Name: Cuantificar la morfología de la microglía de microfotografías de la inmunohistoquímica preparado tejido con ImageJ (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-06-05T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 44 s
Description: Aprende a cuantificar la morfología de la microglía en tejido cerebral con ImageJ mediante análisis de esqueletización y fractales. Este protocolo de alto rendimiento permite estudiar neuroinflamación sin software propietario.

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Este estudio recibió apoyo financiero de NINR (F32NR013611). Nos gustaría reconocer y agradecer a los desarrolladores de AnalyzeSkeleton(2D/3D) y FracLac (Arganda Carreras et al y Karperien et al., respectivamente) sin que el análisis aquí descrito no sería posible.

<ol><li>Davalos, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ATP+mediates+rapid+microglial+response+to+local+brain+injury+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">ATP mediates rapid microglial response to local brain injury in vivo.</a> Nat Neurosci. 8 (6), 752-758 (2005).</li>
<li>Karperien, A., Ahammer, H., Jelinek, H. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitating+the+subtleties+of+microglial+morphology+with+fractal+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Cell+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Quantitating the subtleties of microglial morphology with fractal analysis.</a> Front Cell Neurosci. 7 (3), eCollection(2013).</li>
<li>Taylor, S. E., Morganti-Kossmann, C., Lifshitz, J., Ziebell, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rod+microglia%3A+a+morphological+definition%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Rod microglia: a morphological definition.</a> PLoS One. 9 (5), e97096(2014).</li>
<li>Nimmerjahn, A., Kirchhoff, F., Helmchen, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Resting+microglial+cells+are+highly+dynamic+surveillants+of+brain+parenchyma+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Resting microglial cells are highly dynamic surveillants of brain parenchyma in vivo.</a> Science. 308 (5726), 1314-1318 (2005).</li>
<li>Abiega, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuronal+Hyperactivity+Disturbs+ATP+Microgradients%2C+Impairs+Microglial+Motility%2C+and+Reduces+Phagocytic+Receptor+Expression+Triggering+Apoptosis%2FMicroglial+Phagocytosis+Uncoupling%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biol%22%5BJournal%5D)">Neuronal Hyperactivity Disturbs ATP Microgradients, Impairs Microglial Motility, and Reduces Phagocytic Receptor Expression Triggering Apoptosis/Microglial Phagocytosis Uncoupling.</a> PLoS Biol. 14 (6), e1002466(2016).</li>
<li>Wyatt-Johnson, S. K., Herr, S. A., Brewster, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Status+Epilepticus+Triggers+Time-Dependent+Alterations+in+Microglia+Abundance+and+Morphological+Phenotypes+in+the+Hippocampus%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Neurol%22%5BJournal%5D)">Status Epilepticus Triggers Time-Dependent Alterations in Microglia Abundance and Morphological Phenotypes in the Hippocampus.</a> Front Neurol. 8 (700), eCollection(2017).</li>
<li>Morrison, H., Young, K., Qureshi, M., Rowe, R. K., Lifshitz, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+microglia+analyses+reveal+diverse+morphologic+responses+in+the+rat+cortex+after+diffuse+brain+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Quantitative microglia analyses reveal diverse morphologic responses in the rat cortex after diffuse brain injury.</a> Sci Rep. 7 (1), 13211(2017).</li>
<li>Morrison, H. W., Filosa, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+quantitative+spatiotemporal+analysis+of+microglia+morphology+during+ischemic+stroke+and+reperfusion%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neuroinflammation%22%5BJournal%5D)">A quantitative spatiotemporal analysis of microglia morphology during ischemic stroke and reperfusion.</a> J Neuroinflammation. 10 (4), (2013).</li>
<li>Gyoneva, S., Traynelis, S. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Norepinephrine+modulates+the+motility+of+resting+and+activated+microglia+via+different+adrenergic+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Norepinephrine modulates the motility of resting and activated microglia via different adrenergic receptors.</a> J Biol Chem. 288 (21), 15291-15302 (2013).</li>
<li>Xu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Environmental+Enrichment+Potently+Prevents+Microglia-Mediated+Neuroinflammation+by+Human+Amyloid+beta-Protein+Oligomers%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Environmental Enrichment Potently Prevents Microglia-Mediated Neuroinflammation by Human Amyloid beta-Protein Oligomers.</a> J Neurosci. 36 (35), 9041-9056 (2016).</li>
<li>Rodriguez, J. J., Noristani, H. N., Verkhratsky, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglial+response+to+Alzheimer%27s+disease+is+differentially+modulated+by+voluntary+wheel+running+and+enriched+environments%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Struct+Funct%22%5BJournal%5D)">Microglial response to Alzheimer's disease is differentially modulated by voluntary wheel running and enriched environments.</a> Brain Struct Funct. 220 (2), 941-953 (2015).</li>
<li>Soltys, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+morphological+study+of+microglial+cells+in+the+ischemic+rat+brain+using+principal+component+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Methods%22%5BJournal%5D)">Quantitative morphological study of microglial cells in the ischemic rat brain using principal component analysis.</a> J Neurosci Methods. 146 (1), 50-60 (2005).</li>
<li>Orlowski, D., Soltys, Z., Janeczko, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Morphological+development+of+microglia+in+the+postnatal+rat+brain.+A+quantitative+study%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Dev+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Morphological development of microglia in the postnatal rat brain. A quantitative study.</a> Int J Dev Neurosci. 21 (8), 445-450 (2003).</li>
<li>Morrison, H. W., Filosa, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sex+differences+in+astrocyte+and+microglia+responses+immediately+following+middle+cerebral+artery+occlusion+in+adult+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Sex differences in astrocyte and microglia responses immediately following middle cerebral artery occlusion in adult mice.</a> Neuroscience. 339, (2016).</li>
<li>Arganda-Carreras, I., Fernandez-Gonzalez, R., Munoz-Barrutia, A., Ortiz-De-Solorzano, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((3D+reconstruction+of+histological+sections%3A+Application+to+mammary+gland+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Microsc+Res+Tech%22%5BJournal%5D)">3D reconstruction of histological sections: Application to mammary gland tissue.</a> Microsc Res Tech. 73 (11), 1019-1029 (2010).</li>
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<li>Davis, B. M., Salinas-Navarro, M., Cordeiro, M. F., Moons, L., De Groef, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterizing+microglia+activation%3A+a+spatial+statistics+approach+to+maximize+information+extraction%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Characterizing microglia activation: a spatial statistics approach to maximize information extraction.</a> Sci Rep. 7 (1), 1576(2017).</li>
<li>Ferreira, T., Rasband, W. ImageJ User Guide. , Available from:
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<li>Martyanova, E. K., Tishkina, A. O. <a target="_blank" href="https://www.researchgate.net/publication/283055226_3D_quantitative_analysis_of_microglial_morphology">3D quantitative analysis of microglial morphology.</a> available as conference preceedings SkoltechOn. , (2015).</li>
<li>Fernandez-Arjona, M. D. M., Grondona, J. M., Granados-Duran, P., Fernandez-Llebrez, P., Lopez-Avalos, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglia+Morphological+Categorization+in+a+Rat+Model+of+Neuroinflammation+by+Hierarchical+Cluster+and+Principal+Components+Analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Cell+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Microglia Morphological Categorization in a Rat Model of Neuroinflammation by Hierarchical Cluster and Principal Components Analysis.</a> Front Cell Neurosci. 11 (235), eCollection(2017).</li>
</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

