Ultra bajo entrada genoma secuencia biblioteca elaboración de un solo espécimen Tardigrade

Contaminación durante la secuenciación de organismos microscópicos sigue siendo un gran problema. A continuación, os mostramos un método para secuenciar el genoma de un tardígrado de una sola muestra con tan poco como 50 pg de ADN genómico sin amplificación del genoma entero para minimizar el riesgo de contaminación.

El objetivo de este protocolo es secuenciar el genoma de un organismo microscópico llamado tardígrados. Hemos establecido un método para secuenciar el genoma de un tardígrado, Hypsibius dujardini, a partir de un solo espécimen con tan solo 50 picogramos de ADN genómico con una aplicación de genoma completo. Después de aislar un solo tardígrado, minimizamos la contaminación bacteriana mediante el uso de antibióticos y la inspección visual.

También hemos utilizado dos métodos de homogeneización. El primero y el más utilizado en C. elegans utilizando ciclos de congelación y descongelación, y en segundo lugar, una trituración manual del tardígrado con una punta de pipeta. A continuación, el ADN se utiliza para construir una biblioteca de secuenciación y luego se secuencia en un instrumento MiSeq.

Un resumen general del protocolo. Después del aislamiento de un solo individuo, se somete a tres ciclos de congelación y descongelación para su homogeneización. El ADN genómico se extrae y purifica y se fragmenta por sonicación.

A continuación, se construye una biblioteca de secuenciación y, tras la validación de la distribución del tamaño de la biblioteca, se secuencia con un instrumento de secuenciación. Prepare gel de agarosa al 2% utilizando agua destilada como disolvente en una placa de cultivo de plástico de 90 milímetros, y 10 milímetros de estreptomicina al 1% con agua destilada. El gel se puede almacenar durante dos o tres semanas en una incubadora a 18 grados.

Recoja un solo tardígrado y colóquelo en la placa de agar preparada, y lávese con agua destilada dos o tres veces para eliminar las partículas restantes. Coloque el tardígrado único en antibióticos de penicilina estreptomicina durante dos a seis horas para eliminar la contaminación bacteriana y coloque el animal descontaminado en un recipiente limpio con una pipeta P10. Observe el tardígrado bajo un microscopio con un aumento de 500 veces y confirme que no quedan bacterias.

Recoja cada uno con una pipeta P10 con un máximo de cinco microlitros de líquido, colóquelo en un tubo de PCR de baja unión y elimine el exceso de líquido tanto como sea posible. Homogeneización y extracción de ADN. Homogeneizar el animal para obtener ADN genómico con uno de los siguientes métodos.

Homogeneización con ciclos de congelación y descongelación. Inmediatamente después del paso 2.5, agregue 100 microlitros de tampón de lisis al tubo de PCR que contiene el tardígrado. Coloque el tubo de PCR en nitrógeno líquido durante 10 minutos y muévalo a un bloque de calor, caliente a 37 grados durante 10 minutos.

Repita este paso tres veces. Trituración manual. Bajo un microscopio estereoscópico, triture al individuo con una punta de pipeta P10 presionando el animal contra la pared del tubo de PCR e inmediatamente agregue 100 microlitros de tampón de lisis.

Incubar durante 30 minutos a temperatura ambiente para que se produzca la lisis. Transfiera el volumen completo de la mezcla de lisis a un microtubo limpio de 1,5 mililitros de baja unión. Agregue 100 microlitros de tampón de lisis al tubo de PCR de baja unión, que se utiliza para la homogeneización y ahora está vacío.

Y después del pipeteo, transfiera la mezcla a 1,5 microtubos de baja fijación. Repita este paso dos veces. Agregue 300 microlitros de tampón de lisis a un tubo de PCR de baja unión y, después del pipeteo, mueva la mezcla a un microtubo de baja unión de 1,5 mililitros.

Agregue el total de 600 microlitros de mezcla de lisis a la columna de centrifugación colocada en el tubo de recolección y centrifugue a 10,000 G durante un minuto. Vuelva a aplicar el flujo a través de la columna y centrifugue a 10.000 G durante un minuto. Este paso es fundamental para garantizar que la mayor parte del ADN genómico se una a la columna.

Agregue 500 microlitros de tampón de lavado a la columna de centrifugación y centrifugue a 10.000 g durante un minuto. Transfiera la columna de centrifugado a un microtubo limpio de 1,5 mililitros. Aplique 20 microlitros de 10 milimolares primero ACL a la columna de centrifugación y espere cinco minutos a temperatura ambiente.

Centrifugar a 10.000 g durante un minuto. El tampón de dilución no debe contener EDTA, ya que interfiere con las enzimas de preparación de laboratorio. Vuelva a aplicar el flujo a través de la columna de centrifugación y, después de cinco minutos de incubación a temperatura ambiente, centrifugue durante un minuto a 10.000 G.

Fragmentación del ADN. Transfiera 15 microlitros de eluido de ADN genómico a un microtubo de 15 microlitros para la fragmentación del ADN y centrifugue durante un minuto con una centrífuga de mesa. Fragmenta el ADN genómico en 550 pares de bases.

