Name: Lentivirales mediación producción de ratones transgénicos: un método Simple y altamente eficiente para el estudio directo de los fundadores (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-10-07T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 21 s
Description: Aprende a producir ratones transgénicos mediante inyección de vectores lentivirales en el espacio perivitelino de ovocitos fertilizados. Este método simple logra más del 70% de integración exitosa en recién nacidos.

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Agradecemos a Magali Dumont y Rolando Meloni para lectura crítica del manuscrito y iVector y Phenoparc ICM corazones para asistencia técnica en la producción de vectores lentivirales y animal vivienda respectivamente. Este trabajo fue financiado por el Instituto Hospitalo-Universitaire de Neurociencias Translationnelles de París, IHU-A-ICM, Avenir Investissements ANR-10-IAIHU-06. P.R. recibidas fondos para la Asociación de Langue Française pour l ' Etude du diabetes et des Maladies Métaboliques (ALFEDIAM) y un conjunto JDRF / INSERM conceder.

<ol><li>Gordon, J. W., Scangos, G. A., Plotkin, D. J., Barbosa, J. A., Ruddle, F. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+transformation+of+mouse+embryos+by+microinjection+of+purified+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Science+USA%22%5BJournal%5D)">Genetic transformation of mouse embryos by microinjection of purified DNA.</a> Proceedings of the National Academy of Science USA. 77 (12), 7380-7384 (1980).</li>
<li>Bock, T. A., Orlic, D., Dunbar, C. E., Broxmeyer, H. E., Bodine, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+engraftment+of+human+hematopoietic+cells+in+severe+combined+immunodeficient+%28SCID%29+mice+carrying+human+cytokine+transgenes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Medicine%22%5BJournal%5D)">Improved engraftment of human hematopoietic cells in severe combined immunodeficient (SCID) mice carrying human cytokine transgenes.</a> Journal of Experimental Medicine. 182 (6), 2037-2043 (1995).</li>
<li>Miyakawa, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishment+of+human+granulocyte-macrophage+colony+stimulating+factor+producing+transgenic+SCID+mice%5BTitle%5D)+AND+%22British+Journal+of+Haematology%22%5BJournal%5D)">Establishment of human granulocyte-macrophage colony stimulating factor producing transgenic SCID mice.</a> British Journal of Haematology. 95 (3), 437-442 (1996).</li>
<li>Hirabayashi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+comparative+study+on+the+integration+of+exogenous+DNA+into+mouse%2C+rat%2C+rabbit%2C+and+pig+genomes%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Animals%22%5BJournal%5D)">A comparative study on the integration of exogenous DNA into mouse, rat, rabbit, and pig genomes.</a> Experimental Animals. 50 (2), 125-131 (2001).</li>
<li>Isola, L. M., Gordon, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transgenic+animals%3A+a+new+era+in+developmental+biology+and+medicine%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Transgenic animals: a new era in developmental biology and medicine.</a> Biotechnology. 16, 3-20 (1991).</li>
<li>Zufferey, R., Nagy, D., Mandel, R. J., Naldini, L., Trono, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiply+attenuated+lentiviral+vector+achieves+efficient+gene+delivery+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Multiply attenuated lentiviral vector achieves efficient gene delivery in vivo.</a> Nature Biotechnology. 15 (9), 871-875 (1997).</li>
<li>Lois, C., Hong, E. J., Pease, S., Brown, E. J., Baltimore, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Germline+transmission+and+tissue-specific+expression+of+transgenes+delivered+by+lentiviral+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Germline transmission and tissue-specific expression of transgenes delivered by lentiviral vectors.</a> Science. 295 (5556), 868-872 (2002).</li>
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<li>Ritchie, W. A., Neil, C., King, T., Whitelaw, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transgenic+embryos+and+mice+produced+from+low+titre+lentiviral+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Transgenic+Research%22%5BJournal%5D)">Transgenic embryos and mice produced from low titre lentiviral vectors.</a> Transgenic Research. 16 (5), 661-664 (2007).</li>