Las células de microglía están finamente sintonizadas a la fisiología y la patología dentro de sus micro-dominios y mostrar una amplia gama de morfologías2 en sutil7,14 y grave lesión8. El uso de protocolos de ImageJ hace cuantificación de morfología microglia accesible a todos los laboratorios como la plataforma y los plugins son una imagen de la abrir-fuente software de procesamiento. Mientras que el protocolo descrito se centra en el procesamiento de imágenes y análisis de uso de este software, la consistencia de recopilación de datos, validez y confiabilidad comienza con excelente IHC y microscopía. Este protocolo se utiliza para mejorar el binario, el esqueleto y representaciones de contorno de microfotografías de todos y de las células pero no puede tomar el lugar de pobre tinción IHQ y microscopia que resulta en bajo contraste, borrosas o distorsionadas imágenes. Como una consideración adicional, se debe tener cuidado no a aplanar el tejido cerebral durante el almacenamiento, antes de seccionar, que irrevocablemente altera la morfología de la microglia. Por último, dentro de cada experimento, microglia debe ser reflejada utilizando la misma escala, así como el mismo microscopio. Software, instrumentación y objetivos varían entre microscopios que resultará en Microfotografías de tamaño diferentes a pesar de objetivos similares y cambiar el detalle así como el número de células en cada marco. Por ejemplo, adquisición de imágenes con objetivo 40 X sobre una Leica SPII resultados en dos veces el número de células y menos detalle de adquisición con un Zeiss 880. Esto es particularmente importante para la célula ramificación datos recopilados de toda la trama en lugar de una sola célula, como esto se convierte en un problema de muestreo de datos.
En general, Análisis esquelético que utiliza la microfotografía todo precede el análisis fractal de célula única por dos razones. Ramificación de célula determinante de todas las células en una microfotografía es rápida en comparación con el análisis de fractal de la célula y puede ser considerado como una herramienta de detección si el tiempo es un factor. Además, las imágenes binarias derivadas durante el análisis del esqueleto se utilizan para el análisis fractal. Una vez reflejado, hay una serie de pasos críticos que pueden influir en los resultados del análisis del esqueleto e introducir usuario influencia. Los pasos de protocolo que son más variables entre los usuarios son paso 4.2 (cada vez mayor brillo de la imagen) y paso 4.5 (determinar el umbral). Siempre que sea posible, un número óptimo para aumentar el brillo (max o min deslizante entre 0-255) determina y llevó a cabo constante para todas las imágenes y los usuarios. Donde la variabilidad de la imagen es grande, el usuario puede elegir en su lugar un brillo que variará entre imágenes. Alternativamente, si las imágenes son brillantes y el contraste es alto, entonces aumentando brillo puede omitirse y umbral puede estandarizarse usando un filtro de umbral de especialidad (por ej., Huang) en lugar de la predeterminada más variable. Una vez optimizado, los parámetros deben seguirse para reducir al mínimo la influencia de usuario adicional.
Un ejemplo de la variabilidad de usuario se presenta en la figura 5. Fueron aumentados los valores de datos de usuario 1 y usuario 2 y por lo tanto se incrementaría la variabilidad si usuario 1 y usuario 2 contribuyeron a la recolección de datos. Un ejemplo de las diferencias en el usuario 1 y usuario 2 imágenes binarias y esqueletizadas destacan por círculos de colores (figura 5). En este caso, ambos usuarios fueron brevemente capacitados estudiantes con experiencia limitada en la microglia. Regular supervisión y tutoría de un experto junto con protocolo mayor formación2 microglia pueden reducir la variabilidad inter-usuario. Aunque no evaluado aquí, análisis fractal es menos sujeto a variabilidad inter-usuario porque las células binarias son manualmente e individualmente aisladas de una fotomicrografía, en lugar de confiar únicamente en el umbral para determinar formas de microglia. Sin embargo, todos los métodos poseen cierta variabilidad entre los usuarios. Por lo tanto, un único usuario (idealmente, entrenado por algo de experiencia en las células de la microglia) deben completar la recolección de datos para un conjunto de datos completo.
Modificaciones adicionales pueden hacer fácilmente en el presente Protocolo y dependerán de la calidad de imagen y los esfuerzos realizados para reducir el ruido y asegurar conectividad de proceso. Por ejemplo, si el contraste es adecuado, máscara de desenfoque no es necesaria y puede omitirse. Es prudente optimizar y completar el protocolo para un conjunto específico de imágenes, casos experimentales y controles, antes de recoger datos de un conjunto. Por último, plugins adicionales puede utilizarse en lugar de otros para aclarar y enfocar imágenes que no fueron descritos en el presente Protocolo como dilatar o afilar.
Ventajas de este protocolo son la disponibilidad universal y su adaptabilidad. Además, evaluar la ramificación de la célula usando AnalyzeSkeleton es rápido y aplicable a una microfotografía todo. Una ventaja del enfoque de análisis múltiples de la célula es el foco de toda una región en lugar de las células. Por lo tanto, es posible evaluar rápidamente la ramificación promedio (en términos de puntos finales y la duración de proceso) de microglia todos dentro de la imagen. Análisis esquelético proporciona un análisis de varias celdas: una muestra de datos en términos de números de celular que no pueden ser igualadas por el análisis fractal debido a la inversión de tiempo necesario para aislar las células de las fotomicrografías. Una instancia donde esto podría ser más adecuado sería en investigación de morfologías de microglia en cercanías a una lesión focal. Una limitación es la representación de la imagen de todo campo para crear modelos de esqueleto de microfotografías de IHC es imperfecta en comparación con el enfoque de unicelular más desperdiciador de tiempo. Además, un análisis de la región no es adecuado a las circunstancias donde microglia morfologías muy distintas dentro del mismo campo. Por último, este método de análisis depende de recuento de células, un parámetro que puede diferir entre las condiciones experimentales.
Análisis fractal se lleva a cabo en una sola célula y por lo tanto complementa la salida de datos de ramificación promedio células resultantes del análisis del esqueleto. Aunque mucho más tiempo, esta inversión produce una amplia gama de datos morfométricos. De la célula por ejemplo, densidad, proporción de palmo, y datos de circularidad, describen el tamaño, alargamiento y la forma del contorno de la célula, respectivamente. Lagunaridad y dimensión fractal Resumen la complejidad de la célula y la heterogeneidad de la forma, respectivamente. En el manual interactivo16 se ofrece un resumen más detallado de cómo cada parámetro se calcula y cómo se pueden interpretar datos y tal detalle debe ser considerado en relación a la pregunta de investigación específica. Los resultados del protocolo descrito en herramientas sensibles para cuantificar pequeños cambios en la morfología de microglia 2D que puede ocurrir en condiciones fisiológicas y patológicas. Análisis morfométrico adicionales tales como solidez, convexidad y factor de forma16,20 pueden ser posible si generar formas 3D.
Adaptación y desarrollo del protocolo es continua y orientados al usuario. Se ha ampliado de fluorescencia8 DAB/brillante-campo imágenes7 sino no tejido embebido en parafina. Además, puede ser utilizado en conjunción con software propietario como Imaris para análisis adicional. Este protocolo se puede aplicar a una variedad de la fisiología y no se limita a la microglía pero puede aplicarse a cualquier célula o tejido con patrones particulares o formas que se pueden identificar mediante métodos IHC. Por último, con suficiente tamaño de muestra, un análisis multivariante o cluster se puede aplicar para estratificar microglia según morfología12,21; Esto es información significativa como morfología de la microglia es un indicador vital de las funciones de la microglia y las respuestas a su entorno. El aprecio por la diversidad morfológica de microglial es importante comprender las interacciones neurona-glia-vascular durante la salud y la enfermedad y en expansión. Crecimiento en este campo se enriquece con protocolos bien desarrollados, fácil de usar y reproducibles para cuantificar y resumir microglia morfología utilizando múltiples variables continuas.

