Generación de insulina libre de andamios, tridimensional expresar Pancreatoids de progenitores pancreáticos de ratón In Vitro

Este método podría ayudar a responder preguntas clave en el campo del páncreas mediante el uso de estos pancreatoides, para comprender cómo se forman las células endocrinas en un entorno complejo desde el punto de vista arquitectónico y celular. La principal ventaja de esta técnica es que los pancreatoideos desarrollan células endocrinas debido a la inclusión del mesénquima circundante. Por lo general, las personas nuevas en este método tendrán dificultades porque el páncreas es muy pequeño con e10.5.

Y la disección es crucial para la formación de pancreadoras para obtener suficiente tejido no contaminante. Para preparar la disección, llene una cubeta de hielo y coloque un recipiente de solución salina tamponada con fosfato en el hielo. Limpie dos pinzas de punta fina y unas tijeras de disección con etanol al 70%.

Cerca del área de disección, coloque un recipiente con al menos tres tubos capilares de borosilicato, un encendedor y puntas de pipeta filtradas de 1000 microlitros. A continuación, pipetee al menos un mililitro de 1,25 miligramos por mililitro de dispasa fría diluido en agua esterilizada en el segundo pocillo de una placa de 12 pocillos sobre hielo. Pipetear PBS en el primer, tercer y cuarto pozo de la placa de 12 pocillos.

Además, pipetea un mililitro de tripsina al 0,05% en un tubo de 1,5 mililitros sobre hielo. Después de sacrificar ratones preñados con e10.5 cronometrados de acuerdo con las pautas de la IACUC, rocíe el abdomen con etanol al 70% para limpiar la región. Luego, haga una incisión en forma de V en el área genital del ratón con tijeras y pinzas y continúe la incisión hasta el diafragma.

Extirpe cuidadosamente el útero haciendo una incisión en las partes laterales superiores del útero, tirando del órgano hacia arriba, alejándolo del ratón y siguiendo esta incisión hasta la región genital antes de repetir en el lado opuesto. Coloque el útero extirpado en una placa de Petri de 10 centímetros con el PBS frío. Bajo un microscopio de disección óptica, coloque la placa de Petri y abra cuidadosamente el tejido uterino colocando dos pinzas entre cada embrión y separando el tejido del saco vitelino.

Transfiera los embriones agarrando suavemente el saco vitelino con pinzas y colocándolos en una placa de Petri de 10 centímetros con PBS fresco y frío. Coloque la placa de Petri sobre hielo. A continuación, coloque varias gotas de PBS en la tapa de la placa de Petri de 10 centímetros.

Utilice estas gotitas para transferir el embrión durante la disección, ya que se eliminan los tejidos extraembrionarios para garantizar la visibilidad. Transfiera un embrión a una gota de PBS y retírelo suavemente del saco vitelino con pinzas mientras los embriones restantes permanecen en PBS en hielo. Retire la cabeza antes de mover el embrión a una nueva gota de PBS usando fórceps para recoger ligeramente el embrión sin dañar el tejido.

En una nueva gota de PBS, retire las yemas de las cuatro extremidades con fórceps. Coloque las pinzas en la abertura donde estaba presente la yema de la extremidad y rasgue suavemente solo el tejido más externo de la parte anterior. Rotar el embrión y repetir en dirección posterior, deteniéndose en la yema de la extremidad posterior.

En este punto, el tracto gastrointestinal debe ser visible. La región posterior del tracto gastrointestinal tiene una ligera curvatura; Inserte pinzas detrás de este pliegue en la abertura entre el tracto gastrointestinal y la región espinal en la pared del cuerpo. Separe el tracto gastrointestinal, trabajando lentamente hacia arriba hasta llegar a la región más anterior, donde se conecta la región cardíaca.

En los siguientes pasos, es fundamental evitar el tejido circundante en el cultivo, para no contaminar los pancreatos con tejido no pancreático. Sin embargo, si no agarra todo el brote pancreático, el número y el tamaño de los panheloides se verán afectados. Transfiera el tracto gastrointestinal a la gotita fresca de PBS.

Continúe extirpando el tejido externo que rodea el tracto gastrointestinal. Una vez que se extrae este tejido externo, la yema pancreática se puede visualizar posterior a las yemas hepáticas, entre el estómago y el intestino. Luego, tome pinzas y pellizque suavemente el tejido debajo de la yema que sobresale en el intestino y levante ligeramente la yema pancreática.