<li>Park, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lentiviral+vectors%3A+are+they+the+future+of+animal+transgenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Physiological+Genomics%22%5BJournal%5D)">Lentiviral vectors: are they the future of animal transgenesis.</a> Physiological Genomics. 31 (2), 159-173 (2007).</li>
<li>van Arensbergen, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+distal+intergenic+region+controls+pancreatic+endocrine+differentiation+by+acting+as+a+transcriptional+enhancer+and+as+a+polycomb+response+element%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">A distal intergenic region controls pancreatic endocrine differentiation by acting as a transcriptional enhancer and as a polycomb response element.</a> PLoS One. 12 (2), e0171508(2017).</li>
<li>Friedli, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+systematic+enhancer+screen+using+lentivector+transgenesis+identifies+conserved+and+non-conserved+functional+elements+at+the+Olig1+and+Olig2+locus%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">A systematic enhancer screen using lentivector transgenesis identifies conserved and non-conserved functional elements at the Olig1 and Olig2 locus.</a> PLoS One. 5 (12), e15741(2010).</li>
<li>Sauvain, M. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genotypic+features+of+lentivirus+transgenic+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Genotypic features of lentivirus transgenic mice.</a> Journal of Virology. 82 (14), 7111-7119 (2008).</li>
<li>Punzon, I., Criado, L. M., Serrano, A., Serrano, F., Bernad, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+efficient+lentiviral-mediated+human+cytokine+transgenesis+on+the+NOD%2Fscid+background%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Highly efficient lentiviral-mediated human cytokine transgenesis on the NOD/scid background.</a> Blood. 103 (2), 580-582 (2004).</li>
<li>Zennou, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+HIV-1+DNA+flap+stimulates+HIV+vector-mediated+cell+transduction+in+the+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">The HIV-1 DNA flap stimulates HIV vector-mediated cell transduction in the brain.</a> Nature Biotechnology. 19 (5), 446-450 (2001).</li>
<li>Miyoshi, H., Blomer, U., Takahashi, M., Gage, F. H., Verma, I. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+self-inactivating+lentivirus+vector%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Development of a self-inactivating lentivirus vector.</a> Journal of Virology. 72 (10), 8150-8157 (1998).</li>
<li>Yee, J. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+general+method+for+the+generation+of+high-titer%2C+pantropic+retroviral+vectors%3A+highly+efficient+infection+of+primary+hepatocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Science+USA%22%5BJournal%5D)">A general method for the generation of high-titer, pantropic retroviral vectors: highly efficient infection of primary hepatocytes.</a> Proceedings of the National Academy of Science USA. 91 (20), 9564-9568 (1994).</li>
<li>Castaing, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+restricted+gene+expression+in+beta+cells+by+lentivirus-mediated+gene+transfer+into+pancreatic+stem%2Fprogenitor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetologia%22%5BJournal%5D)">Efficient restricted gene expression in beta cells by lentivirus-mediated gene transfer into pancreatic stem/progenitor cells.</a> Diabetologia. 48 (4), 709-719 (2005).</li>
<li>Gradwohl, G., Dierich, A., LeMeur, M., Guillemot, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((neurogenin3+is+required+for+the+development+of+the+four+endocrine+cell+lineages+of+the+pancreas%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Science+USA%22%5BJournal%5D)">neurogenin3 is required for the development of the four endocrine cell lineages of the pancreas.</a> Proceedings of the National Academy of Science USA. 97 (4), 1607-1611 (2000).</li>
