Germinación de esta investigadora mediante el análisis de Microrespiration y microdisección

El objetivo general de los procedimientos presentados aquí es identificar las etapas de la germinación de las esporas para que se puedan evaluar los niveles de transcripción de genes. El análisis de estos cambios proporcionará un mayor conocimiento de una etapa crítica en la dispersión de la enfermedad. Este método puede ayudar a responder preguntas clave sobre las transiciones durante la germinación de teliosporas que están relacionadas con cambios en los niveles de transcripción génica y, por lo tanto, reflejan cambios en el control de la expresión génica.

Las principales ventajas de esta técnica son que identifica transiciones en el nivel de respiración que no corresponden a interruptores morfológicos visibles y permite el aislamiento físico de las teliosporas en distintas etapas de la germinación. Esta técnica tiene implicaciones para el control de la diseminación de patógenos, ya que nos permite identificar transiciones clave en la germinación de esporas que, si se alteran, podrían bloquear la propagación de la enfermedad. Comience este procedimiento con la infección de la mazorca de maíz, la recolección de teliosporas, así como la prueba de viabilidad y germinación de teliosporas, como se describe en el protocolo de texto.

Para inducir la germinación, primero pesa una cantidad igual de teliosporas para cada experimento de respiración. En un gabinete de bioseguridad, agregue las teliosporas a una cámara de respiración esterilizada en autoclave. Llene la cámara con caldo de patata dextrosa, complementado con sulfato de estreptomicina y sulfato de kanamicina.

Pipetea hacia arriba y hacia abajo para crear una suspensión de teliosporas. Coloque la tapa de la cámara en la cámara para crear un sello hermético. Para obtener la medición de OCR, primero coloque la cámara en el estante de la cámara dentro de un baño de agua.

Luego, coloque la sonda de oxígeno dentro de la abertura de la cámara. Supervise los puntos de datos que aparecen en tiempo real en el programa de velocidad de seguimiento del sensor. Deje que la sonda se estabilice durante aproximadamente tres minutos después de colocarla en la cámara.

Haga clic en Medir para medir los niveles de oxígeno de forma continua durante seis horas con mediciones registradas a intervalos de dos segundos. Detenga la medición y repita estos pasos para cada muestra que se va a analizar antes de exportar los datos a Microsoft Excel y realizar el análisis de datos como se describe en el protocolo de texto. Coloque aproximadamente 10 miligramos de teliosporas de umatus en un tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitros.

Suspender las teliosporas en 500 microlitros de PDB suplementado con sulfato de estreptomicina. Pipetear suavemente para mezclar hasta que no queden grumos de teliosporas en el medio. Transfiera la suspensión de teliosporas a un matraz Erlin Meyer de 250 mililitros esterilizado en autoclave, que contenga PDB, suplementado con sulfato de estreptomicina.

Incubar el matraz durante la noche a 28 grados centígrados, agitando a 90 RPM. Prepare una placa de Petri pipeteando de cuatro a cinco gotas de cinco microlitros de agua destilada en la parte superior de la placa de Petri. A continuación, pipetee tres gotas de dos microlitros de solución de estabilización de ARN en la placa de Petri que se utilizará para la recogida de muestras.

También pipetea 30 gotas de cinco microlitros de teliosporas en germinación en la placa de Petri. Añade 15 mililitros de aceite mineral a la placa de Petri. Asegúrese de que todas las gotas estén cubiertas de aceite antes de continuar.

A continuación, prepare un microcapilar con un diámetro intermedio de 15 micras, una brida de un milímetro, una longitud de 55 mililitros y un ángulo de punta de 20 grados. Colócalo en el soporte de microcapilar, y sumérgelo en el aceite mineral, donde la acción capilar permitirá que el aceite mineral entre en el microcapilar. Libere la presión en el microcapilar antes de llevarlo a la gota de agua.

Aspirar para preparar el microcapilar con agua. Usando los controles del micromanipulador, mueva el microcapilar preparado a una de las gotas de germinación y penetre en la gota. Baje el microcapilar y lleve la boca del microcapilar hasta una teliospora en germinación en la etapa de germinación de interés.

Aspirar lentamente para capturar la teliospora en germinación. Deje de aspirar una vez que la teliospora haya entrado en el microcapilar. Repita hasta que haya aproximadamente cinco teliosporas en el microcapilar.

Eleve el microcapilar con el micromanipulador y llévelo a la gota de recolección de la solución de estabilización de ARN. Penetre en la gota e inyecte las teliosporas en la gota. Repita estos pasos hasta que se hayan capturado aproximadamente 1.000 teliosporas.

Para recuperar la gota de recolección, pipetee la gota de recolección y transfiérala a la tapa del tubo de microcentro libre de 2.0 mililitros de ADN de ARN. Limpie cuidadosamente el aceite mineral con la pipeta, sin alterar la gota de recolección. Las teliosporas ahora se pueden usar para aplicaciones posteriores, como el aislamiento de ARN.

Este gráfico ilustra un resultado típico de la evaluación de los cambios en el nivel de oxígeno en suspensiones de teliosporas inducidas a germinar. En relación con las teliosporas no inducidas, la separación que indica el inicio de la respiración se produce aproximadamente a los 30 minutos. Teniendo en cuenta que se tarda unos 15 minutos en configurar y transportar la muestra a la sonda de oxígeno, este tiempo es en realidad de 45 minutos.

Aquí se muestran las cinco etapas de la germinación de las teliosporas. En la primera etapa, las teliosporas son inducidas a germinar, pero no muestran signos morfológicos de germinación. Las teliosporas de la etapa dos muestran un promicelio emergido con una longitud menor que el diámetro de la teliospora.

En la tercera etapa, la longitud del promicelio es mayor que el diámetro de la teliospora. La cuarta etapa se caracteriza por promicelios con basidiosporas adheridas. Y en la etapa cinco, hay basidiosporas en ciernes.

Aquí, se muestran las teliosporas que germinan de forma asincrónica y el microcapilar se coloca cerca de una teliospora de etapa tres. A continuación, la teliospora de la tercera etapa se aspira en el microcapilar y se transfiere a una gota de solución de recolección. Una vez dominada, esta técnica de microdisección se puede utilizar para aislar 1.000 teliosporas específicas de la etapa en seis o siete horas.

Al intentar este procedimiento, es importante recordar tomar descansos frecuentes. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo aislar físicamente las esporas en etapas morfológicamente distintas de la germinación. E identificar el momento del inicio de la respiración.

Por lo general, las personas nuevas en este método tendrán dificultades debido a la necesidad de mantener la esterilidad. Y la necesidad de paciencia y de aislar los tipos celulares mediante microdisección. El desarrollo de esta técnica allana el camino para que los fitopatólogos fúngicos exploren los aspectos morfológicos y moleculares de la germinación en hongos devastadores de carbón y roya que amenazan la seguridad alimentaria mundial.

Aunque esta técnica se aplica a nosotros, los ligomatistas, también podría usarse en muchos otros patógenos devastadores de los cultivos agrícolas que resultan en miles de millones de dólares en pérdidas anuales. Siguiendo este procedimiento, se pueden realizar otros métodos como el aislamiento de ARN para responder preguntas adicionales, como, ¿cuál es el perfil y el momento del cambio en el nivel de transcripción?