Microglia tienen una respuesta inmediata y diversidad morfológica a las alteraciones en la fisiología de cerebro1 a lo largo de un continuum de posibilidades que van desde morfologías hyper ramificación y muy complejas a la ramificada y ameboides morfologías2 . Microglía también puede llegar a ser polarizado y barra-formado3. Ramificación de células de microglía se define comúnmente como una forma compleja con múltiples procesos y se divulga a menudo como el número de puntos finales por la célula y la duración de los procesos de la célula. Puesto que la microglia finalmente se ajustan a la función neuronal y glial a célula continua Charla cruzada y en vivo la motilidad4,5, morfologías de microglia pueden servir como indicadores de diversas funciones y disfunciones en el cerebro. Un enfoque cuantitativo es necesario para describir adecuadamente la diversidad de estos cambios morfológicos y distinguir las diferencias entre las células ramificadas que se producen con sutiles perturbaciones fisiológicas (como la epilepsia5,6 y conmoción cerebral7) además de lesión grave (como movimiento8). Un mayor uso de morfología cuantificación7,8,9,10,11,12,13,14 revelará la completa diversidad de morfologías de microglia en salud y enfermedad. El presente estudio los datos del progresivo uso de plugins ImageJ es necesario resumir la morfología de la microglía de fluorescentes o fluorescentes no Microfotografías de microglia adquirió en tejido fijo de roedor después de inmunohistoquímica (IHQ).
Central a las técnicas de análisis aquí descritas son el ImageJ plugins AnalyzeSkeleton (2D/3D)15, desarrollado en 2010 para cuantificar grandes estructuras mamarias y FracLac16, desarrollado en 2014 para integrar análisis ImageJ y fractal cuantificar formas individuales de la microglia. Estos plugins proporcionan un análisis rápido de ramificación de la microglia en Microfotografías de todos o microglia múltiples de un ROI definido dentro de una microfotografía. Este análisis puede utilizarse sola o en complemento con el análisis fractal. El análisis fractal de unicelular (FracLac) requiere una inversión de tiempo pero proporciona múltiples salidas de morfología con respecto a la complejidad de microglia, tamaño y forma. El uso de ambas herramientas no es redundante, como célula de ramificación es complementaria a la complejidad de la célula y la combinación de varios parámetros puede utilizarse para distinguir entre microglia diversas morfologías dentro de conjuntos de datos12,17.