<li>Scharfmann, R., Axelrod, J. H., Verma, I. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+in+vivo+expression+of+retrovirus-mediated+gene+transfer+in+mouse+fibroblast+implants%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Science+USA%22%5BJournal%5D)">Long-term in vivo expression of retrovirus-mediated gene transfer in mouse fibroblast implants.</a> Proceedings of the National Academy of Science USA. 88 (11), 4626-4630 (1991).</li>
<li>Norrman, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+comparison+of+constitutive+promoters+in+human+ES+cells%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Quantitative comparison of constitutive promoters in human ES cells.</a> PLoS One. 5 (8), e12413(2010).</li>
<li>Vandegraaff, N., Kumar, R., Burrell, C. J., Li, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kinetics+of+human+immunodeficiency+virus+type+1+%28HIV%29+DNA+integration+in+acutely+infected+cells+as+determined+using+a+novel+assay+for+detection+of+integrated+HIV+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Kinetics of human immunodeficiency virus type 1 (HIV) DNA integration in acutely infected cells as determined using a novel assay for detection of integrated HIV DNA.</a> Journal of Virology. 75 (22), 11253-11260 (2001).</li>
<li>Ohtsuka, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((One-step+generation+of+multiple+transgenic+mouse+lines+using+an+improved+Pronuclear+Injection-based+Targeted+Transgenesis+%28i-PITT%29%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Genomics%22%5BJournal%5D)">One-step generation of multiple transgenic mouse lines using an improved Pronuclear Injection-based Targeted Transgenesis (i-PITT).</a> BMC Genomics. 16, 274(2015).</li>
<li>Tasic, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Site-specific+integrase-mediated+transgenesis+in+mice+via+pronuclear+injection%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Science+USA%22%5BJournal%5D)">Site-specific integrase-mediated transgenesis in mice via pronuclear injection.</a> Proceedings of the National Academy of Science USA. 108 (19), 7902-7907 (2011).</li>
<li>Sumiyama, K., Kawakami, K., Yagita, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+and+highly+efficient+transgenesis+method+in+mice+with+the+Tol2+transposon+system+and+cytoplasmic+microinjection%5BTitle%5D)+AND+%22Genomics%22%5BJournal%5D)">A simple and highly efficient transgenesis method in mice with the Tol2 transposon system and cytoplasmic microinjection.</a> Genomics. 95 (5), 306-311 (2010).</li>
<li>Garrels, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytoplasmic+injection+of+murine+zygotes+with+Sleeping+Beauty+transposon+plasmids+and+minicircles+results+in+the+efficient+generation+of+germline+transgenic+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnology+Journal%22%5BJournal%5D)">Cytoplasmic injection of murine zygotes with Sleeping Beauty transposon plasmids and minicircles results in the efficient generation of germline transgenic mice.</a> Biotechnology Journal. 11 (1), 178-184 (2016).</li>
<li>Ding, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+transposition+of+the+piggyBac+%28PB%29+transposon+in+mammalian+cells+and+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Efficient transposition of the piggyBac (PB) transposon in mammalian cells and mice.</a> Cell. 122 (3), 473-483 (2005).</li>
<li>Aida, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cloning-free+CRISPR%2FCas+system+facilitates+functional+cassette+knock-in+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biology%22%5BJournal%5D)">Cloning-free CRISPR/Cas system facilitates functional cassette knock-in in mice.</a> Genome Biology. 16, (2015).</li>
<li>Philippe, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lentiviral+vectors+with+a+defective+integrase+allow+efficient+and+sustained+transgene+expression+in+vitro+and+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Science+USA%22%5BJournal%5D)">Lentiviral vectors with a defective integrase allow efficient and sustained transgene expression in vitro and in vivo.</a> Proceedings of the National Academy of Science USA. 103 (47), 17684-17689 (2006).</li>
</ol>

