diferencian en tiempo real.Para evaluar la asociación del tejido mesenquimal pancreático con las células epiteliales pancreáticas, se puede realizar inmunotinción para los marcadores de cada tejido. La inmunotinción de un marcador de conducto con un marcador endocrino y núcleos, revela la formación de múltiples linajes en los pancreatoides. Un marcador mesenquima teñido conjuntamente con un marcador progenitor pancreático muestra que el mesénquima envuelve al pancreadoide.El desarrollo de las células beta se revela mediante la tinción del marcador epitelial y el marcador de células beta. Mediante el análisis cuantitativo de PCR, se pueden evaluar las transcripciones de los progenitores y las células diferenciadoras, como los genes progenitores y los marcadores diferenciados. Una vez dominada, esta técnica se puede realizar en aproximadamente una hora, incluido el tiempo de preparación, si se realiza correctamente.Después de ver este video, debe tener una buena comprensión de cómo realizar la disección para obtener tejido pancreático de 10.5 ratones para generar pancreatoides. Al intentar este procedimiento, es importante recordar extraer con cuidado el tracto gastrointestinal de los embriones, de lo contrario, será muy difícil encontrar la yema pancreática. Siguiendo este procedimiento, se pueden realizar otros métodos como GSIS y ELISA para responder preguntas adicionales, como cuánta insulina o péptido C se produce después de la estimulación con glucosa.Tras su desarrollo, esta técnica nos allanó el camino para explorar las consecuencias morfológicas de la activación de PKC utilizando moléculas pequeñas. Una forma de implementar aún más este sistema para estudiar el efecto del factor de transcripción de la expresión e incluso para realizar importantes experimentos de epistasis.

generation-scaffold-free-three-dimensional-insulin-expressing

Research

Investigación

JoVE Journal

Developmental Biology

Biología del Desarrollo

Un ensayo de tres dimensiones que permite clonigénicas como de páncreas, células progenitoras a diferenciarse en la insulina que expresan las colonias se describe. Este método tiene la ventaja de medio semi-sólido que contiene factores de metilcelulosa, Matrigel y el crecimiento, en el que los progenitores solo proliferan y se...

Un análisis cuantitativo de la insulina que expresan la formación de colonias de progenitores

Aquí se describe un método para el aislamiento, cultivo y manipulación de páncreas de ratón embrionario. Esto representa un...

Un sistema para la<em&gt; Ex vivo</em&gt; Cultivo de páncreas embrionario

El método de cultivo en tres dimensiones se describe en este protocolo recapitula el desarrollo del páncreas a partir de progenitores páncreas de ratón embrionarias dispersas, incluyendo su expansión sustancial, diferenciación y morfogénesis en un órgano ramificada. Este método es susceptible de formación de imágenes, la interferencia funcional y la manipulación del nicho.

In Vitro Páncreas Organogenesis de dispersos embrionarios de ratón Progenitores

En ensayos de colonias in vitro para la detección de auto-renovación y diferenciación de células progenitoras aisladas de páncreas murinos adultos estén concebidas. En estos ensayos, los progenitores de páncreas dan lugar a colonias de células en el espacio de 3 dimensiones en un medio semi-sólido que contiene metilcelulosa. Se describen protocolos para la manipulación de células individuales y caracterización de las colonias individuales.

Los ensayos in vitro de colonias para la caracterización de células progenitoras Tri-potentes Aislado de los murinos adultos Páncreas

Este protocolo demuestra el aislamiento de los islotes murinos y la siembra en un andamio decelularizado. Los islotes soportados por el andamio fueron trasplantados en la almohadilla de grasa epididimal de ratones diabéticos inducidos por estreptozotocina (STZ). Los islotes sobrevivieron en el sitio del trasplante e invirtieron la condición hiperglucémica.

Transplante de islotes en el cojín de grasa epididimal de ratones diabéticos

Aquí, presentamos un protocolo detallado para distinguir las células de vástago pluripotent humanas (hPSCs) en la proteína de páncreas/duodeno homeobox 1+ (PDX1+) las células para la generación de linajes pancreáticos basan en el crecimiento de monocapa tipo de Colonia no de disociar las células. Este método es adecuado para producir células derivadas del hPSC homogéneas, manipulación genética y selección.

Eficiente generación de páncreas/duodeno Homeobox proteína 1+ progenitores del Foregut pancreática Posterior de hPSCs en las culturas de la adherencia

El presente protocolo describe un método mejorado para aumentar la coexpresión de los factores de transcripción PDX1 y NKX6.1 en progenitores pancreáticos derivados de células madre pluripotentes humanas (hPSC) en monocapas planas. Esto se logra reponiendo la matriz fresca, manipulando la densidad celular y disociando las células endodérmicas.

Diferenciación de células madre pluripotentes humanas en precursores de células beta pancreáticas en un sistema de cultivo 2D

La diferenciación de las células madre en células de los islotes proporciona una solución alternativa al tratamiento convencional de la diabetes y al modelado de la enfermedad. Describimos un protocolo detallado de cultivo de células madre que combina un kit de diferenciación comercial con un método previamente validado para ayudar a producir islotes derivados de células madre secretores de insulina en una placa.

Diferenciación de células madre pluripotentes humanas en grupos de islotes productores de insulina

Este artículo presenta un protocolo para la diferenciación dirigida y el análisis funcional de células similares a β células. Describimos las condiciones óptimas de cultivo y los pasajes para las células madre pluripotentes humanas antes de generar células pancreáticas productoras de insulina. La diferenciación de seis etapas progresa desde la formación definitiva del endodermo hasta las células funcionales similares a las células β que secretan insulina en respuesta a la glucosa.

Protocolo optimizado para generar células pancreáticas funcionales secretoras de insulina a partir de células madre pluripotentes humanas

Proporcionamos un protocolo mínimamente invasivo para el trasplante intramuscular de islotes de células madre pancreáticas derivadas de células madre humanas en ratones inmunodeficientes, para implantación in vivo y análisis posteriores.

Trasplante intramuscular de células endocrinas pancreáticas derivadas de células madre pluripotentes humanas en ratones

Aprende a generar pancreatoides tridimensionales libres de andamios que expresan insulina a partir de progenitores pancreáticos de ratón e10.5. Este método permite estudiar la formación de células endocrinas en un entorno complejo con mesénquima.

Generación de insulina libre de andamios, tridimensional expresar Pancreatoids de progenitores pancreáticos de ratón In Vitro

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