Después de pellizcar la región donde el brote se conecta con el intestino, el brote se separa. Lavar una vez en una nueva burbuja de PBS antes de transferir el cogollo al primer pocillo de la placa de 12 pocillos y enfriar PBS en hielo. Repita hasta que se recojan todos los brotes de los embriones y se coloquen en el primer pocillo de la placa de 12 pocillos.

A continuación, coloque el plato de 12 pocillos bajo el microscopio de disección óptica. Cuente el número de yemas pancreáticas diseccionadas con éxito para calcular posteriormente la proporción de división. Coloque una punta de pipeta filtrada de 1000 microlitros en la pipeta con el tubo capilar conectado.

La llama esteriliza el tubo capilar y crea una curva en el tubo para facilitar su uso. Use el capilar para transferir los brotes al segundo pocillo que contiene una solución fría de dispasa durante dos minutos antes de transferirlos al tercer pocillo que contiene PBS limpio. Pipetea los cogollos hacia arriba y hacia abajo y transfiérelos al cuarto pocillo que contiene PBS limpio.

Finalmente, usando el dispositivo capilar, transfiera los cogollos al tubo de 1,5 mililitros con 0,05% de tripsina. Coloque el tubo en el agitador precalentado a 37 grados centígrados y agite a 1, 500 RPM durante cuatro o cinco minutos. Después de agitar el vórtice durante aproximadamente 10 segundos, coloque inmediatamente el tubo en la centrífuga y gire durante cinco minutos a 200 g.

Retire con cuidado todos los microlitros de solución, excepto aproximadamente 50, para no alterar las celdas centrifugadas. Por cada yema recolectada a 400 microlitros de medio de organogénesis a las células centrifugadas, pulse el vórtice tres veces y coloque 100 microlitros por pocillo de una placa de 96 pocillos de baja fijación, dividiendo las yemas en una proporción de uno a cuatro. Revise bajo el microscopio para visualizar las células disociadas flotando libremente.

A continuación, coloque la placa de cultivo en una incubadora a 37 grados centígrados con un 5% de dióxido de carbono sobre un balancín a velocidad media. La disección cuidadosa de embriones de ratón en e10.5 desde el asta uterina debería producir embriones no dañados en PBS para una disección posterior. El tracto gastrointestinal puede ser removido eficientemente del embrión, permitiendo el discernimiento de la yema pancreática dorsal en la unión del intestino y el estómago.

En la organogénesis media, estas células flotantes y libres de andamio se autoensamblan y organizan en pancreadoras tridimensionales que crecen y persisten durante al menos 10 días en cultivo. La aplicación de un activador de la proteína quinasa C en altas concentraciones altera la morfología de los pancreatoides, lo que da lugar a células epiteliales poco asociadas y a un aumento de la ramificación. Además, el uso de animales transgénicos permite la visualización de las células a medida que se diferencian en tiempo real.

Para evaluar la asociación del tejido mesenquimal pancreático con las células epiteliales pancreáticas, se puede realizar inmunotinción para los marcadores de cada tejido. La inmunotinción de un marcador de conducto con un marcador endocrino y núcleos, revela la formación de múltiples linajes en los pancreatoides. Un marcador mesenquima teñido conjuntamente con un marcador progenitor pancreático muestra que el mesénquima envuelve al pancreadoide.

El desarrollo de las células beta se revela mediante la tinción del marcador epitelial y el marcador de células beta. Mediante el análisis cuantitativo de PCR, se pueden evaluar las transcripciones de los progenitores y las células diferenciadoras, como los genes progenitores y los marcadores diferenciados. Una vez dominada, esta técnica se puede realizar en aproximadamente una hora, incluido el tiempo de preparación, si se realiza correctamente.

Después de ver este video, debe tener una buena comprensión de cómo realizar la disección para obtener tejido pancreático de 10.5 ratones para generar pancreatoides. Al intentar este procedimiento, es importante recordar extraer con cuidado el tracto gastrointestinal de los embriones, de lo contrario, será muy difícil encontrar la yema pancreática. Siguiendo este procedimiento, se pueden realizar otros métodos como GSIS y ELISA para responder preguntas adicionales, como cuánta insulina o péptido C se produce después de la estimulación con glucosa.

Tras su desarrollo, esta técnica nos allanó el camino para explorar las consecuencias morfológicas de la activación de PKC utilizando moléculas pequeñas. Una forma de implementar aún más este sistema para estudiar el efecto del factor de transcripción de la expresión e incluso para realizar importantes experimentos de epistasis.