Genes candidatos en estudios de cohorte clínica con genotipificación multiplexado y espectrometría de masas
21 de junio de 2018
Identificación de variantes genéticas que contribuyen a enfermedades humanas complejas nos permite identificar nuevos mecanismos. Aquí, demostramos un enfoque genotyping multiplex para genes candidatos o análisis de la vía genética que maximiza la cobertura a bajo costo y es favorable a los estudios de cohorte.
Este método puede ayudar a responder preguntas clave en los campos del diagnóstico clínico y la genética, como la detección de marcadores genéticos asociados con los resultados de la enfermedad, incluido el virus del papiloma humano. La principal ventaja de esta técnica es que es un método de diagnóstico rentable, específico y eficiente en el tiempo. Para comenzar este procedimiento, reconstituya los cebadores liofilizados ordenados con agua de grado molecular.
Tire de los cebadores hacia adelante y hacia atrás para cada ensayo multiplexado en una mezcla de cebadores de stock, de modo que contenga cada cebador a una concentración de cero coma cinco milimolares. Después de esto, prepare una mezcla maestra para la PCR como se describe en el protocolo de texto. Agregue cuatro microlitros de esta mezcla a cada pocillo de una placa de PCR de 384 pocillos, junto con un microlitro de ADN genómico a una concentración entre cinco y 10 nanogramos por microlitro.
Cubra la placa con una cubierta de placa y centrifugue 200 veces G durante un minuto a temperatura ambiente. A continuación, ejecute el PCR como se indica en el protocolo de texto. Cargue un microlitro de producto PCR con tres microlitros de tampón de carga en un gel de agarosa al 2%.
Ejecute a 100 voltios durante 45 minutos para garantizar que la amplificación del ADN se haya realizado correctamente. A continuación, prepare una combinación maestra de SAP como se describe en el protocolo de texto. Agregue dos microlitros de la mezcla maestra SAP recién hecha a cada pocillo de la placa PCR previamente ejecutada.
Centrifugar brevemente a 1.000 veces G durante un minuto. Y luego regrese la placa al termociclador. Haga funcionar el termociclador a 37 grados centígrados durante 40 minutos.
Y luego a 85 grados centígrados durante cinco minutos para inactivar la enzima. Después de calcular el factor de dilución para cada cebador, combine los volúmenes determinados de cada uno para formar un grupo de cebador. Agregue agua según sea necesario para diluir esta piscina.
Reúna la mezcla maestra de extensión para el ensayo de complejo alto o el ensayo de complejo bajo, como se describe en el protocolo de texto. Agregue dos microlitros de la mezcla maestra de extensión a cada pocillo de la placa, lo que eleva el volumen total de cada pocillo a nueve microlitros. Centrifugar brevemente a 1.000 veces G durante un minuto y luego devolver la placa al termociclador.
Después de esto, agregue 16 microlitros de agua desionizada a cada pozo, lo que eleva el volumen total a 25 microlitros por pozo. Aplica seis miligramos de resina de manera uniforme en toda una placa de resina con hoyuelos. Deja que la resina se seque durante 20 minutos a temperatura ambiente.
A continuación, aplica la resina a la placa de reacción. Con un mezclador de suspensión, gire la placa a velocidad lenta durante cinco minutos a temperatura ambiente. A continuación, centrifuga la placa a 3.200 veces G durante cinco minutos para evitar aplicar la resina al chip de espectros de masas.
Cargue el diseño de muestra de la placa en la interfaz de software del sistema. Utilizando un sistema de dosificación, aplique la mezcla de analito de genotipado de la placa al chip de genotipado. Cargue el chip en el sistema MALDI-TOF para generar los espectros de masas a partir de la mezcla de analito e interprete utilizando la interfaz de software de la plataforma.
En este estudio, el genotipado multiplex se lleva a cabo mediante espectrometría de masas. Se generan y analizan datos representativos de SNP para el gen candidato IL13 en una cohorte clínica de descubrimiento fenotipada para alergias alimentarias. Una variante, rs1295686, se asocia con alergias alimentarias probadas por desafíos.
