Name: Interacción planta-microorganismo: Respuesta transcripcional de Bacillus Mycoides a exudados de raíces de papa (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-07-02T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 59 s
Description: Aprende a analizar la respuesta transcripcional de Bacillus mycoides a exudados de raíz de papa. Este método identifica genes bacterianos clave en interacciones planta-microorganismo aplicable a diversos endófitos.

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Agradecemos a Jakob Viel por sus valiosos comentarios y sugerencias. También agradecemos a Anne de Jong por su ayuda en el análisis de la bioinformática. Yanglei Yi y Zhibo Li son apoyados por el Consejo de becas de China (CSC). Agradecemos a NWO-TTW Perspectief Programma Back2Roots (TKI-AF-15510) por su apoyo financiero a OPK.

1. germinación de patatas en condiciones estériles
<ol><li>Enjuague la superficie de la patata con agua estéril. Bañar la patata en etanol al 70% y luego en hipoclorito de sodio 3%, durante 5 minutos. Enjuague nuevamente con agua destilada para eliminar cualquier resto de hipoclorito sódico.</li>
	<li>Preparar los materiales necesarios para la germinación y crecimiento de tubérculos de papa; esterilizar las macetas de plástico, cestas de engraftment, vermiculita y agua en autoclave a 121 ° C por 20 min. Nota: Asegúrese de que todos los materiales utilizados son esterilizables en autoclave. De lo contrario, utilice otros métodos de esterilización.</li>
	<li>Ponga la patata superficie esterilizada en la cesta de engraftment y colóquelo en un recipiente esterilizado que contiene vermiculita húmeda.</li>
	<li>Mantenga el recipiente en una cámara climática a 24 ° C durante tres semanas. Establece en ciclos de 16 h de luz (120 μmol m-2s-1) y 8 h de oscuridad. Para evitar contaminaciones microbianas, use una caja de fibra de vidrio grande para cubrir la olla.</li>
</ol>2. recogida de exudados de raíces de papa
<ol><li>Cuando el brote de los brotes, la transferencia la cesta con la patata entera en un vaso esterilizado con 150 mL de agua desionizada en autoclave, con la patata tubérculos colocados justo encima de la superficie del agua y las raíces sumergieron en el agua (ver figura 1). Mantener la planta en la cámara climática y utilizar la misma configuración que antes [24 ° C; ciclos de 16 horas de luz (120 μmol m-2s-1), 8 h de oscuridad].</li>
	<li>Desde el segundo día, recoger el agua que contiene el exudado y rellenar el vaso con agua desionizada estéril. Realizar el muestreo cada día hasta el séptimo día después de la transferencia de la plántula.</li>
	<li>Almacenar cada muestra por separado a 4 ° C. Para cada muestra, extensión 100 μL en una Luria-Bertani (LB; 1% triptona, extracto de levadura 0.5%, 0.5% NaCl) placa de agar para verificar la contaminación microbiana. Deseche las muestras contaminadas.</li>
	<li>Combine las muestras recolectadas de una planta de semillero y concentrado por liofilización a-40 ° C hasta un volumen final de 150 mL.</li>
</ol>3. bacterias
<ol><li>Una cepa B. mycoides la raya de un stock de glicerol de-80 ° C sobre una placa de agar LB e incubar la placa a 30 ° C durante la noche.</li>
	<li>Inocular un medio líquido LB con una sola Colonia de la placa y hacer crecer la cultura en un incubador de agitación a 200 rpm durante la noche a 30 ° C.</li>
