Name: Evaluación de inmunoestimulantes agente: Linfoide inyección y extracción de tejido dendrítico de la célula dependiente de la ruta de activación (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-09-16T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 4 s
Description: Aprenda a aislar ganglios linfáticos mediastínicos en ratones tras inyección de nanomaterial inmunoestimulante. Esta técnica permite evaluar la activación de células dendríticas linfoides en estudios inmunológicos.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Esta investigación fue apoyada por el programa de descubrimiento creativo de materiales a través de la nacional investigación Fundación de Corea (NRF) financiado por el Ministerio de ciencia, TIC y planeación de futuro (NRF-2017M3D1A1039421) y por el programa de biotecnología marina, financiado por el Ministerio de océanos y pesca, República de Corea y una subvención (20150220).

Se realizaron todos los procedimientos experimentales incluyendo aislamiento manipulación, sacrificio y órgano animal en estricta conformidad con las normas del Comité de uso en el centro clínico de salud pública de Shanghai y centro médico de Asan e internacional Animal Care. El protocolo de estudio fue aprobado por los respectivos Comités sobre la ética de los experimentos animales en el centro clínico de salud pública de Shanghai (número de protocolo del ratón: SYXK-2010-0098) y el centro médico de Asan (2016-02-168).
1. preparación del Material
Nota: Un nano-adyuvante, INP, conformada por un portador uno mismo-montado lípido-ADN, es decir, U4T, y oligonucleótidos que contienen motivos CpG, candidaturas, fue empleado en el presente estudio para probar la ruta apropiada inyección de inmunoterapia y vacunación en ratones2 . Importante, otras moléculas terapéuticas potenciales como antígenos, anticuerpos y agentes adyuvantes pueden sustituirse por el INP y probaron utilizando la misma metodología que se describe a continuación.
<ol><li>INP formulación2,4,7<ol>
<li>Recocido U4T (160 μm, portador) con candidaturas (80 μm, que contienen una secuencia de TLR9 agonista) en presencia de 1 x solución salina con tampón fosfato (PBS, pH 7,4) y MgCl2 (2 mM). El volumen estándar para recocido es entre 50 y 110 μl en un tubo PCR. La mezcla a 95 ° C durante 10 minutos y luego enfriar lentamente (1 ° C/16 min) a 25 ° C utilizando un termociclador. El protocolo de recocido requiere aproximadamente 2 h. PRECAUCIÓN: El líquido que contiene U4T es muy espumoso y debe manejarse con cuidado.</li>
		<li>Hacer 50 alícuotas de μl de la preparación del INP; utilizar 50 μl del material para cada inyección. Nota: En el caso de 100 μl por inyección, repita el paso 1.1 con el correcto cálculo de ingredientes.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. general Animal procedimientos
Nota: Los métodos alternativos para el manejo de los ratones se pueden utilizar dependiendo de los requisitos de laboratorio y aprobados los protocolos animales8. El tipo de ratones utilizada es ratones C57BL/6 y las 6 semanas de edad.
<ol><li>Lista de materiales<ol>
<li>Preparar el líquido anestésico (isoflurano), máquina anestésica, cámara de inhalación de dióxido de carbono (CO2), gasa esterilizada, fórceps, limitador de ratón, guantes, pinzas gancho, 1 pulgada tijeras disección, tijeras disección de 2 pulgadas, alcohol para esterilización y jeringa de insulina.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Anestesia inhalante Nota: La anestesia es obligatoria intranasal, subcutánea, bandolero y las inyecciones intravenosas de ratones9. Una cámara de inducción con un tanque de la máquina y el oxígeno de vaporizador conectado se utiliza para este procedimiento.<ol>
<li>Colocar el animal en la cámara de inducción y asegúrese de cerrar bien la tapa.</li>
		<li>Flujo de oxígeno en 1 L/min y ajustar el vaporizador a un nivel de inducción de 4% de isoflurano.</li>
		<li>Variar el tiempo de exposición de animales en la cámara dependiendo del peso de los animales; sin embargo, más de 10 s de exposición y monitoreo cada 5 min es necesario anestesia10. Nota: No hay reflejo pedal indica anestesia exitosa.</li>
		<li>Apague el inductor de isoflurano y flujo de 1 L/min de oxígeno para evitar la exposición personal a gas isoflurano.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Sacrificio<ol>
<li>Preparar una cámara CO2 inhalación sacrificio según el NIH "directrices para la eutanasia de roedores utilizando dióxido de carbono"11.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Respuesta de gag de prueba para confirmar que el animal es sacrificado totalmente.<ol>
<li>Compruebe que el ratón correctamente se sacrifica por la punta de su pie se atore y no confirmar ninguna respuesta de la mordaza. Si hay una respuesta, repita el paso 2.2.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Desinfección<ol>
<li>Desinfectar todas las áreas de la superficie utilizadas para inyecciones o disecciones con rociado de alcohol y una gasa esterilizada.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Almacenamiento del órgano<ol>
<li>Utilizar pinzas para quitar toda grasa y la sangre que rodea los órganos cosechados. Almacenar estos tejidos cosechados individualmente en una caja de Petri con 3 mL de PBS. Los contenedores y medios de comunicación pueden diferir dependiendo de los requisitos de procedimiento posterior.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. inyección rutas
<ol><li>Utilizar los métodos de seis inyección para investigar las respuestas inmunes dependientes de inyección: oral, intranasal, subcutánea, bandolero, intraperitoneal y intravenosa8,12,13.</li>
</ol>4. aislamiento de los ganglios linfáticos y el bazo
Nota: Utilice ratones magros jóvenes y sanos (6 semanas) para estos procedimientos porque las grasas que se acumulan normalmente alrededor de los nodos de linfa en los ratones más viejos son difíciles de eliminar y puede impedir la correcta visualización del órgano.
<ol><li>Pasos de pre cosecha Nota: Esta sección describe la cosecha después de la inyección del iLN, el bazo y el mLN de los ratones para el análisis de estimulación inmune. Consulte los pasos 2.3-2.5 para el sacrificio, mordaza de respuesta y métodos de desinfección.<ol>