<table><tbody><tr><td>anticuerpo primario anti-IBA1</td><td>Wako&nbsp;</td><td>019-19741</td><td>huésped conejo</td></tr><tr><td>Vectashield montaje blando</td><td>Vector Labs</td><td>H-1000</td><td></td></tr><tr><td>Anticuerpo secundario</td><td>Jackson ImmunorResearch</td><td>711-545-152</td><td>huésped burro</td></tr><tr><td>vial de vidrio de 4 mL</td><td>Wheaton UX-08923-11</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Fisher Scientific&nbsp;</td><td>BP151</td><td></td></tr><tr><td>Azida de sodio (NaN3)</td><td>Sigma</td><td>S-8032</td><td></td></tr><tr><td>cubreobjetos de vidrio</td><td>Fisher Scientific&nbsp;</td><td>12-544-G</td><td></td></tr></tbody></table>

cuantificar la morfología de la microglía de microfotografías de la inmunohistoquímica preparado tejido con imagej

Quantifying Microglia Morphology from Photomicrographs of Immunohistochemistry Prepared Tissue Using ImageJ

Microglia son fagocitos del cerebro que participan en la homeostasis cerebral y examinar continuamente su entorno por la disfunción, lesiones y enfermedad. Como los primeros respondientes, microglia tienen funciones importantes para atenuar la disfunción de la neurona y glia, y en este proceso, se someten a una amplia gama de cambios morfológicos. Morfologías de la microglia pueden clasificarse descriptivamente o, alternativamente, se pueden cuantificar como una variable continua para parámetros tales como ramificación de la célula, la complejidad y la forma. Mientras que los métodos para cuantificar la microglia se aplican a las células, algunas técnicas se aplican a múltiples microglia en una microfotografía todo. El propósito de este método es cuantificar múltiples y las células disponibles protocolos de ImageJ. Este protocolo es un resumen de los pasos y plugins ImageJ recomendadas convertir Microfotografías de campo claro y fluorescencia en imágenes representativas binarias y esqueletizadas y analizarlos utilizando plugins de software AnalyzeSkeleton (2D/3D) y FracLac para la recolección de datos de morfología. Morfología de la célula en términos de puntos finales del proceso, ensambladuras y longitud, así como complejidad, forma celular, descriptores de tamaño un resumen de las salidas de estos plugins. El protocolo de Análisis esquelético descrito es idóneo para un análisis regional de microglia múltiples dentro de un todo microfotografía o región de interés (ROI), mientras que FracLac proporciona un análisis de células individuales complementarios. Combinado, el protocolo proporciona un objetivo, la herramienta de evaluación sensible y completa que puede utilizarse para estratificar entre microglia diversas morfologías presentes en el cerebro sano y lesionado.