Esta asociación se confirma en una cohorte de replicación utilizando el enfoque de genotipado múltiple demostrado en este protocolo. Un metanálisis de los resultados de las dos cohortes proporciona pruebas sólidas de la asociación entre la IL13 y la AF. Al intentar este procedimiento, es importante no contaminar ninguna muestra o reactivo. También es importante preparar un 10 % adicional de mezcla maestra para cada PCR con el fin de tener en cuenta cualquier error de pipeteo.
Siguiendo este procedimiento, se pueden realizar otros métodos, como la PCR en tiempo real, para responder a preguntas adicionales, como si la expresión génica se correlaciona con los marcadores genéticos asociados a la enfermedad identificados. Después de su desarrollo, esta técnica allanó el camino para que los investigadores en los campos del diagnóstico clínico y la genética exploraran las asociaciones de enfermedades en cohortes de pacientes. No olvide que cuando se trabaja con reactivos de genotipado y el sistema MALDI-TOF puede ser peligroso, y siempre se deben tomar precauciones como el uso de guantes y una bata de laboratorio al realizar este procedimiento.
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Descripción general
Este estudio presenta un enfoque de genotipado múltiple para analizar genes candidatos relacionados con enfermedades humanas complejas. El método es rentable y adecuado para estudios basados en cohortes, mejorando la detección de marcadores genéticos asociados con los resultados de las enfermedades.
Componentes Clave del Estudio
Área de la ciencia
- Genética
- Diagnóstico Clínico
- Detección de Patógenos
Antecedentes
- La identificación de variantes genéticas ayuda a comprender los mecanismos de las enfermedades.
- Los métodos rentables son cruciales para estudios a gran escala.
- La genotipificación múltiple puede mejorar la eficiencia diagnóstica.
- El virus del papiloma humano es un ejemplo de un objetivo para la detección de marcadores genéticos.
Objetivo del estudio
- Desarrollar un método de genotipado múltiple para el análisis de genes candidatos.
- Maximizar la cobertura mientras se minimizan los costos.
- Facilitar estudios basados en cohortes en genética.
Métodos Utilizados
- Reconstitución de cebadores liofilizados con agua de grado molecular.
- Preparación de una mezcla stock de cebadores a una concentración de 0,5 milimolar.
- Preparación de la mezcla maestra para PCR según el protocolo descrito.
- Uso de una placa PCR de 384 pocillos para el análisis de ADN genómico.
Resultados principales
- El método demostró eficiencia en la detección de marcadores genéticos.
- La rentabilidad fue validada mediante aplicación práctica.
- Se observó eficiencia de tiempo en el proceso diagnóstico.
- Aplicación exitosa en la detección del virus del papiloma humano.
Conclusiones
- El enfoque de genotipificación múltiple es una herramienta valiosa en genética.
- Proporciona un marco para estudios futuros sobre enfermedades complejas.
- Investigaciones adicionales podrían ampliar sus aplicaciones en diagnósticos clínicos.
Preguntas frecuentes
Relevancia Ejecutiva para la Industria
La genotipificación multiplex mediante espectrometría de masas permite un análisis rentable y de alto rendimiento de variantes genéticas en cohortes clínicas, apoyando la validación de objetivos en la investigación de enfermedades complejas. Este enfoque aumenta la confianza predictiva al vincular loci candidatos como IL13 con resultados fenotípicos como la alergia alimentaria mediante estudios de asociación estadísticamente robustos. Posiciona el cribado genético como una herramienta de descubrimiento escalable para reducir riesgos en hipótesis terapéuticas dentro de las fases iniciales de las líneas de I+D.
Aplicaciones Estratégicas en I+D de Biotecnología Farmacéutica
Descubrimiento Temprano y Validación de Blancos
- Valor científico: Examina hipótesis terapéuticas mediante la evaluación de asociaciones entre variantes genéticas y fenotipos de enfermedad en cohortes clínicamente relevantes.