<li>Prender las extremidades del ratón para el tablero de la espuma quirúrgica y esterilizar el lado ventral del ratón con etanol al 70%.</li>
		<li>Escoger una ubicación 2 cm por encima de la zona genital y uso enganchada pinzas para tirar de la cubierta externa de la piel como una tienda de campaña. Hacer un corte de aproximadamente 1 cm en este lugar y deslice las tijeras (2 pulgadas) por debajo de la piel, haciendo más cortes de disección.</li>
		<li>El tegumento, cortar verticalmente a través de la piel externa de ambos brazos de las tijeras (2 pulgadas). Exponer los órganos internos cubiertos con peritoneo.</li>
		<li>Prender la capa externa de la piel.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Aislamiento del nodo de linfa inguinal (iLN)
	<ol>
<li>Localice el iLN en el lado izquierdo de la pierna después de la conjunción de los vasos sanguíneos bajando la pierna izquierda, que aparece como una letra inclinada 'Y'. Nota: Para los ratones inyectados por vía subcutánea, elija un iLN en el mismo lado de la localización de la inyección.</li>
		<li>Descubrir la capa con dos pinzas para extraer la capa de cubierta lipídica y cosechar el iLN amarillo pálido (forma de frijol, 2 mm). Para el tratamiento subsecuente y el almacenaje del tejido, ver paso 2.6.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Aislamiento del bazo 14<ol>
<li>Hacer una tienda en el centro del peritoneo utilizando engancha pinzas en una mano y usar pequeño fino tijeras (1 pulgada) en la otra mano para cortar el peritoneo.</li>
		<li>Pinzas de uso enganchado en la mano izquierda para sujetar el intestino y voltee para localizar el bazo de haba-como rojo (longitud de aproximadamente 14 mm) conectado a la parte superior izquierda del abdomen de ratón.</li>
		<li>Extraiga con cuidado el bazo con otro juego de pinzas en la mano derecha mientras que la extracción de otros órganos con el fórceps enganchado. Siga el paso 2.6 para almacenar el bazo. Nota: Cuidado es necesario cuando se cosecha el bazo, ya que es un órgano suave fácilmente dañado.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Aislamiento de los ganglios linfáticos mediastínicos (mLN) Nota: El mLN está situado aproximadamente a 1 cm por debajo de las costillas y está recubierta por otros órganos como el corazón y los pulmones. Por su ubicación y pequeño tamaño, es importante exponer cuidadosamente los alrededores utilizando pinzas y tijeras (1 pulgada).<ol>
<li>Cortar el diafragma y separarlo de las costillas. Mantener el cuerpo de las costillas con unas pinzas y luego corte el lado izquierdo y derecho de las costillas con unas tijeras (1 pulgada). Prender las costillas corte sobre el hombro del ratón a la derecha para exponer el corazón y los pulmones. Nota: Procure no para cortar ninguno de los vasos sanguíneos alrededor del corazón y los pulmones, como goteando sangre dificulta localizar el pequeña mLN translúcido. Si se cortan cualquier vasos, absorber suavemente la sangre en la zona con una gasa.</li>
		<li>Usando pinzas de gancho en la mano derecha, voltear el corazón y los pulmones ligeramente a la derecha hasta la columna vertebral está expuesta. Use un par de pinzas para regulares en la mano izquierda para quitar el iLN con el fórceps enganchado en la mano derecha para ayudar con esta cosecha.</li>
		<li>Agarra los pulmones y les tapa hasta que la columna vertebral está ampliamente expuesta. El mLN (transparente en forma de frijol estructura de aproximadamente 2 mm de tamaño) se encuentra entre los pulmones y la columna vertebral.</li>
		<li>Utilizar las pinzas gancho para exponer el área alrededor de lo mLN y otros fórceps para extraer el tejido. Nota: El mLN está rodeado por numerosos otros tejidos que deben eliminarse cuidadosamente con pinzas antes de la cosecha.</li>
		<li>Consulte el paso 2.7 para las instrucciones en el almacenamiento del cosechado mLN.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. preparación de muestras para citometría de flujo
Nota: Para la activación de DCs en el iLN cosechado, el bazo y el mLN de ensayo, suspensiones de la sola célula de estos tejidos se tiñen con anticuerpos conjugados con fluorescencia como marcadores de C.C.-específicos, moléculas coestimuladoras y de histocompatibilidad complejo moléculas y analizadas por citometría de flujo.
<ol><li>
Preparación de suspensiones celulares solo: bazo
	<ol>
<li>Añadir 5 mL de medio fresco de cultivo (CM) en la placa de cultivo de 6 mm y coloque las muestras en hielo.</li>
		<li>Retire los tejidos circundantes de la sangre y la grasa y el tejido en la tapa de la placa de cultivo.</li>
		<li>Cortar los tejidos en pequeños fragmentos (< 1 mm) con unas tijeras curvas. Suspender los fragmentos en PBS seguido por girar hacia abajo el tejido utilizando una centrífuga en 646 × g por 5 min y retirar el sobrenadante.</li>
		<li>Suspender las muestras otra vez en 3 mL de CM y digerir los fragmentos con 200 μL de solución de 2% suero bovino fetal (FBS) complementado con colagenasa IV durante 20 min.</li>
		<li>Homogeneizar e incubar la muestra a 37 ° C por 1 h. filtrar los tejidos digeridos a través de la malla de nylon (100 nm) y los hace girar hacia abajo. Lavar las células en 5 mL de PBS y eliminar el sobrenadante por centrifugación.</li>
		<li>Resuspenda las células en 5 mL de solución de aislamiento de la célula. Volver a cargar otra capa de 5 mL de solución de aislamiento claro de la célula para formar una pila de capa por capa acuosa.</li>
		<li>La preparación de la célula en 2012 × g durante 10 minutos obtener el sobrenadante, que es la fracción de densidad más ligera de la centrífuga (< 1,077 g/cm3), para el análisis de citometría de flujo posterior.</li>
		<li>Contar el número de células con un hemocitómetro.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Preparación de suspensiones celulares solo: ganglio linfático
	<ol>
<li>Siga el paso 5.1.1-5.1.2.</li>