Los autores no tienen ningún conflicto de interés que revelar.

La inyección perivitelino de vectores lentivirales en ovocitos fertilizados descritos aquí dio lugar a la producción de embriones transgénicos que rindió más del 70% de los embriones transgénicos en relación con el número total de embriones colectados. Este resultado es consistente con informes anteriores y ejemplifica la especificidad del procedimiento2,7,10,11,12<...

El trabajo pionero de Gordon et al. en 1980 demostró que después de la implantación en ratones seudopreñadas, la inyección de DNA de plásmido en la masculina pronúcleos de ovocitos fertilizados puede rendir la producción de animales transgénicos que integran el plásmido de ADN1. La demostración que mamíferos transgénicos pueden ser generados tuvo un enorme impacto en Ciencias de la vida mundiales, abriendo el camino a nuevos campos de investigación tanto en ciencias básicas y ciencias biomédicas traslacionales. En las últimas cuatro décadas, microinyección de ADN se ha convertido en una práctica habitual. Aunque se han producido un número enorme de ratones transgénicos, el método estándar no es plenamente utilizable para todas las cepas de ratón y requiere mucho tiempo retrocruzamientos2,3. Su aplicación a otras especies sigue siendo un reto4 y el rendimiento general de integración del transgén se limita a unos porcentaje de animales nacidos5. Además, la eficacia de la integración del transgen representa el factor limitante que explica el pobre rendimiento general de la inyección de ADN pronuclear. En este sentido, integrantes vectores virales son las más eficientes herramientas para carga e integran los transgenes y así podrían proporcionar nuevos medios para incrementar significativamente el rendimiento de la integración, la única limitación es que el tamaño del transgén que no puede superar los 10 kb6 .
Vectores lentivirales pseudo-mecanografiados con la proteína de la envoltura de los Virus de la Estomatitis Vesicular (VSV) son herramientas de transferencia de gen pantropic y altamente integrador y pueden utilizarse para transducir ovocitos fertilizados7. La zona pelúcida que rodea los ovocitos es una barrera natural virus y necesita ser pasado para permitir la transducción de los vectores lentivirales. Animales transgénicos han sido generados por transductoras ovocitos fertilizados después de micro perforación o extracción de la zona pelúcida8,9. Sin embargo, la inyección debajo de la zona pelúcida en el espacio perivitelino parece ser el método más simple para transducir los huevos fecundados como descrito inicialmente por Lois y colegas7.
La inyección de perivitelino de vectores lentivirales permite altos rendimientos en la producción de animales transgénicos que están sobre el 70% de los animales nacidos. Tal producción es más de 10 veces superior a la mejor producción que puede lograrse utilizando estándar pronúcleos ADN inyección7,10,11. En este contexto, una sola sesión de inyecciones generará a por lo menos 50 fundadores transgénicos (F0). Por lo tanto, el gran número de fundadores es compatible con fenotipo del transgen efecto directamente realizado sobre ratones F0 sin la necesidad de generar líneas de ratón transgénico. Esta ventaja permite la rápida detección de los efectos del transgen y está adaptada para realizar en vivo la ganancia y la pérdida de estudios de la función dentro de las semanas. Además, elementos reguladores del ADN pueden también rápidamente proyectará para asignar potenciadores y motivos de ADN por transcripción factores11,12. Con inyección pronuclear, los transgenes generalmente integrar copias múltiples en un único locus. Con vectores lentivirales, integración ocurre en loci múltiples como una sola copia por locus10,13. Por lo tanto, la multiplicidad de loci integrados es probablemente asociado a la penetrancia muy alta expresión observada en los transgénicos fundadores, que hace el nuevo modelo generando más robusto.
Lo importante, al utilizar inyección pronuclear de DNA, visualización de los pronúcleos durante el procedimiento es absolutamente necesario. Esta limitación técnica evita el uso de ovocitos fertilizados procedentes de una gran variedad de cepas de ratón. Por lo tanto, la producción de un modelo transgénico en un específico de la cepa para que pronúcleos son invisibles requiere la producción de animales en una cepa permisiva seguido por al menos 10 sucesivas retrocruzas para transferir el transgen en el ratón deseado cepa. Con las inyecciones de vectores lentivirales, espacio perivitelino siempre está visible y la inyección no requiere de habilidades muy específicas. Por ejemplo, se han obtenido ratones transgénicos NOD/SCID que no son apropiados para la inyección de pronúcleos con los vectores virales inyecciones14.
Aquí, se presenta un protocolo integral para permitir la simple producción de ratones transgénicos usando inyecciones lentivirales vector en el espacio perivitelino de un embrión de la etapa de una célula. Expresión del transgén controlada ya sea con ubicua o promotores específicos de la célula se describe en detalle.
El backbone lentivirales pTrip ΔU3 fue utilizado en este estudio15. Este vector permite la producción de vectores lentivirales defectuoso de replicación en la que la secuencia de U3 se ha eliminado parcialmente para eliminar la actividad de promotor de U3 y generar una uno mismo-inactivador de vector (pecado)16. Las poblaciones de vectores lentivirales fueron producidas por transitorios de la transfección de células HEK-293T con el p8.91 encapsulación plásmido (ΔVpr ΔVif ΔVpu ΔNef)6, pHCMV-G codificación de la estomatitis vesicular (VSV) virus de la glicoproteína G17y el ΔU3 pTRIP vector recombinante. El procedimiento de producción detallada se proporciona como métodos suplementarios.
Producción de las poblaciones de vectores lentivirales de alto título se realiza en condiciones de nivel II de bioseguridad (BSL-2). Esto es cierto para la mayoría de los transgenes excepto oncogenes que tienen que ser producido en el BSL-3. Por lo tanto, la producción en condiciones BSL-2 para la mayoría de los casos es suficiente. Además, el uso y la producción generalmente se desconectan para la mayoría las agencias reguladoras nacionales con organismos modificados genéticamente (OMG). Cantidades limitadas de vectores lentivirales incompetentes de pecado la replicación (por debajo de 2 μg de la proteína de cápside p24) pueden utilizarse en condiciones BSL-1 según lo descrito por la agencia francesa OGM de acuerdo con las recomendaciones de la Unión Europea.