Los protocolos de análisis de morfología microglia descritos Resumen pasos útiles en el procesamiento de fluorescentes y Microfotografías de DAB para el análisis morfométrico. Estos pasos se resumen visualmente en la figura 2 y figura 3. El objetivo de estos pasos es crear una imagen representativa de binario y esqueleto que modela adecuadamente la microfotografía original tal que los datos acumulados son válidos. Después de la aplicación del Protocolo, el plugin de AnalyzeSkeleton resulta en una imagen esqueleto etiquetado de que el número de puntos finales y rama (es decir., proceso) resumir lengthcan de archivos de salida resultantes. Extremos y datos de longitud de proceso entonces se utilizan para estimar el grado de ramificación de la microglia en la microfotografía o ROI. Figura 4 se resumen los datos resultantes (extremos de la célula y el proceso largo/célula) recolectados con y sin la aplicación del protocolo. Mientras que existen tendencias similares, la información resumida en la figura 4F es menos variables que en figura 4E. Además, estos datos ilustran el aumento de la sensibilidad para detectar diferencias entre grupos cuando se aplica el protocolo. Por último, debe tenerse cuidado con respecto a la variabilidad inter-usuario en la aplicación del protocolo. Estas diferencias se resumen por figura 5 donde el mismo conjunto de datos fue analizado por dos usuarios independientes aplicando un protocolo idéntico como resumido arriba.
Se recogen datos adicionales de la morfología de las células aisladas de las imágenes binarias creadas durante la aplicación del protocolo. Los pasos del protocolo para analizar la morfología de la microglia antes y usando el plugin de FracLac se resumen en la figura 6. Ilustramos este análisis en ambas lesionadas (figura 6A) y lesiones del tejido (Figura 6B). Imágenes representativas de binario, contorneado, convex hull/encapsulado círculo y ejemplos de cuenta de caja para cada célula analizada con y sin el protocolo de aplicación se muestran en la figura 6–F. Estas imágenes ayudan a ilustrar los orígenes de las diferencias en datos de morfología que se resumen en la figura 6.
<img alt="Diagrama de trazado neuronal; soma circular vs. de origen único; superposición fluorescente; mapeo de redes neuronales." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57648/57648fig1.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 1"> Figura 1. Ilustraciones de microglia esqueletizado con un soma circular (subóptimo) versus un soma de origen (óptimo) y la correspondiente superposición entre el esqueleto de la célula y la microfotografía original. Barra de escala = 10 μm. <a href="/files/ftp_upload/57648/57648fig1large.jpg" target="_blank">haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Pasos de procesamiento de imágenes: microscopía original a esqueleto etiquetado, incluyendo escala de grises, eliminación de manchas, binario." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57648/57648fig2.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 2"> Figura 2. Protocolo aplicación fluorescentes fotomicrografías. Ilustraciones del esqueleto análisis protocolo aplicado a una microfotografía fluorescente con una sola célula recortada para mostrar detalles. Barra de escala = 10 μm. <a href="/files/ftp_upload/57648/57648fig2large.jpg" target="_blank">haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Secuencia de procesamiento de imágenes para análisis de estructuras neuronales; Filtro FFT; escala de grises; diagrama de esqueleto." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57648/57648fig3.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 3"> Figura 3. Aplicación de protocolo para campo brillante DAB fotomicrografías. Ilustraciones del Protocolo de análisis del esqueleto que una microfotografía DAB de campo claro se aplica con una sola célula recortada para mostrar detalles. Barra de escala = 10 μm. <a href="/files/ftp_upload/57648/57648fig3large.jpg" target="_blank">haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Análisis de procesos neuronales; imágenes de microscopía, comparación de protocolos, gráfico que muestra puntos finales / célula." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57648/57648fig4.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 4"> Figura 4. Análisis de datos con y sin la aplicación del protocolo. (A) una microfotografía de ejemplo de IHC fluorescente y célula cultivada correspondiente a la caja de amarillo (B). Imágenes binarias y esqueleto de ejemplo con (C) y sin (D) del Protocolo de aplicación como se describe. Datos de Resumen de microglia extremos de la célula y el proceso largo/celda de ileso (blanco) y lesiona el tejido cortical (gris) con (E) y sin (F) el protocolo aplicado. Análisis estadístico mediante la prueba t de student y n = 3, ** denota p &lt; 0.01. Barra de escala = 10 μm. <a href="/files/ftp_upload/57648/57648fig4large.jpg" target="_blank">haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Análisis de morfología neuronal; procesamiento de imágenes y gráficos de datos; binario, diagramas esqueléticos, resultados estadísticos." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57648/57648fig5.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 5"> Figura 5. Diferencias de usuario con la aplicación del protocolo. Un ejemplo de una conversión de imagen y protocolo original a imágenes binarias y esqueletos por usuario 1 y usuario 2. Diferencias entre las dos imágenes se resaltan con círculos de colores a juego. Gráficos Resumen de microglia extremos de la célula y proceso de datos de la longitud celular en regiones del cerebro lesionadas y lesionados por usuario 1 y usuario 2. Análisis estadístico con ANOVA y muestra el tamaño es n = 3; p &lt; 0.05, **p &lt; 0.01, ***p &lt; 0.001. Barra de escala = 10 μm. <a href="/files/ftp_upload/57648/57648fig5large.jpg" target="_blank">haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Análisis de lesión neuronal con comparación morfológica; efecto de aplicación del protocolo sobre la microglía." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57648/57648fig6.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 6"> Figura 6. Análisis fractal con y sin la aplicación del protocolo. Ejemplo de fotomicrografías recortadas de microglía en el ileso (A) y herido (B) la corteza con binario correspondiente (C) e imágenes de esquema (D) que resultan con y sin el protocolo aplicado. El casco convexo asociado (azul) y que encierra círculo (rosa) para las formas de contorno correspondiente (E) se utilizan para calcular la densidad de forma, proporción y circularidad (G) del palmo. La caja cuenta método es ilustrada en (F) y utilizada para cálculos de lagunaridad (λ) (G) y dimensión fractal (DB). Barra de escala = 10 μm. <a href="/files/ftp_upload/57648/57648fig6large.jpg" target="_blank">haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>