		<li>Añadir 5 mL de CM utilizando una pipeta de 10 mL para suspender las células transfiriendo 3 ó 4 veces. Después de suspender completamente las células, uso de malla de nylon estéril para filtrar las células para la colección en un tubo cónico de 15 mL.</li>
		<li>Girar las celdas abajo de 646 ×g por 7 min a 4 ° C y eliminar el sobrenadante.</li>
		<li>Añadir 5 mL adicional de CM en pipeta de 10 mL mejor suspender las células mediante pipeteo.</li>
		<li>Lavar con PBS y cuente el número de células.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Análisis de citometría de flujo
	<ol>
<li>Alícuota de 0.5-1 × 106 células en cada celular activado por fluorescencia clasificación tubo (FACS).</li>
		<li>Centrifugue a 646 × g a 4 ° C por 5 min y aspirar el sobrenadante.</li>
		<li>Añadir 5 μl de cada diluidos conjugado fluorescencia preparación de anticuerpos a las células para Resuspender el pellet celular y vortex. Nota: Es importante proteger el precipitado de células de exposición a la luz tanto como sea posible porque los anticuerpos fluorescente etiquetados son sensibles a la luz. Generar una mezcla maestra de anticuerpo y siempre agregar bloque de Fc.</li>
		<li>Preparar el tampón FACS utilizando 100 μl de PBS, 1% de FBS regular inactivado con calor y 0.1% de azida sódica.</li>
		<li>Coloque la muestra en el tubo a 4 ° C durante 30 minutos enjuague las células con 2-4 mL de FACS del almacenador intermediario y Centrifugue la muestra a 1700 rpm por 7 minutos a 4 ° C.</li>
		<li>Resuspenda las células en 500 μl de tampón FACS en la oscuridad. Analizar las células mediante citometría de flujo.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Park, H. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Preparation+of+dodecynyl+modified+DNA+nanoparticles+with+unmethylated+CpG+adjuvant+and+ovalbumin+for+immunostimulation%22">Preparation of dodecynyl modified DNA nanoparticles with unmethylated CpG adjuvant and ovalbumin for immunostimulation</a>. , Department of Chemistry. Pukyong National University, Master Thesis. (2016).</li>
<li>Jin, J. O., Park, H., Zhang, W., de Vries, J. W., Gruszka, A., Lee, M. W., Ahn, D. R., Herrmann, A., Kwak, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modular+delivery+of+CpG-incorporated+lipid-DNA+nanoparticles+for+spleen+DC+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Modular delivery of CpG-incorporated lipid-DNA nanoparticles for spleen DC activation.</a> Biomaterials. 115, 81-89 (2017).</li>
<li>Pal, I., Ramsey, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+the+lymphatic+system+in+vaccine+trafficking+and+immune+response%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+Drug+Delivery+Reviews%22%5BJournal%5D)">The role of the lymphatic system in vaccine trafficking and immune response.</a> Advanced Drug Delivery Reviews. 63 (10-11), 909-922 (2011).</li>
<li>Jin, J. O., Kwak, M., Xu, L., Kim, H., Lee, T. H., Kim, J. O., Liu, Q., Herrmann, A., Lee, P. C. W. <a target="_blank" href="https://pubs.acs.org/doi/abs/10.1021/acsbiomaterials.7b00440">Administration of soft matter lipid-DNA nanoparticle as the immunostimulant via multiple routes of injection in vivo.</a> ACS Biomaterial Science & Engineering. 3 (9), 2054-2058 (2017).</li>
<li>Worbs, T., Hammerschmidt, S. I., Förster, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dendritic+cell+migration+in+health+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Review+Immunology%22%5BJournal%5D)">Dendritic cell migration in health and disease.</a> Nature Review Immunology. 17 (1), 30-48 (2017).</li>
<li>Milling, S. W. F., Jenkins, C., MacPherson, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Collection+of+lymph-borne+dendritic+cells+in+the+rat%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Collection of lymph-borne dendritic cells in the rat.</a> Nature Protocols. 1 (5), 2263-2270 (2006).</li>
<li>Desormeaux, A., Bergeron, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lymphoid+tissue+targeting+of+anti-HIV+drugs+using+liposomes%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">Lymphoid tissue targeting of anti-HIV drugs using liposomes.</a> Methods in Enzymology. 391, 330-351 (2005).</li>
<li>Machholz, E., Mulder, G., Ruiz, C., Corning, B. F., Pritchett-Corning, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Manual+restraint+and+common+compound+administration+routes+in+mice+and+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Manual restraint and common compound administration routes in mice and rats.</a> Journal of Visualized Experiments. (67), (2012).</li>
<li>Turner, P. V., Brabb, T., Pekow, C., Vasbinder, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Administration+of+substances+to+laboratory+animals%3A+routes+of+administration+and+factors+to+consider%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Association+for+Laboratory+Animal+Science%22%5BJournal%5D)">Administration of substances to laboratory animals: routes of administration and factors to consider.</a> Journal of the American Association for Laboratory Animal Science. 50 (5), 600-613 (2011).</li>
<li><a target="_blank" href="https://staff.unimelb.edu.au/__data/assets/pdf_file/0009/1974339/STANDARD-Anaesthesia-for-mice-and-rats-FINAL.pdf">General anesthesia of mice and rats</a>. , Animal Care and Use Standards Committee. (2016).</li>
<li><a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Guidelines+for+the+Euthanasia+of+Animals%22">Guidelines for the Euthanasia of Animals</a>. , Veterinary Record. (2013).</li>
<li>JoVE Science Education Database. Lab Animal Research. Compound Administration I. <a target="_blank" href="https://www.jove.com/science-education/10198/compound-administration-i">Journal of Visualized Experiments</a>. , (2018).</li>
<li>JoVE Science Education Database. Lab Animal Research. Compound Administration III. <a target="_blank" href="https://www.jove.com/science-education/10215/compound-administration-iii">Journal of Visualized Experiments</a>. , (2018).</li>
<li>Mebius, R. E., Kraal, G. <a target="_blank" href="https://www.nature.com/articles/nri1669">Structure and function of the spleen.</a> Nature Review Immunology. 5 (8), 606-616 (2005).</li>
</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