</ol>4. tratamiento y muestreo de bacterias
<ol><li>Para comparar la curva de crecimiento de las bacterias tratadas con exudados de la raíz a un control negativo, preparar una serie de matraces de 50 ml de medio líquido LB. Añadir 0,5 mL del cultivo bacteriano durante la noche a todos los matraces y agregar el 0%, 5%, 10% o 15% (v/v) exudado de raíz o agua desionizada estéril al medio, respectivamente.</li>
	<li>Utilizar una cultura con agua desionizada en lugar de exudados de la raíz como un control. Medir la densidad óptica a 600 nm (OD600) cada 1 h después. Generar una curva de crecimiento mediante la representación de los valores de OD600 versus tiempo. Nota: Hemos visto que el 10% de los exudados de la raíz no afectó el crecimiento de B. mycoides (ver figura 2); Esta relación fue utilizada para experimentos de RNA-seq.</li>
	<li>Diluir una noche cultura B. mycoides con 90 mL de medio LB con el OD inicial600 de ~ 0.05 en un matraz de 300 mL. Añadir 10 mL de exudados de la raíz a la cultura e incubar a 30 ° C por 1 h.</li>
	<li>Utilizar un tratamiento de agua desionizada estéril de 10 mL como control. Recoger las células de la cultura por centrifugación a 9.000 x g durante 2 min a 4 ° C. Eliminar el sobrenadante, inmediatamente congelar la pelotilla en nitrógeno líquido y almacenarlo a-80 ° C hasta su uso.</li>
</ol>5. aislamiento de ARN
Nota: Antes de iniciar el aislamiento, preparar la mesa de trabajo, racks y pipetas por limpiarlos con una solución de descontaminación de Rnasa (véase Tabla de materiales). Use guantes en todo momento y asegúrese de que todos los tubos, consejos y soluciones son libres de Rnasa. Siempre mantenga las muestras en hielo siempre que sea posible.
<ol><li>Añadir 0,1% (v/v) de dietil pirocarbonato (DEPC) a agua ultrapura (100 μl de DEPC por 100 mL de solución), mezclar bien y mantener a temperatura ambiente durante la noche. Autoclave de la mezcla para inactivar la DEPC después del tratamiento durante la noche. Utilizar esta agua ultrapura tratada con DEPC para preparar el tampón TE [10 mM Tris-HCl (pH = 8), 1 mM EDTA] y una solución de SDS (p/v) de 10%.</li>
	<li>Descongelar los pellets de células en el hielo y suspender a cada uno en 400 μL de tampón TE (DEPC). Transferir la suspensión a tubos de tapón de rosca de 2 mL.</li>
	<li>Mezcle 300 μL de cloroformo-isoamyl alcohol (24:1 v/v) y 300 μL de fenol (fenol ácido, grado de RNA) y permite la mezcla en reposo durante 5 minutos. Tomar 500 μl de la fase superior orgánica para agregar a las células resuspendidas. Luego agregar 50 μl de SDS 10% y 0,5 g de perlas de vidrio (0,5 μm) en el tubo.</li>
	<li>Cierre firmemente la tapa y coloque el tubo en un homogeneizador de molino de grano (véase Tabla de materiales). Realizar una homogeneización de pulso s 3 × 45 con un intervalo de 1 min en hielo.</li>
	<li>Centrifugar las muestras durante 10 min a 11.000 x g (4 ° C) y transferir la fase superior a un tubo nuevo.</li>
	<li>Añadir 500 μl de cloroformo-isoamyl alcohol (24:1) a la fase superior del paso 5.5 y Centrifugue la mezcla durante 5 minutos a 11.000 x g (4 ° C). Nota: Los pasos siguientes se modificaron de las instrucciones del fabricante de un aislamiento de RNA base de filtro fibra de vidrio comercial kit (véase Tabla de materiales).</li>