Microglía son células inmunes del cerebro que encuesta y reaccionan a la fisiología alterada del cerebro a través de cambios morfológicos que pueden evaluarse cuantitativamente. Este protocolo describe un ImageJ basado en protocolos de análisis para representar la morfología de la microglia como datos continuos según métricas tales como ramificación de la célula, la complejidad y la forma.

Cuantificar la morfología de la microglía de microfotografías de la inmunohistoquímica preparado tejido con ImageJ

Microglia are brain phagocytes that participate in brain homeostasis and continuously survey their environment for dysfunction, injury, and disease. As ...

El objetivo general de estos métodos de análisis de esqueletos y fractales es medir la morfología de la microglía a partir de tejido preparado con IHC, utilizando métodos cuantitativos que son de alto rendimiento por naturaleza y sensibles para detectar pequeñas diferencias en las formas de las células. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo neuroinflamatorio, definiendo los matices de la forma y función de la microglía durante la salud y la enfermedad. La principal ventaja de esta técnica es que cuantifica la morfología de la microglía utilizando variables continuas en lugar de categóricas.Los métodos descritos aquí no requieren software propietario, y se pueden utilizar para el cribado de regiones cerebrales o un análisis célula por célula. La demostración del procedimiento estará a cargo de Kimberly Young, una técnica de mi laboratorio. Antes de comenzar, asegúrese de que el complemento AnalayzeSkeleton se haya descargado en ImageJ o Fiji.A continuación, abra una pila Z de 30 micras que muestra el cerebro inmunoteñido con Iba1. Si utiliza una fotomicrografía de fluorescencia, asegúrese de que la imagen sea de 8 bits y conviértala a escala de grises para visualizar mejor todas las tinciones positivas. Utilice la barra de herramientas y haga clic en Imagen, Tablas de búsqueda, Grises.Si utilizas una fotografía de campo claro DAB, utiliza primero el plugin de filtro FFT Bandpass con la configuración predeterminada. Haga clic en Procesar, FFT, Filtro de paso de banda y, a continuación, convertir a escala de grises. Si la imagen es demasiado tenue para visualizar el proceso de la microglía, utilice la barra de herramientas y haga clic en Imagen, Ajustar, Brillo/Contraste.Ajuste los controles deslizantes mínimo o máximo según sea necesario, hasta los bordes del histograma, pero no más allá. El ajuste del brillo produce la mayor variabilidad en el análisis de datos y, por lo tanto, es el paso más crítico. A continuación, ejecute un filtro de máscara de enfoque para aumentar aún más el contraste, haciendo clic en Proceso, Filtros, Máscara de enfoque.Realice un paso de eliminación de manchas para eliminar el ruido de sal y pimienta generado por la máscara de enfoque. Utilice la barra de herramientas y haga clic en Proceso, Ruido, Eliminar manchas. Convierta la imagen a binaria seleccionando Imagen, Ajustar, Umbral.A continuación, aplique la función Despeckle a la imagen binaria para eliminar cualquier ruido restante de un solo píxel. A continuación, aplique la función Cerrar haciendo clic en Proceso, Binario, Cerrar, para conectar píxeles oscuros separados por un máximo de dos píxeles. A continuación, elimine los valores atípicos haciendo clic en Procesar, Ruido, Eliminar valores atípicos.Después de guardar la imagen como un archivo independiente para su uso futuro, esqueletice la imagen con la barra de herramientas haciendo clic en Procesar, Binario, Esqueletizar. Seleccione la imagen esqueletizada y ejecute el complemento AnalyzeSkeleton haciendo clic en Plugins, Skeleton, Analyze Skeleton y marcando la casilla de información de la rama. Copie los datos de las salidas de información de resultados y ramas, y pegue los datos en una hoja de cálculo de Excel.En Excel, recorte los datos para eliminar los fragmentos de esqueleto que resultan de la IHC y la adquisición de imágenes. Determine qué longitud de fragmentos se recortarán del dataset abriendo la imagen esqueletizada en ImageJ y seleccionando la herramienta Línea. Mida varios fragmentos, tomando nota de la longitud media, y decida un valor de corte, que debe ser coherente en todo el conjunto de datos.Ordene de forma