Se han logrado muchos avances en nanotecnología y de la inmunología a través de la investigación terapéutica del fármaco y el immunostimulation. Cuidadosa selección del método de inyección se sabe para ser importante para el immunostimulation, que era el objetivo del presente estudio.
Rutas de inyección diferentes fueron evaluadas por un natural no tóxico y biodegradable basado en el ADN material, INP (inmunoestimulantes nanopartículas), para determinar el camino que rindieron los mejores resu...

Avances en Inmunología y nanomateriales han conducido a una gran cantidad de posibles nuevas estrategias terapéuticas para aplicaciones en biomedicina, incluyendo immunostimulation y entrega de la droga. Optimización de la vía de administración es un aspecto fundamental que afecta a la eficacia de agentes inmunoestimulantes. Una nanopartícula de inmunoestimulantes (INP) que consta de ADN es un coadyuvante de nano-inmune desarrollado recientemente uno montado por la separación del microphase debido a la estructura anfifílicas de lípidos-ADN1. Por lo tanto, los protocolos de INP que implica administración del material1 en vivo a través de diferentes vías y tres procedimientos para la recolección de tejidos apropiados como el nodo de linfa inguinal (iLN), mediastínica LN (mLN) y el bazo, son se describe. Por último, estos tejidos se analizaron para la activación de células dendríticas (DC), las células presentadoras de antígenos más poderosas en el sistema inmune. Este protocolo también puede ser aplicado para evaluar antígenos, anticuerpos y otros adyuvantes inmunes2.
Probamos la formulación INP porque es un agente que ha demostrado gran promesa. INP es un receptor de tipo Toll 9 (TLR9) material coadyuvante que contiene ácidos nucleicos, para que evaluación del immunostimulation eficacia se requiere prueba de inyección diferentes métodos3. En este contexto, la estimulación de la DCs es un potente extremo para evaluación en vivo . Después de que las moléculas de antígeno o inmunoestimulantes son fagocitadas por DCs en tejidos periféricos o en sangre, estas células migran a los órganos linfoides como el bazo y el LNs4,5. Así, se analizó la activación de DC en el bazo, iLN y el mLN de los animales inyectados. Adecuadamente la cosecha de estos tejidos, por tanto, también es crucial para la evaluación de la respuesta inmune a un nuevo adyuvante o patógenos5. Tal cosecha de tejido también es importante para el desarrollo de una nueva metodología inmunológica como una terapia del cáncer. Además, este protocolo puede utilizarse para verificar la eficacia de otros fármacos, como el virus de inmunodeficiencia humana terapéutica6.

