Polysome perfilado en Leishmania, las células humanas y testículo de ratón

El objetivo general de esta técnica es estudiar la participación de los ARNm individuales con los polisomas durante la traducción. El perfil de polisomas es una tecnología poderosa para estudiar la participación del ARNm con ribosomas y polisomas. La técnica es importante para los estudios de la regulación de la síntesis de proteínas, la activación de la traducción y la represión.

Aquí nuestro equipo presenta las técnicas para el fraccionamiento polisomal y el análisis de fracciones en el ejemplo de tres organismos. Parásito Leishmania major, células humanas cultivadas y un tejido animal. Este enfoque consta de cuatro pasos principales, preparación del lisado, preparación del gradiente de sacarosa y ultracentrifugación, fraccionamiento de polisomas y recolección de muestras.

Análisis de las fracciones. Las células de diferentes fuentes se recogen, se lavan y se lisan en tampón de lisis mediante el paso a través de una aguja o un homogeneizador Dounce. La centrifugación se utiliza para eliminar los restos celulares que clarifican el lisado.

Un gradiente continuo de sacarosa se forma mediante la mezcla de soluciones de sacarosa al 10% y al 50% en un generador de gradientes. El lisado se carga en la parte superior del degradado. La ultracentrifugación separa los ARNm asociados con un número diferente de ribosomas.

El cual es monitoreado por un detector UV durante el fraccionamiento, formando distintos espectros absorbentes. Preparación del lisado. Existen algunas diferencias en la preparación del lisado dependiendo de la fuente.

Después de la preparación del lisado, los procedimientos son idénticos independientemente del origen de la muestra. Preparación de lisado citoplasmático mayor de Leishmania. Coloque las células principales de Leishmania en 30 mililitros de medio a una densidad de 100.000 células por mililitro.

Este paso se lleva a cabo en una cabina de bioseguridad. Colocar el matraz con cultivo de Leishmania en la incubadora y cultivar las células a 27 grados centígrados, hasta la fase logarítmica. Por lo general, tarda unos dos días en crecer.

Las células mayores de Leishmania son fácilmente visibles bajo el microscopio. Agregue cicloheximida al cultivo de Leishmania cultivado hasta una concentración final de 100 microgramos por mililitro, para detener los ribosomas en los ARNm traducidos. Vuelva a colocar las células en la incubadora durante diez minutos a 27 grados centígrados.

Una vez finalizado el tratamiento con cicloheximida, transfiera las células a un tubo cónico de 50 mililitros y hágalo girar 1.800 g durante 8 minutos. Deseche el sobrenadante. Lave las celdas con 30 mililitros de pbs y centrífuga.

Deseche el sobrenadante y vuelva a suspender las células en un mililitro de pbs. Toma una alícuota de células y mézclala con la solución de formaldehído. A continuación, cuente las células con un hemocitómetro.

Transfiera el número deseado de células al tubo de microfuga. Girar las celdas a 1.800 g durante 8 minutos a cuatro grados centígrados. A continuación, deseche el sobrenadante.

Vuelva a suspender el pellet celular en un mililitro de tampón de lisis que contiene inhibidores de la proteasa y ARNasina. Pase las células a través de una aguja de calibre 23 tres veces. Después de pasar a través de la aguja, el lisado se vuelve transparente.

Centrifugar a 11.200 g durante diez minutos a cuatro grados centígrados para clarificar el lisado. Transfiera el lisado clarificado a un tubo de microfuga nuevo y manténgalo en hielo hasta la ultracentrifugación en gradiente de sacarosa. Preparación de lisado citoplasmático a partir de células humanas cultivadas.

Cultive células HeLa en una placa grande en la incubadora a 37 grados centígrados, con 5% de CO2. Agregue cicloheximida a las células HeLa cultivadas hasta la concentración final de 100 microgramos por mililitro para detener los ribosomas en los ARNm traducidos. Incubar las células durante diez minutos a 37 grados centígrados con 5% de CO2.

Aspire el medio y lave la placa con hielo dos veces con pbs fríos. Agregue 500 microlitros de tampón de lisis a la placa y raspe las células. Transfiera las células lisadas al tubo de microfuga.