<table><tbody><tr><td>PMSG 50UI</td><td>Sigma</td><td>G4527</td><td></td></tr><tr><td>hCG 5000UI</td><td>Sigma</td><td>CG5-1VL</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma</td><td>7982</td><td></td></tr><tr><td>100 mm placa de Petri</td><td>Dutsher</td><td>353003</td><td></td></tr><tr><td>4 pocillos Plato Nunc</td><td>Dutsher</td><td>56469</td><td>Plato de FIV</td></tr><tr><td>M2 medio</td><td>Sigma</td><td>M7167</td><td></td></tr><tr><td>M16 medio</td><td>Sigma</td><td>M7292</td><td></td></tr><tr><td>0,22 y micro; m Filtro de jeringa</td><td>Dutsher</td><td>146611</td><td></td></tr><tr><td>Enzima hialuronidasa 30mg</td><td>Sigma</td><td>H4272</td><td>embrión de ratón probado</td></tr><tr><td>Serynge de insulina</td><td>VWR</td><td>613-3867</td><td>Terumo Myjector</td></tr><tr><td>Pinzas curvas</td><td>Moria</td><td>2183</td><td></td></tr><tr><td>Tijeras curvas</td><td>Moria</td><td>MC26</td><td></td></tr><tr><td>Conjuntos de tubos de aspiración para pipetas microcapilares calibradas</td><td>Sigma</td><td>A5177-5EA</td><td></td></tr><tr><td>Capilares de vidrio de borosilicato Aparato</td><td>Harvard</td><td>GC 100-10</td><td></td></tr><tr><td>Extractor de micropipetas horizontal</td><td>Narishige</td><td>PN-30</td><td></td></tr><tr><td>Microforge</td><td>Narishige</td><td>MF-900</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio invertido</td><td>Nikon</td><td>Transferman NK2 5188</td><td>Hoffman modulación iluminación de contraste</td></tr><tr><td>Micromanipulador</td><td>Eppendorf</td><td>Celltram aire</td><td></td></tr><tr><td>Controlador de pipeta de retención</td><td>Eppendorf</td><td>Femtojet</td><td></td></tr><tr><td>Aceite mineral</td><td>Sigma</td><td>M8410</td><td>embrión de ratón probado</td></tr><tr><td>Microinyector</td><td>Eppendorf</td><td>Femtojet</td><td>Se puede utilizar para inyectar ADN o vectores virales</td></tr><tr><td>Pinza Dumont # 5</td><td>Moria</td><td>MC 40</td><td></td></tr><tr><td>vannas micro tijeras</td><td>Moria</td><td>9600</td><td></td></tr><tr><td>Isoflurano</td><td>centravet</td><td>ISO005</td><td>ISO-VET 100% 250ml</td></tr><tr><td>ocrygel</td><td>centravet</td><td>OCR002</td><td></td></tr><tr><td>Povidone iodure</td><td>centravet</td><td>VET001</td><td>vetedine 120ml</td></tr><tr><td>Buprenorfina</td><td>centravet</td><td>BUP002</td><td>Buprecare 0,3Mg/ml 10ml</td></tr><tr><td>Tris-HCl</td><td>Sigma</td><td>T5941</td><td>Clorhidrato de Trizma</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma</td><td>E9884</td><td></td></tr><tr><td>SDS</td><td>Sigma</td><td>436143</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma</td><td>S7653</td><td>proteinasa en polvo</td></tr><tr><td>K</td><td>Sigma</td><td>P2308&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>oneTaq kit</td><td>NEB</td><td>M0480L</td><td></td></tr><tr><td>Primers</td><td>Eurogentec</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tira de 8 tubo de PCR</td><td>4titude</td><td>4ti-0781</td><td></td></tr><tr><td>termociclador de 96 pocillos</td><td>Applied Biosystems</td><td>4375786</td><td>Veriti Genomic</td></tr><tr><td>DNA mini kit</td><td>invitrogen</td><td>K1820-02</td><td></td></tr><tr><td>Nanodrop 2000</td><td>Thermo Scientific</td><td>ND-2000C&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>qPCR Master mix</td><td>Roche</td><td>4887352001</td><td>SYBR Green&nbsp;</td></tr><tr><td>Placa multipocillo 384</td><td>Roche</td><td>5217555001</td><td></td></tr><tr><td>instrumento qPCR 384 pocillo</td><td>Roche</td><td>5015243001</td><td>LightCycler 480</td></tr></tbody></table>

