Un modelo In Vitro para estudiar el efecto de la terapia fotodinámica mediada por el ácido aminolevulínico 5 de Biofilm de Staphylococcus aureus
16 de abril de 2018
Este manuscrito describe un protocolo para estudiar el efecto antimicrobiano de terapia fotodinámica mediada por el ácido de 5-aminolevulínico (ALA-PDT) en el biofilm de Staphylococcus aureus . Este protocolo puede utilizarse para desarrollar un modelo de vitro para estudiar el tratamiento de los biofilms bacterianos con TFD en el futuro.
El objetivo general de este experimento es evaluar el efecto antimicrobiano de la terapia fotodinámica mediada por ácido cinco aminolevulínico o ALA en una biopelícula de Staphylococcus aureus. Este método puede responder a preguntas clave en el campo de las biopelículas bacterianas sobre cómo la reparación celular fotodinámica podría utilizarse como tratamiento alternativo para controlar las infecciones por biopelículas. Una ventaja de este procedimiento es que tiene el potencial de ser utilizado para otras bacterias con un ajuste mínimo.
Para generar una biopelícula en una placa de 96 pocillos, primero se inoculó un Staphylococcus aureus de menos 80 grados centígrados en tres biopelículas formando cultivos de cepas clínicas en tubos individuales de 14 mililitros de fondo redondo que contenían cinco mililitros de caldo de soja triptona, o TSB, medio, en una incubadora de 37 grados centígrados con agitación durante la noche. Cuando los cultivos hayan alcanzado la fase estacionaria, centrifugar las células bacterianas y volver a suspender los gránulos y el PBS a una concentración de dos veces 10 a la novena unidad formadora de colonias por mililitro. Diluir estas suspensiones bacterianas en una proporción de uno a 200 y medio TSB suplementado con cero coma cinco por ciento de glucosa y sembrar 200 microlitros de células bacterianas por pocillo en tres pocillos por cepa por grupo experimental en una microplaca de 96 pocillos tratada con cultivo celular de poliestireno para una incubación de 24 horas a 37 grados Celsius, con oxígeno, sin temblar.
Al día siguiente, lave suavemente los pocillos tres veces con PBS sin alterar las biopelículas. A continuación, agregue 200 microlitros de ALA recién preparado a los pocillos experimentales apropiados y coloque la placa a 25 grados centígrados durante una hora protegida de la luz. A continuación, irradie la placa con un diodo emisor de luz a una intensidad de luz de 100 milivatios por centímetro cuadrado durante una hora.
Para contar el número de bacterias viables por grupo al final del tratamiento de fototerapia, lave suavemente cada pocillo tres veces con PBS para eliminar las células no adherentes. A continuación, utilice una punta de pipeta para raspar las bacterias adheridas del fondo de cada pocillo. Extraer las células de cada grupo en un tubo eppendorf por condición experimental y granular las células por centrifugación.
Vuelva a suspender los gránulos en un mililitro de enzima pancreatina al 0,25 por ciento y PBS para una incubación de 90 minutos a 37 grados centígrados, seguida de otra centrifugación. Vuelva a suspender los gránulos en 200 microlitros de PBS y realice de una a 10 diluciones en serie de cada grupo, añadiendo cinco microlitros de muestra diluida en serie en placas individuales de agar de soja con triptona. A continuación, incubar las placas a 37 grados centígrados durante 16 horas y contar el número de colonias bacterianas por grupo.
Para evaluar las biopelículas mediante microscopía de barrido láser confocal, genere e irradie las biopelículas como se ha demostrado. Lavar las biopelículas irradiadas con PBS y teñir las células vivas y muertas con un mililitro de un colorante verde fluorescente permeable a la membrana celular procariota nuclear y cromosómica y un mililitro de yoduro de propidio micromolar, respectivamente. Después de 20 minutos, elimine el exceso de tinción y obtenga imágenes de las biopelículas mediante microscopía de escaneo láser confocal bajo una lente de objetivo de inmersión en aceite de 63 veces 1.4 NA.