<table><tbody><tr><td><Fuerte>Material</fuerte></td>solución salina tampón de fosfato Corning 21-040-CVR Órganos de lavado (PBS, pH 7.4)<td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>solución de isoflurano&nbsp;</td><td>Aesica Queenborough limited</td><td>26675-46-7</td><td>Proceso de anestesia</td></tr><tr><td>Jeringa de tuberculina 1 ml -</td><td>Junglim</td><td>N/A</td><td>Inyección</td></tr><tr><td>50 mL tubo cónico&nbsp;</td><td>S.P.L</td><td>50050</td><td>Proceso de anestesia</td></tr><tr><td>Jeringa de insulina de 1 ml&nbsp;</td><td>(BD Ultra-FineTM&shy;II)_short aguja</td><td>324826</td><td>Inyección intramuscular</td></tr><tr><td>DMEM Hiclona de alta glucosa</td><td></td><td>SH30081.01</td><td>Almacenamiento de órganos</td></tr><tr><td>Histopaque</td><td>&nbsp; Sigma-Aldrich</td><td>10771</td><td>Análisis FACS</td></tr><tr><td>Alcohol etílico anhidro 99,5 %&nbsp;</td><td>Daejung</td><td>4022-4110</td><td>Desinfectante</td></tr><tr><td><fuerte>Equipos</fuerte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>FineCycler C100 (Termociclador)</td><td>Centrífuga</td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr> Ssufine-Anealing Centrífuga <tr><td>FACS tubo&nbsp;</td><td>Análisis FALCON</td><td>2052</td><td>FACS</td></tr><tr><td>Citómetro de flujo automatizado de alto rendimiento</td><td>BD (EE. UU.), FACSVerse-FACS</td><td></td> <td>análisis</td></tr></tbody></table>

evaluación de inmunoestimulantes agente: linfoide inyección y extracción de tejido dendrítico de la célula dependiente de la ruta de activación