Pase las células a través de una aguja de calibre 23 tres veces. Centrifugar a 11,200 g durante ocho minutos para clarificar el lisado. Después de la centrifugación, mueva los tubos sobre hielo y transfiera el sobrenadante al nuevo tubo.

Tome una alícuota, dilúyala y mida la absorbancia a 260 nanómetros usando una nanogota. Si hay varias muestras, ajuste los lisados a la misma densidad óptica y mantenga las muestras en hielo hasta la ultracentrifugación en gradiente de sacarosa. Preparación de lisado citoplasmático a partir de testículos de ratón.

Disecciona los testículos del ratón. Realizar una pequeña incisión en la túnica albugenia y recoger los túbulos seminíferos del testículo y transferirlos en el tubo cónico que contiene cinco mililitros de pbs. Mezcle el pañuelo vigorosamente.

Y deje que el pañuelo se asiente sobre hielo durante cinco minutos. Retire el tampón y lávelo con pbs dos veces más. Transfiera los túbulos seminíferos en un tubo de dos mililitros y gírelos a 500 g durante un minuto.

Retire el sobrenadante. Agregue 500 microlitros de tampón de lisis a los túbulos y use una pipeta para romper el tejido. Transfiera la suspensión a un homogeneizador de volumen pequeño.

Rompe el tejido con siete u ocho golpes del mortero de vidrio. Transfiera el lisado a un tubo de microcentrífuga. Centrifugar la muestra a 12.000 g a cuatro grados centígrados durante ocho minutos para eliminar el lisado.

Transfiera el sobrenadante a un tubo nuevo y manténgalo en hielo. Luego, proceda con la preparación del gradiente de sacarosa. Preparación del gradiente de sacarosa.

Coloque un tubo de ultracentrífuga en el microbloque y dibuje la línea a lo largo del nivel superior del bloque. Luego transfiera el tubo a una rejilla estable. Tome una jeringa de diez mililitros, con el dispositivo de capas conectado y llene la jeringa con una solución de sacarosa al 10%.

Suéltelo suavemente en el fondo del tubo de ultracentrífuga hasta que la solución de sacarosa alcance la marca. Llene otra jeringa con solución de sacarosa al 50% e inserte con cuidado su dispositivo de capas a través de la capa de sacarosa al 10% hasta el fondo del tubo. Libere suavemente la solución de sacarosa, comenzando desde la parte inferior hasta que llegue a la marca en el tubo.

A continuación, selle el tubo con la tapa suministrada. Para preparar el degradado de sacarosa, encienda el dispositivo de creación de degradado. Luego nivele la placa usando los botones arriba o abajo y presione listo.

Después de nivelar la placa, presione grad. Vaya al menú de lista de degradados y seleccione el rotor SW41. A continuación, elija el gradiente de sacarosa deseado.

Presione usar. Coloque el soporte del tubo de la base del imán en el generador de degradados. A continuación, transfiera el tubo al soporte.

Se pueden preparar hasta seis gradientes al mismo tiempo. Presione ejecutar. El creador de gradientes gira los tubos a la velocidad y los ángulos del programa, formando un gradiente lineal.

Solo tomará unos minutos preparar el degradado. Cuando se complete el proceso, coloque el tubo en una rejilla. Retire el volumen, igual al volumen de la muestra, de la parte superior de los tubos de ultracentrífuga con gradientes de sacarosa.

Cargue con cuidado 500 microlitros del lisado encima. Coloque los tubos en los cubos del rotor y equilibrelos. Centrifugar a 260.000 g durante dos horas a cuatro grados centígrados.

Fraccionamiento de polisomas y recolección de muestras. Después de la ultracentrifugación, coloque los tubos en los cubos del rotor sobre hielo. Encienda el colector de fracciones y el fraccionador.

Haga clic en escanear en el menú del fraccionador. Coloque una rejilla con tubos de recolección en el colector de fracciones. Llene un depósito de enjuague, en el costado del fraccionador con agua desionizada.

Presione la tecla de enjuague durante diez segundos para enjuagar la bomba. Conecte un adaptador de enjuague con la jeringa llena de agua al pistón para la calibración. Abra el software del fraccionador en la computadora.

Presione calibrar. Use la configuración predeterminada y presione Ok.Be listo para inyectar agua de la jeringa. Presione Ok para realizar la calibración.