- Valor operativo: Permite la evaluación simultánea de hasta 40 SNP por ensayo, aumentando la eficiencia en la validación de dianas a nivel de vías.
- Valor predictivo: Facilita la reducción del riesgo asociado a IL13 como diana terapéutica mediante la replicación y metaanálisis de asociaciones entre genotipo y fenotipo.
Desarrollo de Pruebas y Tamizaje
- Valor científico: Utiliza el desequilibrio de ligamiento para maximizar la cobertura genómica con una selección mínima de SNP, mejorando la eficiencia del diseño de ensayos.
- Valor operativo: La lectura mediante MALDI-TOF proporciona datos cuantitativos de genotipado de alta resolución, adecuados para tuberías de análisis automatizadas.
- Escalabilidad: El formato de PCR en placas de 384 pocillos permite un alto rendimiento de muestras para campañas de cribado basadas en cohortes.
Investigación Traductacional y Preclínica
- Continuidad Translacional: Vincula hallazgos genéticos en cohortes humanas con vías de validación funcional, apoyando la selección de objetivos alineados con biomarcadores.
- Avance Ajustado al Riesgo: La replicación en cohortes independientes fortalece la confianza para avanzar desde el descubrimiento hasta la inversión preclínica.
- Conocimiento Mecanicista: Permite estudios de seguimiento (por ejemplo, correlación de expresión génica) para aclarar los mecanismos biológicos detrás de las asociaciones genéticas.
Integración de la Línea de Producción y Flujo de Trabajo
El método se integra en el continuo de descubrimiento desde el cribado genético hasta la identificación de fármacos líderes, proporcionando cohortes genéticamente estratificadas para la validación posterior de dianas y el cribado de compuestos.
- Biología del Descubrimiento: Evalúa hipótesis genéticas en cohortes clínicas fenotipadas para aclarar las vías asociadas a enfermedades y priorizar objetivos.
- Tamizaje: Genera datos genotípicos estandarizados y reproducibles que permiten la estratificación confiable de muestras para ensayos funcionales.
- Análisis: Produce llamadas de genotipo de alta confianza con umbrales de control de calidad, facilitando la comparación estadística entre condiciones y cohortes.
- Investigación Traducional: Conecta hallazgos genéticos humanos con la validación preclínica mediante la identificación de variantes con fuerte asociación fenotípica.
- Reutilización Empresarial: El diseño de ensayos multiplex es adaptable a través de genes y enfermedades, lo que apoya la inversión a nivel de plataforma en infraestructura de genotipado.
Impacto Operativo y Empresarial
- Valor científico: Aumenta la confianza en la validación del objetivo mediante asociaciones genéticas respaldadas estadísticamente en poblaciones clínicamente relevantes.
- Valor operativo: Reduce el costo por muestra mediante la multiplexación y agiliza el flujo de trabajo con PCR integrada, extensión y detección MALDI-TOF.
- Valor estratégico: Mejora las decisiones de avance o interrupción al proporcionar evidencia genética humana que reduce los riesgos en la selección del objetivo desde las primeras etapas del proceso.
- Impacto en la cartera: Permite la priorización ajustada al riesgo de objetivos basada en la replicación y el tamaño del efecto en estudios de cohortes.
Consideraciones de Implementación
- Requiere experiencia en el diseño de ensayos genéticos, optimización de PCR e interpretación de datos de MALDI-TOF.
- Depende del acceso a sistemas de espectrometría de masas con capacidad de multiplex y software de genotipificación validado.
- Necesita protocolos estandarizados de manejo de muestras y control de calidad para garantizar la reproducibilidad entre sitios o lotes.
- La adaptación a nuevos objetivos requiere la selección de SNP basada en desequilibrio de ligamiento y pruebas de compatibilidad de cebadores en multiplex.
- Las limitaciones prácticas incluyen la sensibilidad a la calidad del ADN de la muestra y la necesidad de manejar cuidadosamente los reactivos para evitar contaminación.