	<li>Transferir 500 μl de la fase superior a un tubo nuevo, añadir 2 volúmenes (1 mL) de un tampón de lisis/encuadernación y mezclar mediante pipeteo arriba y abajo.</li>
	<li>Combinar los tubos de filtro y colección (desde el kit de aislamiento de RNA) y pipetear la mezcla del paso 5.7 para el tubo del filtro. Centrifugar los tubos por 15 s en 8.000 x g y descartar el flujo a través.</li>
	<li>Preparar 1,5 mL en tubos de microcentrífuga con 100 μl de tampón de ADNasa, 10 μl de DNasa I y 5 μl de inhibidor de Rnasa (véase Tabla de materiales). Añadir la mezcla de la solución preparada en el filtro del tubo del filtro e incube durante 20-30 min a 15-25 ° C.</li>
	<li>Realice los pasos de lavado según las instrucciones del fabricante. Utilizar 50 μl de un buffer de elución para eluir el RNA.</li>
	<li>Guardar el ARN eluído a-80 ° C y poner una película de parafina plástico alrededor de él. Al mismo tiempo, transferir unos pocos microlitros de la muestra a un tubo de microcentrífuga de 1,5 mL para llevar a cabo una verificación de calidad.</li>
</ol>6. secuenciación y control de calidad ARN
<ol><li>Compruebe el ARN con un espectrofotómetro de microvolume. Nota: Coeficientes de absorbancia a 260/280 deben estar por encima de 1,8 y cocientes en 260/230 deben estar por encima de al menos 1.8, preferiblemente por encima de 2.0.</li>
	<li>Ejecutar el ARN purificado de un instrumento de electroforesis automatizada usando el análisis de RNA recomienda kit (véase Tabla de materiales); el número de integridad del RNA (RIN) debe ser al menos por encima de 7 para proceder.</li>
	<li>Utilizar un total de 3 μg de ARN por muestra para generar bibliotecas con una preparación de biblioteca de RNA-Seq kit (véase Tabla de materiales) siguiendo las recomendaciones del fabricante. Nota: Las preparaciones de la biblioteca fueron ordenadas en una plataforma de secuenciación de alto rendimiento y se generaron extremo apareado Lee.</li>
</ol>7. datos análisis utilizando el tubería en la Web de T-REx
<ol><li>Realizar una filtración de calidad utilizando las herramientas de FASTX versión 0.0.13 (Phred puntuaciones de calidad de > 20). Recortar el raw Lee RNA-Seq de las secuencias del adaptador con la herramienta Trimmomatic. Nota: Todos los análisis posteriores se basaron en datos limpios con alta calidad.</li>
	<li>Descargar la base de datos del genoma B. mycoides ATCC 6462 NCBI (adhesión de NCBI n °: CP009692.1) y usarlo como un genoma de referencia para el mapeo de la Lee limpia usando Bowtie2/2.2.3.</li>
	<li>Uso HTSeq v0.6.1 para contar el número de lecturas asignadas para cada gen y la Lee por kilobase de transcripción por millón lecturas asignadas (RPKM) de cada gen depende de la gene y Lee cuenta asignada a este gen.</li>
	<li>Para el análisis de los datos de la tubería del T-REx, utilice la tabla RPKM entrada, así como tres archivos descriptivos: (i) un archivo de factores para describir el experimento en factores, (ii) un archivo de contrastes para definir los factores que se compararán para expresión génica diferencial y (iii) un archivo de clase para describir a grupos de genes de interés. Nota: Los archivos descriptivos están en formato in.txt. Pueden encontrarse ejemplos en la Página Web de T-REx (http://genome2d.molgenrug.nl/). Una instrucción detallada para el análisis de datos con T-REx se puede encontrar en una publicación anterior por de Jong et al. 14.</li>
</ol>

