Name: Eficiente generación de páncreas/duodeno Homeobox proteína 1+ progenitores del Foregut pancreática Posterior de hPSCs en las culturas de la adherencia (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-03-27T12:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 32 s
Description: Aprende a generar progenitores pancreáticos PDX1+ a partir de células madre pluripotentes humanas mediante cultivos en monocapa adherente. Este protocolo permite obtener poblaciones celulares homogéneas para estudios de biología del desarrollo pancreático.

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Este trabajo fue apoyado en parte por fondos de la sociedad japonesa para la promoción de la ciencia (JSP) a través de Scientific Research (C) (JSP KAKENHI Grant Number15K09385 y 18 K 08510) T.T. y subvenciones para investigadores de JSP (JSP KAKENHI número 17J07622) A.K., y la Agencia de Japón para la investigación médica y desarrollo (AMED) a través de su investigación conceder "Centro base para iPS red de centro de investigación para la realización de la medicina regenerativa, investigación con células" a K.O. Los autores agradecen a Dr. Peter Karagiannis por leer el manuscrito.

Experimentos con hPSCs fueron aprobados por el Comité de ética del Departamento de medicina y postgrado Facultad de medicina, Universidad de Kyoto.
1. preparación de materiales
Nota: Preparar todos los medios y reactivos para cultivo celular en un ambiente estéril. Calentamiento de base medios de cultivo a temperatura ambiente (RT) antes de su uso. Medio para la diferenciación se utiliza dentro de 6 h a RT. información de los reactivos se enumeran en la Tabla de materiales.
<ol><li>
Diferenciación (figura 1A)
	<ol>
<li>Medio de 1A etapa: transferencia de Medio RPMI 1640 en un tubo con una pipeta. Añadir el suplemento libre de suero, activin A, CHIR99021 y Y-27632 a una concentración de 1 x, 100 ng/mL, 3 μM y 10 μM, respectivamente.</li>
		<li>Medio de fase 1B: transferencia de Medio RPMI 1640 en un tubo con una pipeta. Añadir el suplemento libre de suero, activina A y CHIR99021 a una concentración de 1 x, 100 ng/mL, ≤ 1 μM, respectivamente. Nota: La concentración de CHIR99021 debe ser menor que en medio de 1A etapa y además no es necesario, pero aumenta el número de celular.</li>
		<li>Medio de la etapa 2: medio MEM de transferencia mejorado (iMEM) en un tubo con una pipeta. Añadir el suplemento libre de suero y factor de crecimiento de queratinocitos (KGF) a una concentración de 0,5 x y 50 ng/mL, respectivamente.</li>
		<li>Medio de la etapa 3: transferencia del iMEM medio en un tubo con una pipeta. Añadir el suplemento libre de suero, KGF, NOGGIN, 3-ceto-N-aminoetil-N'- aminocaproyldihydrocinnamoyl cyclopamine (CYC) y ácido 4-[(E)-2-(5,6,7,8-Tetrahydro-5,5,8,8-tetramethyl-2-naphthalenyl)-1-propenyl]-benzoic (TTNPB) con una pipeta para concentraciones de 0, 5 x, 50 ng/mL, 100 ng/mL, 0.5 μM y 10 nM, respectivamente.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Citometría de flujo (FCM)
	<ol>
<li>1 x buffer de permeabilización/lavado: transferencia de agua en un tubo con una pipeta. Añadir el tampón de lavado/permeabilización por una pipeta a una concentración de 1 x.</li>
		<li>Solución de bloqueo de la FCM: transfiera 1 x buffer de permeabilización/lavado en un tubo con una pipeta. Añadir suero de burro por una pipeta a una concentración del 2% (vol/vol).</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Inmunotinción
	<ol>
<li>Solución de bloqueo: salina (Phosphate-Buffered de DPBS de transferencia Dulbecco) en un tubo con una pipeta. Agregar suero de burro y Triton X pipeta a concentraciones de 5% (vol/vol) y 0.4% (vol/vol), respectivamente.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. hPSC diferenciación Posterior del Foregut pancreática células progenitores (PDX1 células+ )
Nota: Llevar a cabo todos los procedimientos con técnicas estériles. hPSCs se mantienen en placas de 6 pocillos recubiertas por una superficie sintética para hPSCs con medio de mantenimiento hPSC según las instrucciones17,26 el fabricante. Cuando las células llegan a 50-80% de confluencia (etapa 0) utiliza para la diferenciación.
<ol><li>
Preparar la membrana del sótano las placas revestidas de matriz.
	<ol>
<li>Transferencia de 6 mL de RPMI 1640 (4 °C) en un tubo refrigerado a 4 °C en hielo. Añadir 2 mg de la matriz de la membrana del sótano (4 °C) con refrigerado 1 mL-Pipetas y mezclar bien mediante pipeteo suave para hacer la matriz de la membrana del sótano de 0,33 mg/mL.</li>
		<li>Transfiera 2 mL de la matriz de la membrana del sótano diluido en cada pocillo de las placas de cultivo celular 6-bien por una pipeta. Colocar las placas a 37 °C durante 60-90 minutos en una incubadora. Después, no las placas a temperatura ambiente hasta su uso (dentro de 3 h).</li>
	</ol>
</li>
	<li>
La hPSCs de la semilla e iniciar la diferenciación al endodermo definitivo (Fase 1A).
	<ol>
<li>Aspire el medio utilizado y añadir 2 mL de ácido etilendiaminotetracético de 0,5 mM (EDTA) (RT) por pozo con una pipeta para lavar la hPSCs cultivadas en placas de 6 pozos.</li>
