Un modelo In Vitro para estudiar el efecto de la terapia fotodinámica mediada por el ácido aminolevulínico 5 de Biofilm de Staphylococcus aureus

El objetivo general de este experimento es evaluar el efecto antimicrobiano de la terapia fotodinámica mediada por ácido cinco aminolevulínico o ALA en una biopelícula de Staphylococcus aureus. Este método puede responder a preguntas clave en el campo de las biopelículas bacterianas sobre cómo la reparación celular fotodinámica podría utilizarse como tratamiento alternativo para controlar las infecciones por biopelículas. Una ventaja de este procedimiento es que tiene el potencial de ser utilizado para otras bacterias con un ajuste mínimo.

Para generar una biopelícula en una placa de 96 pocillos, primero se inoculó un Staphylococcus aureus de menos 80 grados centígrados en tres biopelículas formando cultivos de cepas clínicas en tubos individuales de 14 mililitros de fondo redondo que contenían cinco mililitros de caldo de soja triptona, o TSB, medio, en una incubadora de 37 grados centígrados con agitación durante la noche. Cuando los cultivos hayan alcanzado la fase estacionaria, centrifugar las células bacterianas y volver a suspender los gránulos y el PBS a una concentración de dos veces 10 a la novena unidad formadora de colonias por mililitro. Diluir estas suspensiones bacterianas en una proporción de uno a 200 y medio TSB suplementado con cero coma cinco por ciento de glucosa y sembrar 200 microlitros de células bacterianas por pocillo en tres pocillos por cepa por grupo experimental en una microplaca de 96 pocillos tratada con cultivo celular de poliestireno para una incubación de 24 horas a 37 grados Celsius, con oxígeno, sin temblar.

Al día siguiente, lave suavemente los pocillos tres veces con PBS sin alterar las biopelículas. A continuación, agregue 200 microlitros de ALA recién preparado a los pocillos experimentales apropiados y coloque la placa a 25 grados centígrados durante una hora protegida de la luz. A continuación, irradie la placa con un diodo emisor de luz a una intensidad de luz de 100 milivatios por centímetro cuadrado durante una hora.

Para contar el número de bacterias viables por grupo al final del tratamiento de fototerapia, lave suavemente cada pocillo tres veces con PBS para eliminar las células no adherentes. A continuación, utilice una punta de pipeta para raspar las bacterias adheridas del fondo de cada pocillo. Extraer las células de cada grupo en un tubo eppendorf por condición experimental y granular las células por centrifugación.

Vuelva a suspender los gránulos en un mililitro de enzima pancreatina al 0,25 por ciento y PBS para una incubación de 90 minutos a 37 grados centígrados, seguida de otra centrifugación. Vuelva a suspender los gránulos en 200 microlitros de PBS y realice de una a 10 diluciones en serie de cada grupo, añadiendo cinco microlitros de muestra diluida en serie en placas individuales de agar de soja con triptona. A continuación, incubar las placas a 37 grados centígrados durante 16 horas y contar el número de colonias bacterianas por grupo.

Para evaluar las biopelículas mediante microscopía de barrido láser confocal, genere e irradie las biopelículas como se ha demostrado. Lavar las biopelículas irradiadas con PBS y teñir las células vivas y muertas con un mililitro de un colorante verde fluorescente permeable a la membrana celular procariota nuclear y cromosómica y un mililitro de yoduro de propidio micromolar, respectivamente. Después de 20 minutos, elimine el exceso de tinción y obtenga imágenes de las biopelículas mediante microscopía de escaneo láser confocal bajo una lente de objetivo de inmersión en aceite de 63 veces 1.4 NA.

La viabilidad de las bacterias de biofilm disminuye después del doble tratamiento de fototerapia con ALA en comparación con la viabilidad bacteriana de la biopelícula de control simple o no tratada y las cuatro cepas probadas. La visualización de las biopelículas mediante microscopía de barrido láser confocal confirma este hallazgo, y la mayoría de las células positivas para yoduro de propidio se observaron en el grupo de doble tratamiento con fototerapia ALA. Al intentar este procedimiento, es importante recordar que toda la manipulación de las bacterias tratadas con ALA debe realizarse en la oscuridad, y la biopelícula del material debe manipularse con cuidado para evitar perturbar la biopelícula formada.

Este mensaje se puede aplicar para explorar el efecto antimicrobiano de la terapia fotodinámica en la biopelícula bacteriana in vitro por los investigadores en el campo de la infección bacteriana.