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</ol>

Los autores declaran que no tienen intereses financieros que compiten.

Han planteado la hipótesis de interacciones planta-microorganismo para ser determinado por un equilibrio finamente sintonizado entre bacterias y plantas. Estas interacciones son muy complejas y difíciles de estudiar en un sistema natural, que comprende diversas especies microbianas, potencialmente actuar como consorcios. Este papel describe un protocolo simplificado para estudiar la respuesta bacteriana a los exudados de la raíz en condiciones bien controladas. El perfil del transcriptoma de rizobacterias, sobre exposici...

Las plantas pueden exudado hasta un 20% del carbono fijado durante la fotosíntesis a través de las raíces en la rizosfera1, es decir, la zona estrecha de tierra cerca de las raíces. Debido a la mayor disponibilidad de nutrientes, la rizosfera es un habitat conveniente para diversos microorganismos, incluyendo bacterias promotoras de crecimiento vegetal. Los exudados de la raíz contienen una gama de compuestos inorgánicos como agua, iones, ácidos inorgánicos y oxígeno. Sin embargo, la mayoría de los exudados de la raíz está formada por materiales orgánicos, que pueden dividirse en compuestos de bajo peso molecular y alto peso molecular compuestos. Los compuestos de bajo peso molecular son aminoácidos, ácidos orgánicos, azúcares, compuestos fenólicos, ácidos grasos y una gran variedad de metabolitos secundarios. Los compuestos de alto peso molecular consisten en mucílagos y proteínas2,3. Microorganismos de la rizosfera pueden utilizar algunos de estos compuestos como fuente de energía para el crecimiento y desarrollo. Los exudados de la raíz juegan un papel importante en la conformación de la comunidad de rizobacterias puesto que los compuestos producidos por la planta en los exudados pueden influir en el comportamiento de las bacterias de rizósfera asociados que afectan a la expresión de genes específicos.
Comprensión de la respuesta bacteriana a los exudados de la raíz es un paso clave en el desciframiento de los mecanismos de interacción planta-microorganismo. Como la respuesta bacteriana a interacciones planta-microorganismo es el producto de la expresión génica diferencial, puede ser estudiada mediante el análisis de transcriptoma. Usando este método, estudios previos identificaron varios genes importantes implicados en interacciones planta-microorganismo. En Pseudomonas aeruginosa, genes implicados en metabolismo, quimiotaxis y tipo de secreción de II han demostrado responder a remolacha raíz exudados4. Fan et al. 5 estudia el perfil transcriptómico de B. amyloliquefaciens FZB42 en respuesta a los exudados de raíces de maíz. Sus resultados muestran que, de los genes fuertemente inducidos por los exudados de la raíz, varios grupos están involucrados en rutas metabólicas relacionadas con la utilización de nutrientes, quimiotaxis, motilidad y síntesis no ribosomal de péptidos antimicrobianos y Policétidos.
La exactitud de estos estudios se basa en la colección de exudados de la raíz. Aunque varios métodos han descrito la colección de exudados de la raíz para diversos propósitos, se requieren instrumentos sofisticados o no se hacen en condiciones bien controladas6,7,8. Además, inhibir la rizosfera microorganismos pueden influir en composición del exudado de raíz afectando la permeabilidad de la membrana de la célula vegetal y daño de los tejidos de la raíz, particularmente en el caso de consorcios de microorganismos9. Al investigar la respuesta microbiana a los exudados de la raíz, es importante utilizar condiciones bien definidas para evitar la alteración de los compuestos por otros microorganismos10. Además, RNA de alta calidad se requiere para RNA-seq basados en estudios de transcriptoma. Sin embargo, cuando se trata con cepas bacterianas de modelo no, los protocolos estándar o kits comerciales suelen tienen un bajo rendimiento debido a factores desconocidos o propiedades de crecimiento especial.
El protocolo descrito aquí se verificó utilizando B. mycoides, que es una bacteria gram-positiva, formadora de esporas del filo Firmicute. Es ubicuo en la rizosfera de diferentes especies de plantas. Varias propiedades promotoras de crecimiento de planta han sido reportadas para esta especie, incluida la inducción de resistencia sistemática (ISR) en remolacha azucarera11, inhibición del damping-off patógeno Pythium pepino12, así como nitrógeno fijación en la rizósfera de girasol13. Sin embargo, los mecanismos moleculares de la interacción con una planta de host no están bien estudiados.
El objetivo de los experimentos aquí presentados es estudiar la respuesta de transcriptómico del endosphere aislado B. mycoides a exudados de raíces de papa. En Resumen, el protocolo consta de los siguientes pasos: en primer lugar, recoger exudados de raíces de papa bajo condiciones estériles. Luego, extraer RNA de alta calidad de las células bacterianas tratadas con exudados de la raíz. El último paso es el análisis de datos uso de tubería de T-REx en la web14. Este protocolo se utiliza para identificar los genes B. mycoides que muestran un cambio en niveles de expresión al entrar en contacto con exudados de la raíz y así podrían desempeñar un papel importante en las interacciones planta-microorganismo.