lentivirales mediación producción de ratones transgénicos: un método simple y altamente eficiente para el estudio directo de los fundadores

Lentiviral Mediated Production of Transgenic Mice: A Simple and Highly Efficient Method for Direct Study of Founders

Durante casi 40 años, inyección pronuclear de ADN representa el método estándar para generar ratones transgénicos con la integración aleatoria de transgenes. Un procedimiento de rutina se utiliza extensamente en todo el mundo y su principal limitación reside en la pobre eficacia de la integración del transgén, resultando en un bajo rendimiento de los animales del fundador. Sólo pequeño porcentaje de animales nacidos después de la implantación de óvulos fertilizados inyectados ha integrado el transgén. Por el contrario, vectores lentivirales son poderosas herramientas para la transferencia de genes integradora y su uso para transducir ovocitos fertilizados permite producción altamente eficiente del fundador de ratones transgénicos con un rendimiento promedio superior al 70%. Además, cualquier cepa de ratón se puede utilizar para producir animales transgénicos y la penetrancia de la expresión del transgén es extremadamente alto, por encima del 80% con transgénesis mediada lentivirales comparado con microinyección de DNA. El tamaño del fragmento de ADN que puede ser carga por el vector lentivirales se limita a 10 kb y representa la principal limitación de este método. Usando un simple y fácil de realizar el procedimiento de inyección debajo de la zona pelúcida de ovocitos fertilizados, pueden producir más de 50 animales del fundador en una sola sesión de microinyección. Dicho método está altamente adaptado para llevar a cabo, directamente en los animales de fundador, rápida ganancia y pérdida de estudios de la función o a regiones de ADN genómicas de pantalla por su capacidad para controlar y regular la expresión génica en vivo.

Animales transgénicos fueron generados usando el protocolo presentado aquí. Representante resultados tanto ubicua y expresión de transgenes específicos tipo de célula se ilustran.
Expresión constitutiva de transgenes
Promotores ubicuos son herramientas de investigación básica para expresar transgenes en forma sostenida y eficaz. Estos promotores se uti...