personalizada la hoja de cálculo de Excel haciendo clic en Ordenar y filtrar, Ordenación personalizada. Ordene por vóxeles de punto final de mayor a menor y, en un nuevo nivel, por rama Mx PT de mayor a menor. Quite todas las filas que contengan dos extremos con una longitud máxima de bifurcación inferior al valor de corte.Sume los datos de la columna de puntos de conexión para calcular el número total de puntos de conexión recopilados de la imagen. Repita el procedimiento para los datos de información de rama después de ordenar por longitud de rama. Una vez que se hayan recortado y sumado todos los datos, divida los datos de cada imagen por el número de somas de microglía en la imagen correspondiente.Introduzca el punto final y la longitud de celda y rama por celda en los datos del software estadístico. Asegúrese de que se haya descargado el complemento FracLac. A continuación, utiliza la herramienta de rectángulo para dibujar el ROI.Asegúrese de que la caja sea lo suficientemente grande como para capturar toda la celda y que pueda ser coherente en todo el conjunto de datos. En la ventana Administrador de ROI, seleccione Actualizar para bloquear el ROI en una celda seleccionada aleatoriamente en la fotomicrografía. Abra la imagen binaria que contiene la celda seleccionada.Haga doble clic en la herramienta Pincel, establezca el color en negro y ajuste el ancho del pincel según sea necesario. Utilizando la fotomicrografía coincidente como referencia, utilice el pincel para eliminar los procesos celulares adyacentes, conectar procesos fragmentados y aislar la celda de interés. Una vez que se haya aislado la celda binaria, guarde el archivo binario.Convierta la celda binaria en un contorno usando la barra de herramientas, a través de Proceso, Binario, Contorno. En la barra de herramientas, abra FracLac usando la barra de herramientas, haciendo clic en Plugins, Fractal Analysis, FracLac y seleccione BC para el conteo de casillas. En Diseño de cuadrícula, establezca Num G en cuatro.En Opciones de gráficos, marque la casilla de métricas para analizar la envoltura convexa y el círculo delimitador de la celda. Cuando termine, seleccione Aceptar y, a continuación, seleccione el botón Escanear para ejecutar un escaneo de conteo de cuadros en la imagen seleccionada. En la ventana Resultados de casco y círculo, copie todos los resultados de datos que desee.A continuación, haga lo mismo en la ventana Resumen de recuento de cajas. Transfiera los datos copiados a un archivo de Excel o a un software estadístico. Este gráfico muestra datos resumidos de los criterios de valoración de la microglía por célula y la longitud procesada por célula en tejido cortical lesionado y no lesionado.Este es el resultado del análisis con el protocolo aplicado. En ambos casos se realizó un análisis estadístico mediante la Prueba T de Student y se analizaron tres imágenes. Se debe tener cuidado con la variabilidad entre usuarios en la aplicación del protocolo.Tales diferencias se resumen aquí, donde el mismo conjunto de datos fue analizado por dos usuarios independientes que aplicaron un protocolo idéntico. Aunque las tendencias son similares en todas partes, la variabilidad entre usuarios afecta a la importancia de los datos. Al intentar este procedimiento, es importante recordar que el objetivo es obtener un esqueleto o modelo de contorno que sea representativo de la fotomicrografía original.Esto significa que los pasos pueden ser modificables a las necesidades específicas del investigador. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo cuantificar rápidamente la morfología de la microglía a partir de fotomicrografías de tejido inmunohistoquímico utilizando software informático fácilmente disponible.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Neuroscience

Neurociencia

Fuente: Etienne, F. et al. Imágenes de dos fotones de la atracción de los procesos microgliales hacia el ATP o la serotonina en cortes agudos de cerebro. J. Vis. Exp. (2019)Este video demuestra el uso de la microscopía de dos fotones para estudiar la atracción de los procesos microgliales hacia un compuesto inyectado en cortes de cerebro. Proporciona una descripción general de la preparación de cortes de cerebro de ratón, la inyección de un compuesto de prueba quimioatrayente y la obtención de...