<table><tbody><tr><td>hipoclorito de sodio</td><td>Sigma</td><td>&nbsp; CAS: 7681-52-9&nbsp;</td><td>10-15%&nbsp; cloro activo</td></tr><tr><td>Incubadora de caldo</td><td></td><td></td><td></td>Luria-Bertani (LB)</tr><tr><td></td><td>New Brunswick Scientific</td><td>Innova 4000</td><td></td></tr><tr><td>espectrofotómetro</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Genesys 20</td><td></td></tr> perlas de vidrio de <tr><td>nitrógeno</td><td></td><td></td><td></td>líquido</tr><tr><td></td><td>Sigma</td><td>G8893</td><td>0.5 &micro; m</td></tr><tr><td>Tubo de 2,0 ml con tapón</td><td></td><td></td> de rosca <td>Libre de RNasa</td></tr><tr><td>1,5 ml y 2,0 ml Tubo</td><td></td><td></td><td>Eppendorf Libre de RNasa</td></tr><tr><td>Homogeneizador de molino</td><td>de bolas BioSpec</td><td>607</td><td>Mini_beadbeater</td></tr><tr><td>centrífuga</td><td>Eppendorf</td><td>5430</td><td></td></tr><tr><td>Pirocarbonato de dietilo (DEPC)</td><td>sigma</td><td>CAS: 1609-47-8</td><td></td></tr><tr><td>Dodecil Sulfato de Sodio (SDS)</td><td>sigma</td><td>CAS: 151-21-3&nbsp;</td><td>Solución al 10% preparada con agua MQ tratada con DEPC</td></tr><tr><td>Tampón</td><td></td><td></td> TE <td>10 mM Tris-HCl; 1 mM EDTA, pH=8</td></tr><tr><td>fenol</td><td>Alcohol</td> cloroformo-isoamílico de <td>grado</td>Sigma <td></td></tr><tr><td>RNA&nbsp;</td><td></td><td></td><td>Prepare 24:1 de cloroformo:alcohol isoamílico, almacene a temperatura ambiente Kit de</td></tr><tr><td>aislamiento de ARN de alta pureza</td><td>Roche</td><td>11828665001</td><td></td>Solución</tr> de <tr><td>descontaminación de ARNasa</td><td>Invitrogen</td><td>AM9780</td><td>RNase-Zap Instrumento de</td></tr><tr><td>electroforesis automatizado</td><td>Agilent</td><td>2100</td><td>Bioanalyzer</td></tr><tr><td>Espectrofotómetro de microvolumen</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Kit de análisis de calidad de ARN Nanodrop ND-1000</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Kit Agilent</td><td>RNA 6000 Nano&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Inhibidor de ARNasa</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>RiboLock</td><td></td></tr><tr><td>Biblioteca de ARN direccional Kit de preparación</td><td>NEB</td><td>Ultra</td><td>para Illumina</td></tr></tbody></table>

interacción planta-microorganismo: respuesta transcripcional de bacillus mycoides a exudados de raíces de papa

Plant-Microbe Interaction: Transcriptional Response of Bacillus Mycoides to Potato Root Exudates

Bacterias beneficiosas planta juegan un papel importante en promover el crecimiento y prevención de enfermedades en plantas. La aplicación de planta rizobacterias promotoras del crecimiento (PGPR) como agentes biofertilizantes o control biológico se ha convertido en una alternativa eficaz al uso de fertilizantes convencionales y puede aumentar la productividad de los cultivos a bajo costo. Interacciones planta-microorganismo dependen de señales secretadas por la planta anfitrión y una reacción de aquí en adelante por sus bacterias asociadas. Sin embargo, los mecanismos moleculares de bacterias beneficiosas como responden a sus asociados de origen vegetal las señales no se entienden completamente. Valoración de la respuesta de transcriptómicos de bacterias en los exudados de la raíz es un poderoso enfoque para determinar la expresión génica bacteriana y Reglamento condiciones rizosféricos. Tal conocimiento es necesario entender los mecanismos subyacentes involucrados en interacciones planta-microorganismo. Este papel describe un protocolo detallado para estudiar la respuesta de transcriptómicos de B. mycoides EC18, una cepa aislada de la endosphere de la patata, a exudados de raíces de papa. Con la ayuda de la reciente tecnología de secuenciación de alto rendimiento, este protocolo puede realizarse en varias semanas y produce enormes conjuntos de datos. En primer lugar, recogemos los exudados de la raíz en condiciones estériles, después de lo cual se agregan a las culturas B. mycoides . El ARN de estas culturas se aísla método de fenol/cloroformo, combinada con un kit comercial y sujeto a control de calidad por un instrumento de electroforesis automatizada. Después de la secuenciación, análisis de datos se realizaron con la tubería T-REx en la web y se identifica un grupo de genes diferencialmente expresados. Este método es una herramienta útil para facilitar nuevos descubrimientos sobre los genes bacterianos implicados en interacciones planta-microorganismo.