Después del pipeteo, transfiera 10 microlitros de mezcla de ADN fragmentado a un tubo de PCR limpio y de baja unión. El experimento se puede detener aquí. Conserva el ADN a cuatro o menos 20 grados.

Construcción de bibliotecas de secuenciación. Es absolutamente crítico utilizar el kit especificado en los siguientes procedimientos, debido a la baja entrada de ADN. Prepare los reactivos necesarios, siguiendo el protocolo del fabricante, y construya la biblioteca de secuenciación sin ninguna modificación.

Después de aplicar la mezcla de amplificación de biblioteca a una mezcla de síntesis de biblioteca, realice la reacción de PCR en un termociclador. La reacción de PCR se llevó a cabo como se muestra. Purificación de la reacción PCR.

Agregue 50 microlitros de perlas magnéticas y pipetee 10 veces, y centrifuga brevemente con una microcentrífuga de mesa. Incubar durante dos minutos a temperatura ambiente. Incubar en un soporte magnético durante cinco minutos, o hasta que la solución se vuelva completamente transparente, y retire el sobrenadante.

Siga el protocolo del fabricante. Transfiera el sobrenadante sin alterar el pellet a un nuevo tubo de PCR de baja fijación. Control de calidad y cuantificación del ADN, y secuenciación.

Validación de la distribución del tamaño de la biblioteca de ADN. Agregue tres microlitros de agua de muestra con un microlitro de biblioteca de secuenciación, y mezcle bien durante un minuto con un vórtice, y centrifugue brevemente con una centrífuga de mesa. Realice electroforesis y valide la distribución del tamaño de la biblioteca con el software asociado.

El pico del fragmento principal debe oscilar entre 300 y 1.000 pares de bases. Cuantificación de ADN. Agregue 796 microlitros del tampón de solución y cuatro microlitros del reactivo de fluorescencia y mezcle bien.

Dispense 190 microlitros de la solución de trabajo a dos tubos de ensayo y 197 microlitros a un tubo de ensayo. Agregue 10 microlitros de patrones con concentraciones conocidas de ADN a cada tubo de ensayo que contenga 190 microlitros de solución de trabajo, y tres microlitros de la biblioteca preparada al tubo de ensayo que contenga 197 microlitros de solución de trabajo. Vórtice brevemente y centrifugar en la centrífuga de mesa.

Cuantifique el ADN utilizando un fluorómetro con tres configuraciones de microlitros. Secuenciación de la biblioteca de ADN. Prepare la biblioteca de secuenciación en función del protocolo del fabricante.

Coloque el casete de reactivo y la celda de flujo en el instrumento de secuenciación e introduzca la información de ejecución de la secuenciación, siguiendo el protocolo del fabricante. Ejecutar secuenciación. Resultados representados.

La exposición a contaminantes en la extracción de ADN de alta calidad sigue siendo el punto crítico de nuestro protocolo. Para examinar visualmente si son contaminantes, hemos incubado el tardígrado en antibióticos, que son penicilina y estreptomicina, y también hemos examinado al individuo bajo un microscopio de 500 veces. Como se muestra aquí, los microbios visibles alrededor de los tardígrados están completamente iluminados.

Después de la homogeneización, extracción de ADN, fragmentación y preparación de bibliotecas eficientes. La distribución de tamaños de la biblioteca se valida mediante una electroforesis de alta sensibilidad para el control de calidad. Las líneas morada y verde indican los marcadores superior e inferior en 1, 500 y 25 pares de bases, respectivamente.

El carril L es un marcador de escalera, el carril S y el N1 al N4 son cinco réplicas del mismo experimento, todas a partir de un solo espécimen de tardígrado. Como se puede ver en el amplio uniforme y la distribución entre 200 y 1.000 pares de bases, nuestro protocolo es altamente reproducible, incluso con la entrada ultrabaja. Este es el resultado de un control de calidad rápido, para lecturas sincronizadas obtenidas de una sola ejecución de secuenciación.

Las lecturas se obtienen como extremos de repuesto de 300 pares de bases, donde las lecturas hacia adelante y hacia atrás se muestran en la parte superior e inferior, respectivamente. La distribución que se muestra aquí es típica de lecturas finales de 300 pares, con llamadas base de muy alta calidad por encima de Q30 para los primeros 200 pares de bases, y disminuyendo gradualmente hasta el final. Por lo tanto, este método utiliza un solo individuo para una muestra.

No hay requisitos de cantidades masivas de animales, como los requeridos en proyectos anteriores de secuenciación del genoma de tardígrados. Los métodos de cultivo para la mayoría de los tardígrados aún no se han establecido. Por lo tanto, permitir la secuenciación genómica de un solo individuo, como los que provienen directamente del trabajo de campo, tendrá un gran impacto en la biología molecular de los tardígrados y, posiblemente, en otros animales pequeños.

Nuestros métodos de secuenciación de ADN permiten analizar otros numerosos organismos microscópicos que aún no se han secuenciado, como especies raras de perejil, nematodos, abetos de agua y otras opciones, conectando la parte de las zonas y un área pública más amplia, lo que fomenta el entorno donde pueden ser posibles varios mecanismos biológicos.