		<li>Aspirar 0,5 mM EDTA y añadir 2 mL de EDTA 0.5m por pozo con una pipeta. Incubar las placas a 37 °C durante 5 minutos.</li>
		<li>Aspirar 0,5 mM EDTA y añadir 1 mL de medio de mantenimiento hPSC en RT suplementado con 10 μM Y-27632 por pozo con una pipeta. Pipetee suavemente pero rápidamente a golpe Unidas células en las placas y disociar las células agrupadas en celdas individuales. No la burbuja de la suspensión de células durante el pipeteo.</li>
		<li>Transferir la suspensión de células en un tubo de centrífuga de 50 mL que contiene 4 mL de medio de mantenimiento hPSC a RT suplementado con 10 μM Y-27632. Pipetee suavemente la suspensión de células.</li>
		<li>Contar el número de células en la suspensión de células mediante el procedimiento de exclusión de tinción de azul de tripano.<ol>
<li>Mix 15 μL de suspensión celular y 15 μL de azul tripán en un tubo.</li>
			<li>Transferir 10 μL de la suspensión de células diluida con azul de tripano en celda contando los portaobjetos en duplicado por una pipeta de 10 μL.</li>
			<li>Cuenta la celda número con un contador celular automático y calcular la densidad de células en la suspensión de células. Viabilidad es generalmente > 98%.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Parte alícuota de la suspensión de células en un tubo de centrífuga de 50 mL en 1-1.5 x 106 células por pocillo de las placas de 6 pozos (1-1.5 x 105 células/cm2).</li>
		<li>Centrifugar el tubo de 50 mL a 200 x g a temperatura ambiente durante 5 minutos.</li>
		<li>Aspirar el sobrenadante con una pipeta y resuspender las células con 1 mL de medio de 1A etapa (RT) por pozo. Pipetear la suspensión de células y añadir otro 1 mL de medio de 1A etapa (total, 2 mL por pozo).</li>
		<li>Aspirar la matriz membrana basal diluida en los pocillos de las placas de cultivo celular preparados en el paso 2.1.2 por pipeta 1.000 μL. Proceder inmediatamente al siguiente paso.</li>
		<li>Suavemente pipetear la suspensión de células en el paso 2.2.8 otra vez. Inmediatamente después de mezclar, transfiera la suspensión de células (2 mL) en cada pocillo de una placa de 6 pozos. Cubra la placa con un papel de aluminio para proteger la placa de la luz. Colocar la placa en el Banco limpio a temperatura ambiente durante 10-15 minutos. Nota: No mueva la placa después de la siembra.</li>
		<li>Coloque suavemente la placa a 37 °C, 5% CO2 incubadora (ambiente humidificado) y la cultura durante 24 h. Nota: No agitar la placa después de la siembra.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Inducir la diferenciación en endodermo definitivo (etapa 1B).
	<ol>
<li>Aspire el medio utilizado y añadir 2 mL de DPBS los pozos con una pipeta. Repetir la aspiración y la adición de DPBS una vez. Nota: Para eliminar las células muertas de la monocapa, agitar suavemente la placa antes de cada aspiración.</li>
		<li>Aspire la DPBS usado por una pipeta y añadir 4 mL de medio de la 1B de la etapa (37 °C) por pozo. Coloque suavemente la placa en la incubadora de 37 °C (ambiente humidificado de 5% CO2) y la cultura durante 48 h.</li>
		<li>Aspire el medio utilizado y añadir 2 mL de DPBS al pozo con una pipeta. Repetir la aspiración y la adición de DPBS una vez. Nota: Retire las células muertas de la monocapa por agitación suave antes de cada aspiración.</li>
		<li>Aspire la DPBS usado por pipeta y añadir 4 mL de medio de la 1B de la etapa (37 °C) por pozo. Coloque suavemente la placa en la incubadora (37 °C, atmósfera humidificada de 5% CO2) y la cultura durante 24 h.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Inducir la diferenciación en el tubo del intestino primitivo (etapa 2).
	<ol>
<li>Aspire el medio utilizado y añadir 2 mL de DPBS al pozo con una pipeta. Nota: Retire las células muertas de la capa monomolecular agitando suavemente antes de cada aspiración.</li>
		<li>Aspire la DPBS usado por pipeta y añadir 4 mL de medio de etapa 2 (37 °C) por pozo. Coloque la placa en la incubadora (37 °C, atmósfera humidificada de 5% CO2) y la cultura durante 4 días.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Inducir la diferenciación en PDX1+ las células (fase 3).
	<ol>
<li>Aspire el medio utilizado y añadir 2 mL de DPBS al pozo con una pipeta. Repetir la aspiración y la adición de DPBS una vez.</li>
		<li>Aspire la DPBS usado por pipeta y añadir 4 mL de medio de etapa 3 (37 °C) por pozo. Coloque la placa en la incubadora (37 °C, atmósfera humidificada de 5% CO2) y la cultura durante 3 días.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Inducir la diferenciación en las células endocrinas pancreáticas.
	<ol>
<li>Realizar la inducción celular NKX6.1+ (etapa 4, durante 8 días) seguida por la inducción de células endocrinas (etapa 5, durante 12 días) con protocolos previamente descritos3,16,26. Caracterizar y validar la diferenciación de las células endocrinas por inmunotinción y análisis de (qRT-PCR) reacción en cadena de polimerasa de transcripción inversa en tiempo real cuantitativa. Nota: Se refieren a Toyoda et al16 y Kimura et al26 para los procedimientos experimentales detallados. Consulte la tabla 1 para secuencias de la cartilla utilizadas para el análisis de qRT-PCR.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. flujo Cytometry (FCM)