Microorganismos asociados a plantas pueden influir positivamente en crecimiento de las plantas y la salud. Sin embargo, los mecanismos de las interacciones complejas entre las plantas y sus simbiontes microbianos no se entienden completamente. Exudados de la raíz juegan un papel importante en la regulación de la actividad de rizobacterias y comportamiento, y generalmente se postula que la colonización microbiana de raíces inicia con la atracción de los microbios a los exudados de la raíz....

El objetivo del protocolo presentado aquí es estudiar la respuesta de transcriptómicos de endosphere aislado de Bacillus mycoides a exudados de raíces de papa. Este método facilita la identificación de genes bacterianos importantes implicados en interacciones planta-microorganismo y es en principio aplicable a las plantas, con ajustes menores y otros endófitos.

Interacción planta-microorganismo: Respuesta transcripcional de Bacillus Mycoides a exudados de raíces de papa

Beneficial plant-associated bacteria play an important role in promoting growth and preventing disease in plants. The application of plant ...

Este método puede ayudar a responder preguntas clave en los campos de la interacción planta-microbio. Puede, por ejemplo, identificar genes importantes de cepas bacterianas que se aislaron de la endosfera o la rizosfera durante la interacción de las bacterias con la planta. Es un método versátil que también se puede utilizar para estudios sobre otras bacterias con plantas.La principal ventaja de esta técnica es que en un período relativamente corto se puede identificar un gran número de genes de bacterias que son importantes durante las interacciones planta-microbio. Para comenzar este procedimiento, enjuague la superficie de la papa con agua estéril. Bañar la patata en etanol al 70% durante cinco minutos y luego en hipoclorito de sodio al 3% durante otros cinco minutos.Después, enjuágalo de nuevo con agua estéril para eliminar los restos de hipoclorito de sodio. A continuación, prepare los materiales necesarios para germinar y cultivar tubérculos de papa. Esterilice las macetas de plástico, las cestas de injerto, la vermiculita y el agua esterilizándolas en autoclave a 121 grados centígrados durante 20 minutos.Posteriormente, coloque la papa esterilizada en superficie en la canasta de injerto y colóquela en una olla esterilizada en autoclave que contenga vermiculita húmeda. Use una caja grande de fibra de vidrio para cubrir la olla y evitar contaminaciones microbianas. Mantenga la olla en una cámara climática a 24 grados centígrados durante tres semanas y póngala en ciclos de 16 horas de luz y 8 horas de oscuridad.Para recoger los exudados de la raíz de la papa, cuando broten los brotes, transfiera la canasta con la papa entera a un vaso de precipitados esterilizado lleno de 150 mililitros de agua desionizada esterilizada en autoclave con los tubérculos de papa colocados justo encima de la superficie del agua y las raíces sumergidas en el agua. Mantenga la plántula en la cámara climática y use la misma configuración que antes. A partir del segundo día, recoja el agua que contiene los exudados y vuelva a llenar el vaso de precipitados con agua estéril y desionizada.A continuación, almacene cada muestra por separado a cuatro grados centígrados. Para cada muestra, esparcir 100 microlitros en una placa de agar Luria-Bertani para comprobar si hay contaminaciones microbianas. Deseche las muestras contaminadas.Combine las muestras recolectadas de una plántula. A continuación, transfiera los exudados de raíz combinados a tubos de 50 mililitros. Congele los tubos que contienen exudados de raíces a menos 80 grados centígrados.Concéntrelos liofilizándolos a menos 40 grados centígrados hasta un volumen final de 150 mililitros. Para cultivar las bacterias, coloque una cepa de B. mycoides de un caldo de glicerol de menos 80 grados Celsius en una placa de agar LB e incube la placa a 30 grados Celsius durante la noche. A continuación, inocule el medio