Immunostimulatory Agent Evaluation: Lymphoid Tissue Extraction and Injection Route-Dependent Dendritic Cell Activation

Para la evaluación de un nuevo agente terapéutico para la inmunoterapia o vacunación, análisis de la activación inmune celular en tejidos linfáticos es esencial. Aquí, hemos investigado los efectos inmunológicos de un inmunoestimulante novela lípido-ADN en forma de nanopartículas de vías de administración diferentes en el ratón: oral, intranasal, subcutánea, bandolero, intraperitoneal e intravenosa. Estas inyecciones directamente influirá en la respuesta inmune y recolección de tejidos linfáticos y análisis de la activación de células dendríticas (DC) en los tejidos son partes cruciales de estas evaluaciones. La extracción de los ganglios linfáticos mediastínicos (mLNs) es importante pero bastante complejo debido al tamaño y la ubicación de este órgano. Se describe un procedimiento paso a paso para la cosecha del bazo, nodo de linfa inguinal (iLN) y mLN y análisis de activación de DC por citometría de flujo.

Para evaluar rutas de inyección apropiado del INP para la activación del tejido linfático DC, la población de DC como linaje fue definida como –CD11c+ de las células en el bazo, iLN y mLN y analizó los niveles de expresión de moléculas coestimuladoras. Tratamiento de INP por inyección intravenosa (i.v.) y subcutánea (s.c.) promovió aumentos sustanciales en la expresión de CD40, CD80 y CD86 en el bazo y iLN DCs (figura 2B</strong...

Procedimientos experimentales para la posterior extracción de los tejidos linfáticos para probar la activación de las células dendríticas linfoides se describen después del tratamiento de un nanomaterial inmunoestimulante.

Evaluación de inmunoestimulantes agente: Linfoide inyección y extracción de tejido dendrítico de la célula dependiente de la ruta de activación

For evaluation of a new therapeutic agent for immunotherapy or vaccination, analysis of immune cell activation in lymphatic tissues is essential. Here, we ...