Microscopía de dos fotones para estudiar la atracción del proceso microglial hacia un compuesto en un corte de cerebro de ratón

Se presenta una forma de obtener nuevos conocimientos sobre la complejidad de la respuesta inflamatoria cerebral. Describimos protocolos basados en inmunofluorescencia seguidos de análisis confocal tridimensional para investigar el patrón de coexpresión de marcadores fenotípicos de microglía/macrófagos en un modelo murino de isquemia focal.

Análisis confocal tridimensional de marcadores microglía / macrófagos de polarización en Experimental Brain Injury

La microglía son las células inmunes residentes del sistema nervioso central (SNC) con una alta capacidad de fagocitar o material de envolver en su entorno extracelular. Aquí, se describe un ensayo ampliamente aplicable, fiable, y altamente cuantitativo para visualizar y medir la microglia mediada por inmersión de componentes sinápticas.

Un ensayo de Inmersión en: Un Protocolo para Evaluar Interacciones entre CNS fagocitos y neuronas

La activación de la microglia y microgliosis son respuestas clave a la neurodegeneración crónica. A continuación, presentamos los métodos para in vivo, visualización a largo plazo de la retina células microgliales CX3CR1-GFP + por oftalmoscopía confocal y de umbral y los análisis morfométricos para identificar y cuantificar su activación. Hacemos un seguimiento de los cambios microgliales durante las primeras etapas del glaucoma relacionada con la edad.

En Vivo Dinámica de Retina Microglial Activación Durante Neurodegeneración: Confocal oftalmoscópico Imaging y Morfometría celular en el ratón Glaucoma

Se crearon dos algoritmos de análisis de imagen, "Drosophila NMJ morfometría" y "Drosophila NMJ Bouton morfometría", para cuantificar automáticamente nueve características morfológicas de la unión neuromuscular Drosophila (NMJ).

Dos algoritmos para de alto rendimiento y multi-paramétrico Cuantificación de<em&gt; Drosophila</em&gt; La unión neuromuscular Morfología

Este protocolo fue desarrollado para identificar cuantitativamente los componentes del microambiente tumoral en resecciones de pacientes con glioblastoma usando inmunohistoquímica cromogénica e ImageJ.

Inmunohistoquímica Cuantitativa del Microambiente Celular en Resecciones de Glioblastoma Paciente

Este protocolo describe un flujo de trabajo paso a paso para la costaría inmunofluorescente de IBA1 y TMEM119, además del análisis de la densidad microglial, la distribución y la morfología, así como la infiltración de células mieloides periféricas en el tejido cerebral del ratón.

Tinción de inmunofluorescencia utilizando IBA1 y TMEM119 para la densidad microglial, morfología y análisis de infiltración de células mieloides periféricas en el cerebro del ratón

Presentamos un método, que utiliza un enfoque de análisis de imágenes basado en áreas generalizables para identificar los recuentos de células. El análisis de diferentes poblaciones celulares explotó las diferencias significativas de altura y estructura celular entre los distintos tipos de células dentro de un algoritmo adaptativo.

Algoritmo de análisis de imágenes basado en áreas para la cuantificación de cocultivos de macrófagos y fibroblastos

Este protocolo describe el proceso de diferenciación de células madre pluripotentes inducidas por humanos (iPSC) en células similares a la microglía para la experimentación in vitro . También incluimos un procedimiento detallado para generar sinaptosomas humanos a partir de neuronas motoras inferiores derivadas de iPSC que se pueden usar como sustrato para ensayos de fagocitosis in vitro utilizando sistemas de imágenes de células vivas.

Human Microglia-like Cells: Differentiation from Induced Pluripotent Stem Cells and In Vitro Live-cell Phagocytosis Assay using Human Synaptosomes

El parto prematuro (parto &lt; 37 semanas) es un problema de salud mundial urgente con opciones de prevención y tratamiento subóptimas. Presentamos un modelo de ratón de parto prematuro inducido por infección bacteriana vaginal ascendente y describimos cómo analizar la morbilidad y mortalidad neonatal resultante.

Modelado de infección vaginal ascendente, parto prematuro y morbilidad neonatal en ratones

El Software de Parámetros Microgliales de Mapeo (MMPS) es una cadena de análisis fácil de usar que no requiere conocimientos de codificación y que semiautomatiza el análisis de morfología microglial de células individuales a partir de imágenes de inmunofluorescencia. Validado en un modelo de neuroinflamación inducido por lipopolisacáridos en roedores, MMPS detecta de forma reproducible los cambios morfológicos asociados a la activación y permite un fenotipado microglial estandarizado y...

Software de Mapeo de Parámetros Microgliales (MMPS): Una herramienta de código abierto y fácil de usar para el análisis cuantitativo de la morfología de la microglía

Aprende a cuantificar la morfología de la microglía en tejido cerebral con ImageJ mediante análisis de esqueletización y fractales. Este protocolo de alto rendimiento permite estudiar neuroinflamación sin software propietario.

Cuantificar la morfología de la microglía de microfotografías de la inmunohistoquímica preparado tejido con ImageJ

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