líquido LB con una sola colonia de la placa y cultive el cultivo en una incubadora agitadora a 200 rpm durante la noche a 30 grados centígrados.Para tratar y tomar muestras de las bacterias, diluya un cultivo de B. mycoides durante la noche con 90 mililitros de medio LB precalentado hasta el OD600 inicial de cero punto cero cinco en un matraz de 300 mililitros. Posteriormente, agregue 10 mililitros de exudados de raíz al cultivo y use un tratamiento de agua desionizada estéril de 10 mililitros como control. Luego incubarlos a 30 grados centígrados durante una hora.Después de una hora, transfiera el cultivo a tubos de centrífuga de 50 mililitros. Recoja las células del cultivo por centrifugación a 9.000 veces G durante dos minutos a cuatro grados centígrados. Luego, deseche el supernatent e inmediatamente congele el pellet en nitrógeno líquido.Luego guárdelo a menos 80 grados centígrados hasta su uso. Para aislar el ARN, descongele los gránulos celulares en hielo y suspenda cada uno de ellos en 400 microlitros de tampón TE. A continuación, transfiera las suspensiones a los dos tubos de rosca de mililitros.Agregue cero coma cinco gramos de perlas de vidrio en el tubo. A continuación, cierre firmemente las tapas y coloque los tubos en un homogeneizador de molino de bolas. Realice una homogeneización de pulsos de 45 segundos tres veces, con un intervalo de un minuto en hielo.Después, centrifugar las muestras durante 10 minutos a 11.000 veces G y transferir la fase superior de cada muestra a un nuevo tubo. Agregue 500 microlitros de cloroformo: alcohol isoamílico a la fase superior y centrifugue la mezcla durante cinco minutos a 11, 000 veces G. Luego transfiera 500 microlitros de la fase superior a un tubo nuevo. Agregue un mililitro del tampón de unión a la lisis y mezcle pipeteando hacia arriba y hacia abajo.A continuación, prepare tubos de microcentrífuga de un punto cinco mililitros con 100 microlitros de tampón de DNasa, 10 microlitros de DNasa I y cinco microlitros de un inhibidor de ARNasa. Agregue la mezcla de solución preparada en el filtro de los tubos del filtro e incube durante 20 a 30 minutos a 15 a 25 grados centígrados. Posteriormente, realice los pasos de lavado de acuerdo con las instrucciones del fabricante y agregue 50 microlitros de un tampón de elusión al tubo.Después de la centrifugación, eluir el ARN. Transfiera unos pocos microlitros de la muestra a un tubo de microcentrífuga de un punto cinco mililitros para realizar un control de calidad. Finalmente, cubra el ARN eludido con una película de parafina plástica y manténgalo a menos 80 grados centígrados.Después de la recolección, los exudados de la raíz se agregaron al cultivo de B. mycoides en una proporción del 10% y se aisló el ARN total bacteriano. A continuación, el ARN se sometió a un control de calidad mediante un instrumento de electroforesis automatizado. Estos gráficos representan el ARN aislado de B. mycoides tratado con los exudados de raíz, y estos gráficos representan el ARN aislado del grupo de control.Todas las muestras obtuvieron un valor de RIN superior a nueve, con dos bandas claras correspondientes a las subunidades de ARN 16S y 23S, lo que demuestra que se obtuvo ARN de alta calidad mediante este protocolo. Después de la preparación de la biblioteca, se obtuvieron lecturas finales de pares con una plataforma de secuenciación de alto rendimiento. Las lecturas brutas de RNA-seq se recortaron de las secuencias adaptadoras y se compararon con la secuencia del genoma de referencia.El análisis de la transcripción se realizó con la tubería T-REx, y aquí se muestra el gráfico de intensidad de relación de todos los genes expresados diferencialmente. Una vez que se ha identificado el gen potencialmente importante, se pueden realizar otros métodos in vivo como la fusión de GFP promotor, la hibridación fluorescente in situ para responder preguntas adicionales como el tiempo en la expresión reservada de ciertos genes durante la interacción con la planta huésped.