La viabilidad de las bacterias de biofilm disminuye después del doble tratamiento de fototerapia con ALA en comparación con la viabilidad bacteriana de la biopelícula de control simple o no tratada y las cuatro cepas probadas. La visualización de las biopelículas mediante microscopía de barrido láser confocal confirma este hallazgo, y la mayoría de las células positivas para yoduro de propidio se observaron en el grupo de doble tratamiento con fototerapia ALA. Al intentar este procedimiento, es importante recordar que toda la manipulación de las bacterias tratadas con ALA debe realizarse en la oscuridad, y la biopelícula del material debe manipularse con cuidado para evitar perturbar la biopelícula formada.
Este mensaje se puede aplicar para explorar el efecto antimicrobiano de la terapia fotodinámica en la biopelícula bacteriana in vitro por los investigadores en el campo de la infección bacteriana.
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Descripción general
Este manuscrito describe un protocolo para estudiar el efecto antimicrobiano de la terapia fotodinámica mediada por el ácido 5-aminolevulínico (ALA-PDT) sobre un biofilm de Staphylococcus aureus. Este método puede responder preguntas clave en el campo de los biofilms bacterianos sobre tratamientos alternativos para el control de infecciones por biofilms.
Componentes Clave del Estudio
Área de la ciencia
- Microbiología
- Terapia fotodinámica
- Investigación sobre biopelículas
Antecedentes
- Staphylococcus aureus es un patógeno común asociado con infecciones por biopelículas.
- La terapia fotodinámica (PDT) es un tratamiento que utiliza compuestos activados por la luz para matar bacterias.
- El ácido 5-aminolevulínico (ALA) es un precursor en la síntesis de fotosensibilizadores utilizados en la PDT.
- Este estudio tiene como objetivo desarrollar un modelo in vitro para evaluar la PDT con ALA en biopelículas bacterianas.
Objetivo del estudio
- Evaluar el efecto antimicrobiano de la PDT mediada por ALA sobre biofilms de Staphylococcus aureus.
- Explorar el potencial de la PDT como tratamiento alternativo para infecciones por biofilms.
- Establecer un protocolo que pueda adaptarse a otras cepas bacterianas.
Métodos Utilizados
- Inoculación de Staphylococcus aureus en caldo de triptona soya (TSB) para formar biopelículas.
- Incubación de los cultivos a 37 grados Celsius para alcanzar la fase estacionaria.
- Centrifugación y resuspensión de las células bacterianas en PBS.
- Siembra de células bacterianas en una microplaca de 96 pocillos para el tratamiento con PDT.
Resultados principales
- El protocolo genera con éxito biopelículas adecuadas para probar la PDT-ALA.
- La PDT-ALA demostró efectos antimicrobianos potenciales contra biopelículas de Staphylococcus aureus.
- El método puede adaptarse para otras cepas bacterianas con ajustes mínimos.
- Se necesitan estudios adicionales para optimizar las condiciones de tratamiento.
Conclusiones
- La PDT con ALA es un enfoque prometedor para el tratamiento de biopelículas bacterianas.
- Este estudio proporciona una base para futuras investigaciones en terapia fotodinámica.
- Comprender los mecanismos de la PDT puede conducir a estrategias de tratamiento mejoradas para infecciones relacionadas con biopelículas.
Preguntas frecuentes
Relevancia Ejecutiva para la Industria
Este modelo in vitro permite la evaluación mecanicista de la terapia fotodinámica (PDT) para infecciones asociadas a biopelículas, un desafío creciente en el desarrollo de agentes antimicrobianos. Al cuantificar unidades formadoras de colonias y visualizar la viabilidad mediante microscopía confocal, el ensayo proporciona resultados cuantitativos y reproducibles para reducir los riesgos de los candidatos a PDT en las primeras etapas del descubrimiento. La plataforma apoya la validación de dianas y la identificación de compuestos prometedores para estrategias anti-biopelícula, particularmente relevantes para Staphylococcus aureus y otros patógenos formadores de biopelículas.
Aplicaciones Estratégicas en I+D de Biofármacos
Descubrimiento Temprano y Validación de Blancos
- Valor científico: Examina la hipótesis terapéutica de la eficacia de la PDT con ALA frente a biofilms de S. aureus mediante la reducción de UFC y tinción de viabilidad.
- Valor operativo: Permite la validación funcional del blanco al vincular la activación del fotosensibilizador con los mecanismos de eliminación bacteriana en un modelo de biofilm controlado.