Aquí, presentamos un protocolo para promover la integración del transgén y la producción de ratones transgénicos fundador con alta eficacia por una simple inyección de lentivirales vector en el espacio perivitelino de un ovocito fertilizado.

Lentivirales mediación producción de ratones transgénicos: un método Simple y altamente eficiente para el estudio directo de los fundadores

For almost 40 years, pronuclear DNA injection represents the standard method to generate transgenic mice with random integration of transgenes. Such a ...

Este método permite un cribado in vivo rápido en ratones, del efecto de un transgén, y está específicamente adaptado para realizar estudios de ganancia o pérdida de funciones, así como una respuesta y mapeo de motivos de ADN. La principal ventaja de esta técnica, es que el uso de la predicción de animales transgénicos están por encima del 70% de los recién nacidos y se pueden aplicar a cualquier cepa de ratón, incluidos los animales transgénicos. Después de eutanasiar a los ratones, recoge los oviductos.Para comenzar la cirugía, use tijeras para hacer una incisión horizontal grande en la cavidad abdominal. Luego, localice el oviducto entre el útero y el ovario. A continuación, utilice fórceps curvos para eliminar el mesometrio y la membrana con los vasos sanguíneos prominentes.Luego, separa el oviducto del ovario y disecciona el oviducto del ovario. Luego, tira del oviducto y corta del útero. Transfiera todos los oviductos recogidos a M2 medio a temperatura ambiente.Al manipular los oviductos, tenga cuidado de evitar tocar la ampolla hinchada cargada con huevos fertilizados. A continuación, agregue una gota de 100 microlitros de solución de trabajo de hialuronidasa a un plato de 10 centímetros. Luego transfiera los dos oviductos en él, para eliminar las células cúmulos de los huevos.Bajo un estereomicroscopio, utilice un par de jeringas de insulina para asegurar el oviducto mientras rompe la ampolla y dispersa los óvulos fertilizados. A continuación, utilice una pipeta de vidrio preparada con tubo y una boquilla para aspirar todos los huevos. Con esta herramienta, transfiéralas entre seis gotas de medio M2 para lavar las células cúmulos circundantes.A continuación, transfiera los huevos lavados a un pozo de 10 milímetros, en una placa de cuatro pozos, lleno de precalentado con M16. Luego, transfiera el plato a una incubadora humidificada de 37 grados Celsius. En preparación, centrifugar la suspensión vectorial lentiviral preparada a 160 g durante dos minutos, para peletizar los residuos a menudo presentes en el stock lentiviral.En un armario de seguridad de clase dos, transfiera los sobrenadantes a un nuevo tubo de 0,5 mililitros. A continuación, cargue un microlitro de sobrenadante en una pipeta de inyección. A continuación, coloque la pipeta de inyección en el micromanipulater del lado derecho.Y fije la pipeta de sujeción al micromanipulador del lado izquierdo. Ahora, dispensar ocho microlitros de M2 medio en el centro del tobogán de depresión. Y cubra con aceite de parafina ligero para evitar la evaporación.Luego, coloca 20 huevos en lugares poco profundos en la gota sin crear burbujas. A continuación, asegúrese de que la punta de la pipeta de inyección esté abierta. Si no es así, toque la pipeta de inyección con la pipeta de sujeción para abrirla.A continuación, ajuste el microinyector para inyecciones de 20 segundos. Ahora, usando la pipeta de retención y la presión manual aspirar un óvulo fertilizado que contiene dos pronúcleos y dos cuerpos polares. A continuación, utilizando la pipeta de inyección, inyecte el espacio de perivitellina del óvulo.No toque la membrana plasmática. Ajuste la presión para que el espacio de la perivitellina esté lleno de solución. La presión no debe exceder los 600 hecto pascales.Inmediatamente después de inyectar los 20 huevos, transfiera el lote a un baño de medio M16 precalentado. Y incubarlos durante al menos 30 minutos antes de implantarlos. 