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Investigación

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Biología

Fuente: Yi, Y., et al. Interacción Planta-Microbio: Respuesta Transcripcional de Bacillus Mycoides a los exudados de la raíz de la papa. J. Vis. Exp. (2018)Este video demuestra la preparación y el tratamiento de cultivos de Bacillus mycoides para estudiar las interacciones planta-microbio. Describe los pasos desde rayar un cultivo de pasta e incubarlo en medio líquido hasta exponer las bacterias a los exudados de las raíces de las plantas bajo agitación. El proceso culmina con la recolección y...

Tratamiento de bacterias con exudados de raíces vegetales para emular las interacciones in vitro planta-microbio

La agroinfiltración y la agroinfección por PVX son ensayos funcionales de rutina para la expresión ectópica transitoria de genes en plantas. Estos métodos son ensayos eficientes en estrategias efectoómicas (resistencia rápida y descubrimiento de genes de avirulencia) y cruciales para la investigación moderna en fitopatología molecular. Satisfacen la demanda de análisis funcionales robustos de alto rendimiento en las plantas.

Agroinfiltración y PVX Agroinfección en Papa y Nicotiana benthamiana

El sistema de cocultivo hidropónico descrito soporta plantas intactas con mallas de malla metálica y las convierte en cocultivas con bacterias. El tejido de las plantas, las bacterias y las moléculas secretadas pueden ser recogidas separadamente para análisis de aguas abajo, permitiendo simultáneamente que se investiguen las respuestas moleculares tanto de los huéspedes de la planta como de los microbios o microbios que interactúan.

Un Sistema de Cultivo Hidropónico para el Análisis Simultáneo y Sistemático de Interacciones Moleculares de Plantas / Microbios y Señalización

Aquí, presentamos dos protocolos para transformar plantas de patata. La transformación Agrobacterium tumefaciens conduce a una planta transgénica completa mientras que la Agrobacterium rhizogenes produce transgénicas raíces pilosas en una sesión de tipo salvaje que puede ser auto propagado. Entonces detectamos actividad de promotor por tinción de las raíces transformadas de GUS.

Tumefaciens de la agrobacteria y rhizogenes de la agrobacteria-transformación mediada de la patata y la actividad de promotor de un Gene del Suberin por GUS Staining

El método presentado crea tejido vegetal dañado herbívoro natural a través de la aplicación de larvas de Manduca sexta a hojas separadas de papa. El tejido vegetal se analiza para la expresión de seis homólogos del factor de transcripción implicados en las primeras respuestas al herbívoro de insectos.

Ensayos de hojas independientes para simplificar los estudios de expresión génica en papa durante la infestación por masticar insectos Manduca sexta

Presentamos un protocolo detallado para el sistema de silenciamiento de microARN (VbMS) basado en el virus de la papa X (PVX) para caracterizar funcionalmente los microARN endógenos (miRNAs) en la papa. Las moléculas de imitación objetivo (TM) de miRNA de interés se integran en el vector PVX y se expresan transitoriamente en la papa para silenciar la familia objetivo de miRNA o miRNA.

Silenciamiento de microARN a base de X del virus de la papa (VbMS) en la papa.

Este protocolo presenta un resumen detallado de las estrategias para inocular las raíces de las plantas con microbios transmitidos por el suelo. Ejemplificado para los hongos Verticillium longisporum y Verticillium dahliae, se describen tres sistemas diferentes de infección radicular. Se destacan las aplicaciones potenciales y los posibles análisis posteriores, y se discuten las ventajas o desventajas para cada sistema.

Estrategias de inoculación para infectar las raíces de las plantas con microorganismos transmitidos por el suelo

Debido a la opacidad del suelo, las interacciones entre sus microbios constituyentes no se pueden visualizar fácilmente con resolución celular. Aquí, se presentan dos herramientas microfluídicas, que ofrecen nuevas oportunidades para investigar las interacciones fúngico-microbianas. Los dispositivos son versátiles y fáciles de usar, lo que permite un alto control espaciotemporal e imágenes de alta resolución a nivel celular.

Herramientas microfluídicas para sondear las interacciones fúngico-microbianas a nivel celular

Presentamos un protocolo para un sistema experimental semihidropónico basado en vidrio que apoya el crecimiento de una variedad de plantas filogenéticamente distintas con o sin microbios. El sistema es compatible con diferentes medios de cultivo y permite el muestreo no destructivo del exudado de la raíz para el análisis posterior.

Un sistema versátil de frascos de vidrio para el perfilado de exudado de raíces semihidropónico

El protocolo describe la infección de las raíces de Solanum tuberosum con nematodos parásitos de plantas en condiciones de invernadero in vivo y las raíces transgénicas de papa in vitro para el análisis histoquímico de la estructura de la raíz mediante microscopía óptica.

Infección in vivo e in vitro de raíces de papa con nematodos parásitos de plantas para la evaluación de cambios estructurales inducidos

Aprende a analizar la respuesta transcripcional de Bacillus mycoides a exudados de raíz de papa. Este método identifica genes bacterianos clave en interacciones planta-microorganismo aplicable a diversos endófitos.

Interacción planta-microorganismo: Respuesta transcripcional de Bacillus Mycoides a exudados de raíces de papa

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