<ol><li>Aspire el medio utilizado y añadir 2 mL de EDTA 0,5 mM para el pozo con una pipeta. Repetir la aspiración y la adición de EDTA 0,5 mM una vez. Nota: Agitar la placa suavemente para eliminar las células muertas de las células de la monocapa antes de cada aspiración.</li>
	<li>Para disociar las células (aproximadamente 3-6 × 106 células por pocillo), agregar 2 mL del 0.25% tripsina que contiene 0,5 mM EDTA por pozo. Incubar las placas a 37 °C durante 5-10 minutos.</li>
	<li>Pipetee suavemente pero rápidamente para disociar las células agrupadas en celdas individuales. No la burbuja de la suspensión de células durante el pipeteo.</li>
	<li>Añadir 8-10 mL de medio base (RPMI 1640 o iMEM, RT) que contiene 0,5 x suplemento libre de suero y 10 μM Y-27632 por bien y mezclar la suspensión de células. Transferir la suspensión de células en un tubo de centrífuga.</li>
	<li>Centrifugar el tubo a 300 x g a temperatura ambiente durante 5 minutos.</li>
	<li>Aspirar el sobrenadante y resuspender las células con 2 mL de EDTA (RT) de 0,5 mM. Pipetee suavemente la suspensión de células.</li>
	<li>Centrifugar el tubo a 300 x g a temperatura ambiente durante 5 minutos.</li>
	<li>Aspirar el sobrenadante y resuspender las células con 100 μL de tampón de fijación y permeabilización por 106 células bajo una campana. Pipetee suavemente la suspensión de células debajo de una campana. Mantenga el tubo a temperatura ambiente durante 30 minutos.</li>
	<li>Centrifugar el tubo a 400 x g a temperatura ambiente durante 5 minutos.</li>
	<li>Aspirar el sobrenadante bajo una campana y resuspender las células con solución de bloqueo de la FCM de μL 500 por 106 células. Pipetee suavemente la suspensión de células. Mantenga el tubo a temperatura ambiente durante 30 minutos.</li>
	<li>Transferir 50 μL de la suspensión de células a un tubo (aproximadamente 1 x 105 células). Centrifugar el tubo a 400 x g a temperatura ambiente durante 5 minutos Retire el sobrenadante y resuspender las células con 100 μL de anticuerpo primario diluido (véase Tabla de materiales) en FCM bloqueo solución e incubar a 4 °C para > 16 h.</li>
	<li>Centrifugar el tubo a 400 x g a temperatura ambiente por 5 minutos quite el sobrenadante y resuspender las células con 180 μL de 1 x de tampón de lavado/Perm.</li>
	<li>Centrifugar el tubo a 400 x g a temperatura ambiente durante 5 minutos Retire el sobrenadante y resuspender las células con 100 μL del anticuerpo secundario diluido (véase Tabla de materiales) en solución de bloqueo de la FCM. Incube las células a temperatura ambiente durante 60 minutos o a 4 °C por > 16 h con la protección de la luz.</li>
	<li>Centrifugar el tubo a 400 x g a temperatura ambiente por 5 minutos quite el sobrenadante y resuspender las células con 180 μL de 1 x de tampón de lavado/Perm.</li>
	<li>Centrifugar el tubo a 400 x g a temperatura ambiente por 5 minutos Retire el sobrenadante y resuspender las células con 180 μL de 2% de suero de burro en DPBS.</li>
	<li>Filtrar la suspensión de células mediante la transferencia en 5 mL tubo de poliestireno fondo redondo con una célula tamiz (malla de nylon de 35 μm) y guardar a 4 °C con protección de la luz hasta el análisis.</li>
	<li>Análisis de una proporción de células teñidas positivamente por un citómetro de flujo27.</li>
</ol>4. inmunotinción
<ol><li>Aspire el medio utilizado y añadir 2 mL de DPBS al pozo con una pipeta. Repetir la aspiración y la adición de DPBS una vez. Nota: Agitar suavemente la placa para eliminar las células muertas de las células de la monocapa antes de cada aspiración.</li>
	<li>Añadir 2 mL de paraformaldehído al 4% (PFA) (4 °C) por pozo con una pipeta debajo de una campana. Mantenga la placa a 4 °C por 20 min.</li>
	<li>Quite la PFA pipeta bajo una campana. Añadir 2 mL de DPBS en RT al pozo con una pipeta debajo de una campana. Repetir la aspiración y la adición de DPBS una vez.</li>
	<li>Añadir 2 mL de solución de bloqueo por bien y mantenga la placa a temperatura ambiente durante 30 minutos.</li>
	<li>Aspirar la solución y añadir 1 mL de anticuerpo primario (véase Tabla de materiales) en solución por pozo de bloqueo. Incubar a temperatura ambiente durante 60 minutos o a 4 °C por > 16 h.</li>
	<li>Aspirar la solución, añadir 2 mL de DPBS que contenga 0,4% Tritón X-100 e incubar a temperatura ambiente durante 10 minutos repetir la aspiración, además de la solución y la incubación una vez.</li>
	<li>Aspirar la solución y añadir 1 mL de anticuerpo secundario (véase Tabla de materiales) en solución por pozo de bloqueo. Incubar a temperatura ambiente durante 60 minutos con protección de la luz.</li>
	<li>Aspirar la solución, añadir 2 mL de DPBS que contenga 0,4% Tritón X-100 (RT) e incubar a temperatura ambiente durante 5 minutos con protección de la luz. Repetir la aspiración, además de la solución e incubación dos veces.</li>
	<li>Tomar micrografías para examinar la eficacia de diferenciación bajo un microscopio de fluorescencia28.</li>
</ol>