16 horas después de aparear hembras normales a machos con vasectomías, compruebe si hay tapones de cópula.Utilice estas hembras para la implantación. A continuación, hacer pipetas de implantación con diámetro interno de unos 150 micras. Y con puntas pulidas por llama de entre cuatro y cinco milímetros de largo.Cargue una pipeta con aceite de parafina ligero probado en embrión justo por encima del punto del hombro. A continuación, aspirar una pequeña burbuja de aire y cargar aún más la pipeta con el medio M2. A continuación, aspirar una segunda burbuja de aire.Ahora, dibuje los embriones en la pipeta uno detrás del otro, minimizando el volumen de medio entre los embriones. Terminar, aspirando una gota muy pequeña de aceite de parafina de un solo embrión ancho. La preparación de la pipeta de reimplantación es clave y necesita mucha práctica.Los huevos de la pipeta deben estar alineados prácticamente sin un medio entre ellos. A continuación, después de anestesiar el ratón y confirmar la anestesia con un pellizco de los pies Afeitar dos tiras de pelo de dos centímetros a lo largo de la médula espinal a nivel de la última costilla. Ahora, coloque el ratón en una almohadilla de calefacción en un campo estéril y colóquelo, dejando una ventana a la piel expuesta.A continuación, desinfecte la piel expuesta con exfoliantes alternos de yodoprovirona y 70 por ciento de etanol. Para la implantación, primero haga una incisión transversal de un centímetro, y luego deslice la piel lateralmente hasta que el ovario de color naranja sea visible a través de la pared del cuerpo. A continuación, haga una incisión de cinco milímetros con las tijeras finas y recoja la almohadilla de grasa con una abrazadera de bulldog atraumático.Una vez que la almohadilla está agarrada, tire del ovario, el oviducto y la parte superior del útero. A continuación, localice la ampolla y haga una hemisectación con tijera vannas, en el segmento de oviducto que une el ovario con la ampolla. A continuación, introduzca la pipeta de embriones de transferencia y expulse los óvulos.Detenerse en la primera burbuja de aire después de que los huevos han sido liberados. Tenga los materiales necesarios preparados para repetir el procedimiento en el segundo oviducto. Y una vez completada, cierra la piel con los clips de la herida.Inmediatamente después de cerrar la piel, inyecte intraperitoneamente analgésico y coloque el animal en la cámara de recuperación con un elemento calefactor de 39 grados Celsius. Monitor hasta que esté completamente despierto. El animal transgénico se generó utilizando el método presentado.Se produjeron vectores lentivirales de alto título utilizando un potenciador de base de 2,3 kilos para Neurogenin-3 para impulsar eGFP. O como control, un fragmento del cromosoma seis para conducir eGFP. La integración en embriones fue bastante exitosa.A partir de los embriones, el brote pancreático se seccionó e inmunosuculó para buscar la expresión localizada de eGFP. Más del 90 por ciento de los vectores, con el potenciador Neurogenin-3, expresaron eGFP en neurog3 expresando células. Sin embargo, ninguno de los vectores de control integrados expresó eGFP en el brote pancreático.Los sitios de integración de Transgene fueron evaluados por PCR cuantitativo, utilizando el gen CDX2 como control. El número medio de sitios de integración fue de aproximadamente 20 utilizando la construcción Neurogenin-3, o 10 utilizando la construcción de control. Curiosamente, el título de transducción viral utilizado para la construcción Neurogenin-3, era aproximadamente el doble del vector de control.Sugerir una relación entre el título de transducción y el número de integraciones. Después de ver este video, usted debe tener una buena comprensión de cómo generar un gran número de embriones transgénicos fundadores utilizando la inyección de perivitellina de vectores lentivirales con alta eficacia. Una vez dominada, esta técnica puede producir hasta 50 animales fundadores en un solo día de microinyección, si se realiza correctamente.Después de este procedimiento, se pueden realizar otros métodos como la inyección de ADN pronuclear del título, con el fin de establecer líneas transgénicas de ratón. No olvide que trabajar con vectores lentivirales está sujeto a la autorización de su comité local de OMG. Estos vectores pueden ser extremadamente peligrosos y siempre se deben tomar precauciones al realizar este procedimiento.

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Investigación

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