El objetivo general de este procedimiento es familiarizar la técnica única necesaria para aislar el ganglio linfático mediastinal de ratones. La operación se llevó a cabo después de inyectar material inmunoestimulante en seis vías diferentes en ratones. En este estudio, utilizamos una nueva clase de material formando estructuras de tamaño nano.Los surfactantes consisten en un grupo de cabeza hidrófilo y cola hidrófoba. Esos forman micelas esféricas u otra estructura secundaria debido a la separación de microfagos. Utilizamos esta propiedad para una macromolécula bio que es ADN.Los anfilismos de ADN, que se muestran aquí, como nucleótidos regulares como A, C, G, T, tienen bloques hidrófilos, mientras que las nucleobases neurocélulas modificadas en lípidos actúan como unidades hidrófobas. El oligo modificado fue sintetizado por sintetizador de ADN en octogramas a gran escala. En equi-medios, los DNAs lipídicos anfifílicos forman espontáneamente micelas esféricas de tamaño nanonúfino.Cuando se forma micela, el ADN permanece de una sola cadena como un portador vacío con alrededor de 10 nanómetros de diámetro. Para equipar al portador con inmune-estimulante, es simple cuestión de extender la secuencia de ADN con receptor similar a un peaje nueve adyuvante a saber, eCpG. El ADN lipídico y la base eCpG aquí, por lo tanto, la superficie externa de la micela se degrada con la secuencia CpG.Luego nombramos a esta partícula Nano Inmunoestimulante como la INP. Para determinar la forma adecuada de INPs para la respuesta inmune, inyectamos INPs a ratones en 64 rutas de inyección y, en consecuencia, se analizó un tejido de ganglios linfáticos adecuado. Para obtener instrucciones de inyección más detalladas, busque un artículo de JOB publicado por Charles River en 2012.La principal ventaja de este vídeo es mostrar visualmente cómo obtener el ganglio linfático mediastinal. El video muestra explícitamente la ubicación del ganglio linfático mediastinal que muchas personas encuentran una dificultad para aislar los órganos. Todos los experimentos se llevaron a cabo bajo las directrices del Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales en el Centro Clínico de Salud Pública de Shanghai, o La Facultad de Medicina de la Universidad de Ulsan.Esta parte mostrará la ubicación específica de los órganos o tejidos, que son cruciales para el análisis inmunológico. El bazo y dos ganglios linfáticos se aislarán. En primer lugar, los ratones fueron sacrificados por la eutanasia por inhalación de dióxido de carbono y se hicieron todos los esfuerzos para minimizar el sufrimiento siguiendo la guía del Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales.A partir de ahora vamos a encontrar los órganos y aislarlos. En primer lugar, fije correctamente el ratón en el escritorio de operación con cuatro pines en la palma del ratón. Esterilice el área de disección con alcohol.Disecciona la cubierta exterior de la parte inferior del abdomen del ratón con una tijera de gran tamaño. Utilice fórceps para abrir los dos lados del accesorio y fijarlo con pasadores en la mesa de operaciones. La ubicación del ganglio linfático inguinal se expone al encontrar la conjunción del vaso que baja hacia la pierna izquierda.La forma del recipiente se ve como letra del alfabeto inclinada Y.Uncover la capa con los fórceps y tira de ella de la piel. Corte el peritoneo con una tijera más pequeña para exponer los órganos internos. Mueva el intestino hacia la derecha usando fórceps y luego envuelva en el bazo en forma, que se muestra en el lado izquierdo izquierdo del abdomen.Se requiere atención adicional durante el procedimiento, ya que el bazo es fácil de interrumpir. Finalmente el punto clave de este video:cosecha del ganglio linfático mediastinol. Se encuentra debajo de la parte superior del pulmón, que es difícil de ver debido a su pequeño tamaño y ubicación algo oculta.Exponga cuidadosamente el área con tijeras y fórceps pequeños. Corte ambos lados de las costillas y el diafragma también. Sujete las costillas cortadas por encima del pecho.Durante el procedimiento evitar dañar el corazón y los vasos sanguíneos ya que podría cegar el sitio, encontrar el ganglio linfático mediastinal translúcido. Si por accidente el vaso sanguíneo estalla, limpie suavemente la sangre con gasa. Coge el lado izquierdo del pulmón y dale la vuelta suavemente al otro lado para ver debajo del pulmón.Levante el ganglio linfático mediastinal usando fórceps. Después de cosechar el ganglio linfático mediastinal, asegúrese de eliminar perfectamente toda la grasa y la sangre que rodea el ganglio linfático, ya que el tejido no deseado puede influir en el análisis. Finalmente, todos los órganos aislados en un plato de petri lleno de medios.Total 0.1 veces 10 a la sexta célula fueron analizados en esta citometría de flujo. Según la fuerza captador y el tamaño de la población de leucocitos captados fue cerrada y que las células fueron excluidas por manchas oscuras. 24 horas después de la inyección de INP por 64 vías de inyección, bazo, ganglio linfático inguinal y ganglio linfático mediastinal se cosecharon y analizaron la activación de CC por citometría de flujo.Sobre la base de la estrategia de la población de CC de citometría de flujo se definió como CÉLULAs positivas CD11C positivas y de linaje negativas en el leucocitos vivo. En particular, la inyección intranasal de INP promovió aumentos significativos en la expresión CD40, 80, 86 en el ganglio linfático mediastinol en comparación con PBS para el control. Por lo tanto, estos datos sugirieron que la inyección intranasal de INP se puede utilizar como un adyuvante mucoso para la mejora de la inmunidad en el pulmón.

immunostimulatory-agent-evaluation-lymphoid-tissue-extraction

Research

Investigación

JoVE Journal

Immunology and Infection

Inmunología e Infección

Este video muestra un método de conversión de células dendríticas (CD) en CD tolerogénicas (TolDC) utilizando un agente farmacológico inmunomodulador. Esta conversión se confirma mediante la evaluación de la función de TolDC a través de su efecto inmunosupresor sobre las células T CD4+.

Efecto de un agente farmacológico inmunomodulador en la interacción entre células dendríticas y linfocitos T CD4+

El método más comúnmente utilizado para la generación de un gran número de células dendríticas autólogas (DC) para su uso en inmunoterapia tumoral se describe. El método utiliza la IL-4 y GM-CSF para diferenciar países en desarrollo a partir de monocitos. Las CD inmaduras son estimuladas para maduro y luego se cargan con antígenos antes de que se inyectan de nuevo en el paciente.