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<li>Jonsson, J., Carlsson, L., Edlund, T., Edlund, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insulin-promoter-factor+1+is+required+for+pancreas+development+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Insulin-promoter-factor 1 is required for pancreas development in mice.</a> Nature. 371 (6498), 606-609 (1994).</li>
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<li>Hohwieler, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+pluripotent+stem+cell-derived+acinar%2Fductal+organoids+generate+human+pancreas+upon+orthotopic+transplantation+and+allow+disease+modelling%5BTitle%5D)+AND+%22Gut%22%5BJournal%5D)">Human pluripotent stem cell-derived acinar/ductal organoids generate human pancreas upon orthotopic transplantation and allow disease modelling.</a> Gut. 66 (3), 473-486 (2017).</li>
<li>Takeuchi, H., Nakatsuji, N., Suemori, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endodermal+differentiation+of+human+pluripotent+stem+cells+to+insulin-producing+cells+in+3D+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Endodermal differentiation of human pluripotent stem cells to insulin-producing cells in 3D culture.</a> Scientific Reports. 4, 4488(2014).</li>
</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

La generación de PDX1+ células se compone de varios pasos; por lo tanto, es fundamental para el tratamiento de las células en el momento adecuado. Entre las medidas, la eficacia de la inducción del endodermo definitivo afecta en gran medida la eficacia de la inducción final, posiblemente por interferencia de otras células contaminantes linaje (es decir, mesodermo y ectodermo), que pueden proliferar o secretar factores interrumpir la diferenciación específica. Si la proporción de SOX17+ las células e...

El páncreas principalmente consiste en las células exocrinas y endocrinas, y su disfunción o sobrecarga causa varias enfermedades, como la pancreatitis, diabetes y cáncer de páncreas. Para aclarar la patogenia de la pancreatopathy, es necesario analizar el proceso de desarrollo y la función de las células pancreáticas. Además, una fuente estable de la célula con sólida calidad es necesaria para establecer la terapia de suplementación de tejido de la célula. Célula de vástago de pluripotent humanas (hPSC)-derivado de las células pancreáticas son una fuente prometedora de células para estos fines, y el protocolo de diferenciación hacia células pancreáticas ha sido intensamente estudiado1,2,3, 4. Los recientes avances en la generación in vitro de las células β pancreáticas mímico la generación de las células β en adultos humanos y estas células Mostrar eficacia terapéutica sobre implante en modelo diabético ratones2,3. Además, el análisis de las células β generados a partir de las células madre pluripotentes inducidas (iPSCs) saludable los donantes paciente de diabetes tipo 1 no reveló ninguna diferencia funcional incluyendo cuando está bajo estrés5. Por otra parte, fenotipos de la enfermedad han sido parcialmente reproducidos en células pancreáticas inducidas con iPSCs derivados del paciente o hPSCs que las mutaciones genéticas en el mismo sitio que los pacientes6,7.
Para generar células pancreáticas de hPSCs, se utiliza la diferenciación dirigida paso a paso que recapitula los procesos de desarrollo. El páncreas se deriva de la capa del endodermo del embrión temprano, que expresa el sexo determina la región Y-caja 17 (SOX17) y forkhead cuadro A2 (FOXA2)8. Basado en los estudios con ratones, la capa endodermal forma el tubo intestino primitivo, que se caracteriza por la expresión de hepatocitos factor nuclear 1-beta (Hnf1β) y el factor nuclear de hepatocito 4-alfa (Hnf4α). El tubo intestino primitivo se alarga y se convierte en el aparato respiratorio, tracto digestivo y órganos. Después de la elongación, el área posterior del foregut se convierte la presunta región pancreática, y marcada por la expresión de la proteína del factor transcripcional páncreas/duodeno homeobox 1 (PDX1)8,9,10. Las partes dorsales y ventrales de la PDX1+ tubo intestinal espesar a brotes pancreáticos forma, que se caracterizan por la coexpresión de páncreas transcripción factor 1 subunidad alfa (PTF1A) y NK6 homeobox 1 (NKX6.1)8,11. Esta expresión marca el comienzo morfológico de la organogénesis pancreática. Las células del páncreas endodermo, que son componentes de las yemas pancreáticas, forman una red tubular ramificada de estructuras epiteliales12 y finalmente se diferencian en células exocrinas y endocrinas, incluyendo β-células secretoras de insulina y α-células secretoras de glucagón. Expresión de PDX1 se detecta primero en la región pancreática presuntiva, que luego se observa a lo largo de todo el desarrollo pancreático y muestra localización de las células β y δ9,13,14. Aunque el Pdx1+ área de células que no expresan Ptf1a o Nkx6.1 distingue en el antro gástrico, duodeno, vía biliar extrahepática y algunas células intestinales en el centro a la última etapa de desarrollo en ratones9, PDX1+ las células son consideradas los progenitores del páncreas en la primera etapa del desarrollo en seres humanos.
Aquí, presentamos un protocolo detallado para distinguir hPSCs en PDX1+ de las células para la generación de linajes pancreáticos. El protocolo inicia la diferenciación por la siembra disocia las células15,16,17. En general, hPSCs indiferenciadas se mantienen como colonias o agregados de células en suspensión o en la adhesión. Como resultado, la mayoría de protocolos inician la diferenciación poco después pases. Sin embargo, en el estado de colonias o agregados de células son propensas a heterogeneidades espaciales y transcripcional18,19,20,21,22, que podrían dificultar la primer paso de diferenciación hacia endodermo definitivo seguido por ineficiente diferenciación PDX1+ las células. El presente Protocolo puede ofrecer un manejo fácil para mejorar y estabilizar la eficiencia de la diferenciación de algunas líneas de hPSC que previamente fueron encontrados para distinguir ineficazmente a linajes endodérmicos y PDX1+ células23, 24 , 25.

