Cuantificar la morfología de la microglía de microfotografías de la inmunohistoquímica preparado tejido con ImageJ

El objetivo general de estos métodos de análisis de esqueletos y fractales es medir la morfología de la microglía a partir de tejido preparado con IHC, utilizando métodos cuantitativos que son de alto rendimiento por naturaleza y sensibles para detectar pequeñas diferencias en las formas de las células. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo neuroinflamatorio, definiendo los matices de la forma y función de la microglía durante la salud y la enfermedad. La principal ventaja de esta técnica es que cuantifica la morfología de la microglía utilizando variables continuas en lugar de categóricas.

Los métodos descritos aquí no requieren software propietario, y se pueden utilizar para el cribado de regiones cerebrales o un análisis célula por célula. La demostración del procedimiento estará a cargo de Kimberly Young, una técnica de mi laboratorio. Antes de comenzar, asegúrese de que el complemento AnalayzeSkeleton se haya descargado en ImageJ o Fiji.

A continuación, abra una pila Z de 30 micras que muestra el cerebro inmunoteñido con Iba1. Si utiliza una fotomicrografía de fluorescencia, asegúrese de que la imagen sea de 8 bits y conviértala a escala de grises para visualizar mejor todas las tinciones positivas. Utilice la barra de herramientas y haga clic en Imagen, Tablas de búsqueda, Grises.

Si utilizas una fotografía de campo claro DAB, utiliza primero el plugin de filtro FFT Bandpass con la configuración predeterminada. Haga clic en Procesar, FFT, Filtro de paso de banda y, a continuación, convertir a escala de grises. Si la imagen es demasiado tenue para visualizar el proceso de la microglía, utilice la barra de herramientas y haga clic en Imagen, Ajustar, Brillo/Contraste.

Ajuste los controles deslizantes mínimo o máximo según sea necesario, hasta los bordes del histograma, pero no más allá. El ajuste del brillo produce la mayor variabilidad en el análisis de datos y, por lo tanto, es el paso más crítico. A continuación, ejecute un filtro de máscara de enfoque para aumentar aún más el contraste, haciendo clic en Proceso, Filtros, Máscara de enfoque.

Realice un paso de eliminación de manchas para eliminar el ruido de sal y pimienta generado por la máscara de enfoque. Utilice la barra de herramientas y haga clic en Proceso, Ruido, Eliminar manchas. Convierta la imagen a binaria seleccionando Imagen, Ajustar, Umbral.

A continuación, aplique la función Despeckle a la imagen binaria para eliminar cualquier ruido restante de un solo píxel. A continuación, aplique la función Cerrar haciendo clic en Proceso, Binario, Cerrar, para conectar píxeles oscuros separados por un máximo de dos píxeles. A continuación, elimine los valores atípicos haciendo clic en Procesar, Ruido, Eliminar valores atípicos.

Después de guardar la imagen como un archivo independiente para su uso futuro, esqueletice la imagen con la barra de herramientas haciendo clic en Procesar, Binario, Esqueletizar. Seleccione la imagen esqueletizada y ejecute el complemento AnalyzeSkeleton haciendo clic en Plugins, Skeleton, Analyze Skeleton y marcando la casilla de información de la rama. Copie los datos de las salidas de información de resultados y ramas, y pegue los datos en una hoja de cálculo de Excel.

En Excel, recorte los datos para eliminar los fragmentos de esqueleto que resultan de la IHC y la adquisición de imágenes. Determine qué longitud de fragmentos se recortarán del dataset abriendo la imagen esqueletizada en ImageJ y seleccionando la herramienta Línea. Mida varios fragmentos, tomando nota de la longitud media, y decida un valor de corte, que debe ser coherente en todo el conjunto de datos.

Ordene de forma personalizada la hoja de cálculo de Excel haciendo clic en Ordenar y filtrar, Ordenación personalizada. Ordene por vóxeles de punto final de mayor a menor y, en un nuevo nivel, por rama Mx PT de mayor a menor. Quite todas las filas que contengan dos extremos con una longitud máxima de bifurcación inferior al valor de corte.

Sume los datos de la columna de puntos de conexión para calcular el número total de puntos de conexión recopilados de la imagen. Repita el procedimiento para los datos de información de rama después de ordenar por longitud de rama. Una vez que se hayan recortado y sumado todos los datos, divida los datos de cada imagen por el número de somas de microglía en la imagen correspondiente.

Introduzca el punto final y la longitud de celda y rama por celda en los datos del software estadístico. Asegúrese de que se haya descargado el complemento FracLac. A continuación, utiliza la herramienta de rectángulo para dibujar el ROI.

Asegúrese de que la caja sea lo suficientemente grande como para capturar toda la celda y que pueda ser coherente en todo el conjunto de datos. En la ventana Administrador de ROI, seleccione Actualizar para bloquear el ROI en una celda seleccionada aleatoriamente en la fotomicrografía. Abra la imagen binaria que contiene la celda seleccionada.

Haga doble clic en la herramienta Pincel, establezca el color en negro y ajuste el ancho del pincel según sea necesario. Utilizando la fotomicrografía coincidente como referencia, utilice el pincel para eliminar los procesos celulares adyacentes, conectar procesos fragmentados y aislar la celda de interés. Una vez que se haya aislado la celda binaria, guarde el archivo binario.

Convierta la celda binaria en un contorno usando la barra de herramientas, a través de Proceso, Binario, Contorno. En la barra de herramientas, abra FracLac usando la barra de herramientas, haciendo clic en Plugins, Fractal Analysis, FracLac y seleccione BC para el conteo de casillas. En Diseño de cuadrícula, establezca Num G en cuatro.

En Opciones de gráficos, marque la casilla de métricas para analizar la envoltura convexa y el círculo delimitador de la celda. Cuando termine, seleccione Aceptar y, a continuación, seleccione el botón Escanear para ejecutar un escaneo de conteo de cuadros en la imagen seleccionada. En la ventana Resultados de casco y círculo, copie todos los resultados de datos que desee.

A continuación, haga lo mismo en la ventana Resumen de recuento de cajas. Transfiera los datos copiados a un archivo de Excel o a un software estadístico. Este gráfico muestra datos resumidos de los criterios de valoración de la microglía por célula y la longitud procesada por célula en tejido cortical lesionado y no lesionado.

Este es el resultado del análisis con el protocolo aplicado. En ambos casos se realizó un análisis estadístico mediante la Prueba T de Student y se analizaron tres imágenes. Se debe tener cuidado con la variabilidad entre usuarios en la aplicación del protocolo.

Tales diferencias se resumen aquí, donde el mismo conjunto de datos fue analizado por dos usuarios independientes que aplicaron un protocolo idéntico. Aunque las tendencias son similares en todas partes, la variabilidad entre usuarios afecta a la importancia de los datos. Al intentar este procedimiento, es importante recordar que el objetivo es obtener un esqueleto o modelo de contorno que sea representativo de la fotomicrografía original.

Esto significa que los pasos pueden ser modificables a las necesidades específicas del investigador. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo cuantificar rápidamente la morfología de la microglía a partir de fotomicrografías de tejido inmunohistoquímico utilizando software informático fácilmente disponible.