Preparación de las células dendríticas maduras cargadas con antígeno del tumor para inmunoterapia

La vacunación profiláctica y terapéutica a menudo falla para estimular respuestas inmunes fuertes debido a la semana de drenaje de la vacuna a los ganglios linfáticos y en consecuencia pobres implicación de células inmunes. Por inyección directa de la vacuna a los ganglios linfáticos, así llamada inyección intralinfática, eficacia de la vacuna puede ser fuertemente mejorada y dosis de la vacuna se puede reducir.

Intralinfática inmunoterapia y vacunación en ratones

Las células dendríticas inmaduras pueden diferenciarse selectivamente en células dendríticas tolerogénicas o maduras para regular el equilibrio entre inmunidad y tolerancia. Este trabajo presenta un medio para generar a partir de células dendríticas inmaduras derivadas de monocitos (moDCs), in vitro tolerogénicas y moDCs maduras que difieren en fenotipos metabólicos.

Generación de inmaduras, maduras y tolerogénico células dendríticas con diferentes fenotipos metabólico

Derivados de monocitos DC (MoDC) puede detectar pequeñas cantidades de moléculas asociadas de peligro y por lo tanto son fácilmente preparada. Proporcionamos un protocolo detallado para el aislamiento de MoDC de sangre y los tumores y su activación con complejos inmunes mientras destacando medidas claves que deben considerarse para evitar su activación prematura.

Protocolo de aislamiento de células dendríticas derivadas de monocitos de ratón y su activación posterior In Vitro con complejos inmunes Tumor

Aquí presentamos una aplicación de una técnica inmunológica estándar (CFSE manchado OT-I proliferación) pretende monitorear rápidamente mediada por el adyuvante de linfocitos T citotóxicos (CTL) generación en vivo. Esta estimación rápida de la capacidad CTL es útil para el desarrollo de vacunas profilácticas contra patógenos intracelulares así como vacunas contra el cáncer terapéutico.

Rápida In Vivo evaluación de las capacidades de generación de linfocitos T citotóxicos de coadyuvante para el desarrollo de una vacuna

Aquí, presentamos un protocolo para desarrollar y caracterizar células dendríticas tolerogénicas (TolDCs) y evaluar su utilidad de la inmunoterapia.

Desarrollo y caracterización funcional de células dendríticas tolerogénicas murino

Aquí, presentamos un protocolo para la determinación de en vivo de la activación de las células (células T) CD4 T ingenua, proliferación y diferenciación de Th1 inducida por el GM-CSF de la médula (BM)-derivado de las células dendríticas (DCs). Además, este protocolo describe aislamiento del BM y del T-cell, la generación de C.C. y transferencia adoptiva de DC y del T-cell.

Un modelo de ratón In Vivo a medida ingenuo CD4 células T activación, proliferación y diferenciación de Th1 inducida por las células dendríticas derivadas de la médula ósea

El dispositivo o placa de transimmunización (TI) y los protocolos relacionados se han desarrollado para replicar las características clave de la fotoquimioterapia extracorpórea (ECP), en un entorno experimental, lo que permite la producción de células (DCs) para la inmunoterapia oncológica.

Nuevo protocolo para la generación de células dendríticas inmunogénicas fisiológicas

La metodología describe la generación de células dendríticas derivadas de monocitos bovinos (MoDC) y su aplicación para la evaluación in vitro de candidatos antigénicos durante el desarrollo de posibles vacunas veterinarias en bovinos.

Determinación de la inmunogenicidad de la vacuna utilizando células dendríticas derivadas de monocitos bovinos

Describimos un procedimiento para evaluar la capacidad de los agentes farmacológicos para generar células dendríticas tolerogénicas a partir de células dendríticas derivadas de monocitos naïve in vitro y validar su potencia mediante la generación de células T reguladoras autólogas.

Un método simple y eficiente para probar agentes inmunomoduladores para la generación de células dendríticas tolerogénicas a partir de monocitos CD14+ humanos

Aprenda a aislar ganglios linfáticos mediastínicos en ratones tras inyección de nanomaterial inmunoestimulante. Esta técnica permite evaluar la activación de células dendríticas linfoides en estudios inmunológicos.

Evaluación de inmunoestimulantes agente: Linfoide inyección y extracción de tejido dendrítico de la célula dependiente de la ruta de activación (Video) | JoVE Journal

Evaluación de inmunoestimulantes agente: Linfoide inyección y extracción de tejido dendrítico de la célula dependiente de la ruta de activación

Explorar más videos