<table><tbody><tr><td>3-Keto-N-aminoetil-N&prime;-aminocaproildihidrocinamoil ciclopamina</td><td>Toronto Research Chemicals</td><td>K171000</td><td>CYC</td></tr><tr><td>4-[(E)-2-(5,6,7,8-tetrahidro-5,5,8,8-tetrametil-2-naftalenil)-1-propenil]-benzoico</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>SC-203303</td><td>TTNPB</td></tr><tr><td>50 mL Tubos de centrífuga de polipropileno estériles cónicos</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>339652</td><td></td></tr><tr><td>Anticuerpo anti-CDX2 [EPR2764Y]</td><td>Abcam</td><td>Ab76541</td><td>Anti-CDX2, &veces; 1/1000 dilución</td></tr><tr><td>B-27 Suplemento (50 &veces;)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>17504-044</td><td>Suplemento sin suero</td></tr><tr><td>BD FACSAria II Clasificador</td><td>de células BD Biosciences</td><td></td><td>Para citometría de flujo</td></tr><tr><td>Congelador biomédico</td><td>SANYO</td><td>MDF-U538</td><td>Para -30 &deg; C</td></tr><tr><td>Almacenamiento Portaobjetos de recuento de células para TC10/TC20 Contador de células, de doble cámara</td><td>BIO-RAD</td><td>1450011</td><td>portaobjetos de recuento</td></tr><tr><td>de vidrio PLACA MULTIPOCILLO PARA CULTIVO CELULAR, 6 POCILLOS, PS, Transparente</td><td>Greiner Bio-One</td><td>657165</td><td>Para cultivo de diferenciación/placa de 6 pocillos</td></tr><tr><td>centrífuga</td><td>TOMY AX-310</td><td></td><td>Para cultivo celular</td></tr><tr><td>Centrífuga</td><td>TOMY</td><td>MX-305</td><td>Para RT-qPCR</td></tr><tr><td>CHIR99021</td><td>Axon Medchem</td><td>Axon 1386</td><td></td></tr><tr><td>BANCO LIMPIO</td><td>SHOWA KAGAKU&nbsp;</td><td>S-1601PRV</td><td>Banco limpio</td></tr><tr><td>Corning CellBIND Placa de 6 pocillos</td><td>Corning</td><td>3335</td><td>Para el cultivo sin alimentador de hPSCs/placa de 6 pocillos</td></tr><tr><td>Corning Matrigel Membrana Basal Factor de Crecimiento Factor de Crecimiento Reducido</td><td>Corning</td><td>354230</td><td>Matriz de membrana basal</td></tr><tr><td>Corning Synthemax II-SC</td><td>Sustrato Corning</td><td>3535</td><td>Para el cultivo sin alimentador de hPSCs/material de superficie sintético para hPSCs</td></tr><tr><td>Criostato</td><td>Leica</td><td>Leica CM1510 S</td><td>Para inmunotinción de agregados.</td></tr><tr><td>Cytofix/Cytoperm Kit</td><td>Becton Dickinson</td><td>554714</td><td>tampón de permanente/lavado es&nbsp; Tampón de permeabilización/lavado. El tampón Cytofix/Cytoperm es un tampón de fijación y permeabilización.</td></tr><tr><td>Bolígrafo Dako</td><td></td><td>Dako S2002</td><td>Para la inmunotinción de agregados</td></tr><tr><td>Mezcla dNTP (10 mM)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>18427-088</td><td>Para RT-qPCR</td></tr><tr><td>Anticuerpo secundario de adsorción cruzada Donkey anti-Goat IgG (H+L), Alexa Fluor 488</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A11055</td><td>Anticuerpo secundario, &veces; dilución 1/500</td></tr><tr><td>Donkey anti-Mouse IgG (H+L) Anticuerpo secundario altamente adsorbido cruzado, Alexa Fluor 546</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A10036</td><td>Anticuerpo secundario, &veces; dilución 1/500 Donkey</td></tr><tr><td>anti-Rabbit IgG (H+L) Anticuerpo secundario altamente adsorbido cruzado, Alexa Fluor 546</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A10040</td><td>Anticuerpo secundario, y veces; dilución 1/500 Suero</td></tr> de <tr><td>burro</td><td>Merck Millipore</td><td>S30</td><td>Suero de burro</td></tr><tr><td>D-PBS(-) sin Ca o Mg</td><td>Nacalai tesque</td><td>14249-95</td><td>DPBS</td></tr><tr><td>Essential 8 Medium</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A1517001</td><td>Para el cultivo sin alimentador de hPSCs/medio de mantenimiento hPSC</td></tr><tr><td>Falcon 5 mL Tubo de ensayo de poliestireno de fondo redondo, con filtro de celdas Tapón a presión</td><td>Corning</td><td>352235</td><td>5 mL tubo de poliestireno de fondo redondo con filtro de celdas</td></tr><tr><td>Punta de filtro, 1,000 y micro; L</td><td>Watoson</td><td>124-1000S</td><td>Úselo junto con pipetas</td></tr><tr><td>Punta de filtro, 20 y micro; L</td><td>Watoson</td><td>124-P20S</td><td>Úselo junto con pipetas</td></tr><tr><td>Punta de filtro, 200 y micro; L</td><td>Watoson</td><td>124-P200S</td><td>Úselo junto con pipetas</td></tr><tr><td>Microscopio de fluorescencia</td><td>Keyence</td><td>BZ-X700</td><td>para inmunotinción</td></tr><tr><td>Forma Steri-Cycle Incubadora de CO2</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>370A</td><td>Incubadora</td></tr><tr><td>HNF-1&beta; Anticuerpo (C-20)</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-7411</td><td>Anti-HNF1&beta;, &veces; dilución 1/200</td></tr><tr><td>HNF-4&alfa; Anticuerpo (H-171)</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-8987</td><td>Anti-HNF4&alpha;, &veces; dilución 1/200</td></tr><tr><td>Hoechst 33342</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>H3570</td><td>Para tinción de núcleos, &veces; dilución 1/200</td></tr><tr><td>Páncreas humano ARN total</td><td>Ambion</td><td>AM7954</td><td>para RT-qPCR</td></tr><tr><td>Anticuerpo humano PDX-1/IPF1 R</td><td>& D Systems</td><td>AF2419</td><td>Anti-PDX1, IgG de cabra, &times; dilución 1/200</td></tr><tr><td>Anticuerpo SOX17 humano</td><td>R& D Systems</td><td>AF1924</td><td>Anti-SOX17, &veces; dilución 1/200</td></tr><tr><td>MEM mejorado Opción de zinc medio</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10373-017</td><td>iMEM</td></tr><tr><td>Cámara de incubación</td><td>Cosmo Bio</td><td>10DO</td><td>Para la inmunotinción de agregados Guantes de</td></tr><tr><td>examen de látex</td><td>Adachi</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Vidrio deslizante recubierto MAS</td><td>Matsunami Glass</td><td>83-1881</td><td>Para inmunotinción de agregados</td></tr><tr><td>MicroAmp Fast placa de reacción de 96 pocillos</td><td>Applied Biosystems/Thermo Fisher Scientific</td><td>4346907</td><td>para RT-qPCR</td></tr><tr><td>Microscopio</td><td>Olympus</td><td>CKX41N-31PHP</td><td>Para cultivo celular</td></tr><tr><td>Microtubo</td><td>Watoson</td><td>131-515CS</td><td></td></tr><tr><td>Monoclonal Anti-&alfa;-Fetoproteína</td><td>SIGMA</td><td>A8452</td><td>Anti-AFP, &veces; dilución 1/200</td></tr><tr><td>Nanodrop 8000</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td></td><td>para RT-qPCR</td></tr><tr><td>Oligo dT</td><td>FASMAC</td><td>Oligo hecho a medida &nbsp;</td><td>Para RT-qPCR de la secuencia es "TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT"</td></tr><tr><td>Paraformaldehído, polvo</td><td>Nacalai tesque</td><td>26126-54</td><td>PFA, fijador, diluido en DPBS</td></tr><tr><td>Refrigerador farmacéutico</td><td>SANYO</td><td>MPR-514</td><td>Para 4 & deg; C almacenamiento</td></tr><tr><td>PIPETMAN P&nbsp;</td><td>GILSON</td><td></td><td>Pipeta</td></tr><tr><td>Humana Recombinante KGF/FGF-7</td><td>R& D Systems</td><td>251-KG</td><td>KGF</td></tr><tr><td>Recombinante Humano Noggin</td><td>PeproTech</td><td>120-10C</td><td>NOGGIN</td></tr><tr><td>Recombinante Humano/Ratón/Rata Activina A</td><td>R& D Systems</td><td>338-AC</td><td>Activin A</td></tr><tr><td>ReverTra Ace (100 U/&mu; L)</td> <td>TOYOBO</td><td>TRT-101</td><td>para RT-qPCR</td></tr><tr><td>Juego de DNasa libre de RNasa (50)</td><td>QIAGEN</td><td>79254</td><td>Para RT-qPCR</td></tr><tr><td>RNeasy Mini Kit</td><td>QIAGEN</td><td>74104</td><td>para RT-qPCR</td></tr><tr><td>RPMI 1640 con L-Gln</td><td>Nacalai tesque</td><td>30264-85</td><td>RPMI 1640</td></tr><tr><td>Película de sellado para tiempo real</td><td>Takara</td><td>NJ500</td><td>para RT-qPCR</td></tr><tr><td>Pipetas serológicas 10 mL</td><td>Costar/Corning</td><td>4488</td><td>Para el cultivo celular</td></tr><tr><td>Pipetas serológicas 25 mL</td><td>Costar/Corning</td><td>4489</td><td>Para el cultivo celular</td></tr><tr><td>Pipetas serológicas 5 mL</td><td>Costar/Corning</td><td>4487</td><td>Para el cultivo celular</td></tr><tr><td>Sox2 (D6D9) XP Rabbit mAb</td><td>Señalización celular</td><td>3579S</td><td>Anti-SOX2, y dilución 1/200</td></tr><tr><td>StepOnePlus</td><td>Applied Biosystems/Thermo Fisher Científico</td><td></td><td>Para RT-qPCR</td></tr><tr><td>Sacarosa</td><td>Nacalai tesque</td><td>30406-25</td><td>Para la inmunotinción de agregados</td></tr><tr><td>TB Green Premix Ex Taq II&nbsp;</td><td>Takara</td><td>RR820B</td><td>para RT-qPCR</td></tr><tr><td>TC20 Contador de células automatizado</td><td>BIO-RAD</td><td>1450101J1</td><td>Contador de células automático</td></tr><tr><td>Compuesto Tissue-Tek OCT 4583&nbsp;</td><td>Sakura Finetechnical</td><td>4583</td><td>Para la inmunotinción de agregados</td></tr><tr><td>Tissue-Tek Cryomold Moldes/Adaptadores</td><td>Sakura Finetechnical</td><td>4566</td><td>Para la inmunotinción de agregados</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Nacalai tesque</td><td>35501-15</td><td></td></tr><tr><td>Trypan Blue</td><td>BIO-RAD</td><td>1450021</td><td></td></tr><tr><td>Congelador ultrafrío</td><td>SANYO</td><td>MDF-U33V</td><td>Para -80 &deg; C almacenamiento</td></tr><tr><td>UltraPure 0,5M EDTA, pH 8,0</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15575-038</td><td>Diluir con DPBS para preparar 0,5 mM EDTA</td></tr><tr><td>Veriti Termociclador</td><td>Applied Biosystems/Thermo Fisher Scientific</td><td></td><td>para RT-qPCR</td></tr><tr><td>Y-27632</td><td>Wako</td><td>251-00514</td><td></td></tr></tbody></table>