- Valor predictivo: Apoya las decisiones preclínicas de continuar o descartar al demostrar efectos antimicrobianos dependientes de la dosis y del tiempo bajo condiciones estandarizadas.
Desarrollo de ensayos y cribado
- Listo para ensayo: Genera biopelículas maduras y reproducibles de S. aureus en formato de placa de 96 pocillos, adecuado para cribado de alto rendimiento de compuestos en PDT.
- Resultado cuantitativo: Proporciona recuentos de UFC y datos de microscopía confocal como lecturas independientes para evaluar la potencia del compuesto y la penetración en la biopelícula.
- Reutilización de la plataforma: Adaptable a otras cepas bacterianas y fotosensibilizadores con ajustes mínimos del protocolo, lo que permite aplicaciones amplias en cribado de agentes antiinfecciosos.
Investigación Traductacional y Preclínica
- Relevancia para la Enfermedad: Modela infecciones clínicamente relevantes por biofilm de S. aureus, conectando hallazgos in vitro con la validación preclínica de agentes antiinfecciosos basados en PDT.
- Reducción de Riesgos Mecanísticos: Clarifica el mecanismo de la PDT mediante tinción de células vivas/muertas, reduciendo la ambigüedad en las vías de erradicación del biofilm.
- Continuidad Traducible: Apoya la toma de decisiones de avance al proporcionar datos reproducibles de inhibición del biofilm en múltiples cepas y réplicas experimentales.
Integración de la tubería y flujo de trabajo
El ensayo se integra en el continuo de descubrimiento de antibacterianos, desde la validación del blanco hasta la optimización del fármaco líder y las pruebas de eficacia preclínicas, especialmente para modalidades dirigidas a biopelículas.
- Biología del Descubrimiento: Evalúa hipótesis mecanicistas sobre la interrupción del biofilm inducida por la PDT y la pérdida de viabilidad bacteriana en un modelo fisiológicamente relevante.
- Tamizaje: Permite la evaluación estandarizada de fotosensibilizadores y parámetros de dosis de luz para la actividad anti-biofilm.
- Análisis: Proporciona métricas de reducción de UFC y viabilidad basadas en fluorescencia para comparar condiciones de tratamiento y guiar las relaciones estructura-actividad.
- Investigación Traducional: Conecta la inhibición de biofilm in vitro con modelos de eficacia preclínica mediante puntos finales cuantificables y reproducibles.
- Reutilización Empresarial: Establece una plataforma modular de PDT contra biofilms aplicable a múltiples objetivos patógenos y quimiotipos de fotosensibilizadores.
Impacto Operativo y Empresarial
- Valor científico: Reduce la ambigüedad mecanicista en las interacciones entre la PDT y los biofilms mediante la visualización y cuantificación directas de la muerte bacteriana.
- Valor operativo: Ofrece un procedimiento estandarizado y protegido de la luz, con pasos definidos de incubación, irradiación y lectura de resultados, para garantizar la reproducibilidad entre laboratorios.
- Valor estratégico: Mejora la confianza en la toma de decisiones de avance o interrupción de candidatos a PDT al proporcionar datos tempranos de eficacia en un modelo de biofilm clínicamente relevante.
- Impacto en la cartera: Permite la priorización ajustada al riesgo de programas de PDT al identificar compuestos con capacidad demostrable de penetración en biofilms y actividad antimicrobiana.
Consideraciones de Implementación
- Requiere experiencia en técnicas microbiológicas, cultivo de biopelículas y protocolos de seguridad fotobiológicos.
- Depende de equipos para exposición controlada a la luz (por ejemplo, medidor de irradiación LED) y microscopía de fluorescencia o lectora de placas para obtener recuentos de UFC e imágenes.
- Necesita la estandarización de la preparación de ALA, el tiempo de incubación y la administración de luz entre los grupos experimentales para garantizar la reproducibilidad.
- La adaptación a otras cepas bacterianas puede requerir la optimización de las condiciones de formación de biopelículas y la eficiencia de absorción del fotosensibilizador.
- Limitación práctica: la susceptibilidad de las biopelículas puede variar según la fase de crecimiento y la composición de la matriz, lo que exige controles rigurosos en estudios comparativos.