Inmediatamente comience a inyectar agua durante los próximos cinco segundos. Aparecerá el signo Calibración cero completada. Retire un adaptador de enjuague con la jeringa y coloque una punta en el pistón del fraccionador.

Abra la válvula de aire de latón y presione la tecla de aire durante diez segundos para secar la tubería de aire y la celda de flujo. Cierre la válvula de aire. Tome el tubo de gradiente del cucharón del rotor y colóquelo en el estante.

Coloque la tapa del soporte del tubo en la parte superior del tubo y mueva con cuidado el tubo dentro del soporte del tubo y bloquéelo. Coloque el soporte debajo del pistón. A menudo, las bandas polisomales se pueden ver a simple vista.

Introduzca los ajustes deseados para los números de fracciones y el volumen. Asigne un nombre al archivo y presione Aceptar, luego vaya al botón gráfico. En la siguiente ventana, presione iniciar escaneo.

Aparecerán los ajustes y presione Ok. El colector se moverá de la canaleta a la primera fracción, y el pistón se moverá hacia el tubo. Cuando el pistón llegue a la parte superior de la pendiente, reducirá la velocidad seleccionada y se recogerán las fracciones. Por lo general, recolectamos 24 fracciones de 500 microlitros cada una.

Cuando se complete, el pistón se moverá fuera del tubo de gradiente. Abra la válvula de aire de latón. Presione la tecla de aire en el fraccionador para recuperar la última fracción.

Al final de la carrera verás el perfil de absorbancia del gradiente. Análisis de las fracciones. Las fracciones obtenidas se pueden utilizar para el análisis de ARN y proteínas.

El ARN puede analizarse mediante electroforesis seguida de Northern Blot o utilizarse para la producción de ADNc, seguida de una reacción RT-qPCR para analizar la asociación de ARNm individuales con polisomas. La secuenciación de próxima generación se puede utilizar para analizar el estado de traducción de los ARNm a escala de transcriptoma. Para el análisis de proteínas de fracciones polisomales, las proteínas se precipitan con ácido triclurícerico para concentrarlas.

A continuación, las proteínas se analizan mediante Western Blotting, o mediante Mass Spec a nivel de proteoma. Resultados. Aquí presentamos los resultados del fraccionamiento de polisomas y el análisis sobre los ejemplos de tres organismos. Leishmania, células humanas cultivadas y tejido de ratón.

El fraccionamiento de polisomas se utilizó para estudiar la asociación del ARNm de Sherp y Tubulina con ribosomas durante la traducción y Leishmania major. El gráfico de absorbancia para el fraccionamiento tiene una forma distinta con picos típicos para las subunidades de ribosoma 40S y 60S, monosomas 80S y polisomas. Las alícuotas de las fracciones se combinaron en tres grupos.

Prepolisomas, polisomas ligeros y polisomas pesados. Los niveles relativos de ARNm se estudiaron mediante una PCR cuantitativa en tiempo real. Los datos sugieren que el ARNm de la tubulina se traduce activamente.

Ya que se asoció principalmente con polisomas pesados y ligeros. Mientras que la traducción del ARNm del sherp es menos activa. Se encontró principalmente en asociación con prepolisomas y polisomas ligeros.

Por lo tanto, este experimento demuestra claramente la capacidad de la técnica para estudiar la participación de un ARNm individual en la traducción. Esta figura presenta un gráfico de absorbancia típico del fraccionamiento de polisomas de las células HeLa. Las proteínas se concentraron por precipitación con ácido tricloroacético al 10%.

La proteína ribosómica de subunidad pequeña RPS6 y la proteína ribosómica de subunidad grande RPL11 se detectaron mediante Western Blot. Su distribución se correlacionó bien con los distintos picos, en el espectro de absorbancia. En esta figura, presentamos un ejemplo de la detección de ARN ribosómicos por electroforesis en polisomas fraccionados del testículo de ratón. Conclusiones.

El perfil polisomal es una técnica versátil que se puede utilizar para analizar el estado de traducción de ARNm individuales, examinar proteínas asociadas a ribosomas y estudiar la regulación traduccional en diferentes organismos modelo en diferentes condiciones.