eficiente generación de páncreas/duodeno homeobox proteína 1+ progenitores del foregut pancreática posterior de hpscs en las culturas de la adherencia

Efficient Generation of Pancreas/Duodenum Homeobox Protein 1+ Posterior Foregut/Pancreatic Progenitors from hPSCs in Adhesion Cultures

Célula de vástago de pluripotent humanas (hPSC)-derivado de las células pancreáticas son una fuente prometedora de células para la medicina regenerativa y una plataforma para el estudio de procesos de desarrollo humanos. Paso a paso dirigido a la diferenciación que recapitula los procesos de desarrollo es una de las principales formas de generar células pancreáticas incluyendo proteína de páncreas/duodeno homeobox 1+ (PDX1+) células progenitoras pancreáticas. Protocolos convencionales inician la diferenciación con pequeñas colonias poco después del paso. Sin embargo, en el estado de colonias o agregados de células son propensas a heterogeneidades, que podrían dificultar la diferenciación a PDX1+ las células. Aquí, presentamos un protocolo detallado para distinguir hPSCs en PDX1+ las células. El protocolo consta de cuatro pasos e inicia la diferenciación de células disociadas siembra. La inducción de SOX17+ las células del endodermo definitivo fue seguida por la expresión de marcadores de tubo de intestino primitivo dos, HNF1β y HNF4α y eventual diferenciación en PDX1+ las células. El presente Protocolo proporciona fácil manejo y puede mejorar y estabilizar la eficiencia de la diferenciación de algunas líneas de hPSC que previamente fueron encontrados ineficazmente diferenciarse en linajes endodérmicos o PDX1+ las células.

Propagación hiPSCs (585A129,30) se condensan y forman una monocapa homogénea (figura 1B) que es conveniente para la diferenciación. HiPSCs indiferenciados (etapa 0) son disociados y volver a sembrar como células individuales en densidades bajas de la célula (1-1.5 x 105 células/cm2). Dentro de 1 h, las células se unen a la placa y comiencen a mostrar protrusión. El día 1, las células proliferan y bien distribuid...

Aquí, presentamos un protocolo detallado para distinguir las células de vástago pluripotent humanas (hPSCs) en la proteína de páncreas/duodeno homeobox 1+ (PDX1+) las células para la generación de linajes pancreáticos basan en el crecimiento de monocapa tipo de Colonia no de disociar las células. Este método es adecuado para producir células derivadas del hPSC homogéneas, manipulación genética y selección.

Eficiente generación de páncreas/duodeno Homeobox proteína 1+ progenitores del Foregut pancreática Posterior de hPSCs en las culturas de la adherencia

Human pluripotent stem cell (hPSC)-derived pancreatic cells are a promising cell source for regenerative medicine and a platform to study human ...

La principal ventaja de esta técnica es que antes de la estimulación, las células se dispersan uniformemente y luego se estimulan uniformemente en la adhesión celular en tándem. Demostrando el procedimiento estará Azuma Kimura, un estudiante graduado de nuestro laboratorio. Para comenzar este procedimiento, transfiera seis mililitros de RPMI 1640 a un tubo enfriado a cuatro grados Celsius sobre hielo.Usando puntas de pipeta de un mililitro enfriada, agregue dos miligramos de matriz de membrana del sótano. Mezclar bien por pipeteo suave para que sea una matriz de membrana sótano con una concentración de 0.33 miligramos por mililitro. A continuación, utilice una pipeta para transferir dos mililitros de la matriz de membrana del sótano diluido a cada pozo de una placa de cultivo celular de seis pozos.Incubar la placa a 37 grados centígrados durante 60 a 90 minutos. Después de esto, mantenga la placa a temperatura ambiente durante un máximo de tres horas, hasta que esté lista para usar. En primer lugar, aspirar el medio utilizado y utilizar una pipeta para añadir dos mililitros de EDTA de 0,5 milimolares a cada pozo para lavar los hPCS cultivados en la placa de seis pozos.A continuació

efficient-generation-pancreasduodenum-homeobox-protein-1-posterior

Research

Investigación

JoVE Journal

Developmental Biology

Biología del Desarrollo

Aquí se describe un método para el aislamiento, cultivo y manipulación de páncreas de ratón embrionario. Esto representa un...

Un sistema para la<em&gt; Ex vivo</em&gt; Cultivo de páncreas embrionario

El método de cultivo en tres dimensiones se describe en este protocolo recapitula el desarrollo del páncreas a partir de progenitores páncreas de ratón embrionarias dispersas, incluyendo su expansión sustancial, diferenciación y morfogénesis en un órgano ramificada. Este método es susceptible de formación de imágenes, la interferencia funcional y la manipulación del nicho.

In Vitro Páncreas Organogenesis de dispersos embrionarios de ratón Progenitores

Aquí se describe un protocolo de 4 etapas para diferenciar células madre embrionarias humanas para NKX6-1 + progenitoras pancreáticas in vitro. Este protocolo se puede aplicar a una variedad de líneas de células madre pluripotentes humanas.

La diferenciación eficiente de pluripotentes células madre a NKX6-1<sup&gt; +</sup&gt; Progenitores pancreáticas

Protocolos para generar HPSC líneas mutantes que utilizan la plataforma iCRISPR y se diferencien en células hPSCs ß-como sensibles a glucosa se describen. La combinación de la tecnología de edición del genoma con la diferenciación dirigida HPSC proporciona una potente plataforma para el análisis sistemático de la función de los factores determinantes del linaje en el desarrollo humano y la progresión de la enfermedad.

Genoma Edición y diferenciación dirigida de hPSCs para interrogar Determinantes linaje en el Desarrollo Humano de páncreas

Aquí, presentamos un protocolo para generar insulina expresando 3D pancreatoids murino de e10.5 flotante disociado progenitores pancreático y el mesenchyme asociado.

Generación de insulina libre de andamios, tridimensional expresar Pancreatoids de progenitores pancreáticos de ratón In Vitro

Este protocolo presenta una comparación entre dos protocolos de inducción diferentes para diferenciar las células madre de la pulpa dental humana (hDPSC) hacia los linajes pancreáticos in vitro:el protocolo integrador y el protocolo no integrativo. El protocolo integrador genera más células productoras de insulina (IMIC).

In vitro Inducción de células madre de pulpa dental humana hacia linajes pancreáticos

El presente protocolo describe un método mejorado para aumentar la coexpresión de los factores de transcripción PDX1 y NKX6.1 en progenitores pancreáticos derivados de células madre pluripotentes humanas (hPSC) en monocapas planas. Esto se logra reponiendo la matriz fresca, manipulando la densidad celular y disociando las células endodérmicas.

Diferenciación de células madre pluripotentes humanas en precursores de células beta pancreáticas en un sistema de cultivo 2D

La diferenciación de las células madre en células de los islotes proporciona una solución alternativa al tratamiento convencional de la diabetes y al modelado de la enfermedad. Describimos un protocolo detallado de cultivo de células madre que combina un kit de diferenciación comercial con un método previamente validado para ayudar a producir islotes derivados de células madre secretores de insulina en una placa.

Diferenciación de células madre pluripotentes humanas en grupos de islotes productores de insulina

Este artículo presenta un protocolo para la diferenciación dirigida y el análisis funcional de células similares a β células. Describimos las condiciones óptimas de cultivo y los pasajes para las células madre pluripotentes humanas antes de generar células pancreáticas productoras de insulina. La diferenciación de seis etapas progresa desde la formación definitiva del endodermo hasta las células funcionales similares a las células β que secretan insulina en respuesta a la glucosa.

Protocolo optimizado para generar células pancreáticas funcionales secretoras de insulina a partir de células madre pluripotentes humanas

Las células de epitelio pigmentario de la retina (EPR) derivadas de células madre pueden utilizarse para múltiples aplicaciones, incluidas las terapias basadas en células para la degeneración de la retina, el modelado de enfermedades y los estudios de fármacos. Aquí presentamos un protocolo simple para derivar de manera reproducible EPR a partir de células madre.

Derivación eficiente de células de la retina epitelio pigmentario de Células Madre

Aprende a generar progenitores pancreáticos PDX1+ a partir de células madre pluripotentes humanas mediante cultivos en monocapa adherente. Este protocolo permite obtener poblaciones celulares homogéneas para estudios de biología del desarrollo pancreático.

Eficiente generación de páncreas/duodeno Homeobox proteína 1+ progenitores del Foregut pancreática Posterior de hPSCs en las culturas de la adherencia (Video) | JoVE Journal

Eficiente generación de páncreas/duodeno Homeobox proteína 1⁺ progenitores del Foregut pancreática Posterior de hPSCs en las culturas de la adherencia

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