Caracterización de procesos de reparación del ADN en transitoria y duradera doble cadena DNA roturas por microscopia de la inmunofluorescencia

Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la reparación del ADN, como la forma en que se regulan la formación, localización y resolución del complejo de reparación del ADN. La principal ventaja de esta técnica es que puede detectar cambios de forma inequívoca y reparar la localización y la cinética complejas. Además de estos investigadores de pregrado en mi laboratorio, tres estudiantes de posgrado realizarán los experimentos.

Serán Changkun Hu, Dalton Dacus y Stephen Walterhouse. Para empezar, cultive células U2OS/DR-GFP en una placa de cultivo de tejidos de 10 centímetros hasta que tengan un 85 a un 90% de confluentes. Luego retire el medio, agregue tres mililitros de EDTA e incube las células a temperatura ambiente durante tres minutos.

Reemplace el EDTA con un mililitro de tripsina e incube las células a 37 grados centígrados durante cinco minutos. A continuación, añade cinco mililitros de DMEM para neutralizar la tripsina. Después de contar las células, siembre seis veces 10 a la tercera célula por pocillo en 200 microlitros de medio en una placa de 96 pocillos con fondo de vidrio.

Alternativamente, siembre cuatro veces 10 a los seis pocillos en ocho mililitros de medio en cubreobjetos de 12 milímetros colocados en una placa de 10 centímetros, luego cultive las células durante la noche a 37 grados Celsius y 5% de dióxido de carbono. Para inducir roturas de doble hebra, o DSB, reemplace el medio con peróxido de hidrógeno diluido a una concentración de 25 micromolares con DMEM más 10% FBS e incube la placa a 37 grados Celsius durante una hora. Lave las celdas tres veces con 1x PBS, luego agregue DMEM fresco.

Para fijar las celdas después de incubarlas, use PBS para lavar la placa tres veces. A continuación, utilice una aguja y unas pinzas para retirar con cuidado un cubreobjetos de la placa de 10 centímetros para cada punto de tiempo y colóquelo en un solo pocillo de una placa de 24 pocillos. Añadir un 4% de PFA e incubar las células durante 15 minutos.

A continuación, nos PBS para lavar las fundas tres veces. Para permeabilizar las células, agregue detergente no iónico al 0,5% y PBS. Incuba las células a temperatura ambiente durante 15 minutos.

A continuación, vuelva a lavar las células con PBS tres veces. A continuación, añada un 3 % de BSA y un 0,1 % de detergente no iónico diluido en PBS a los cubreobjetos en una placa de 24 pocillos e incube la placa a temperatura ambiente durante una hora. A continuación, añada anticuerpos primarios que se dirijan a la proteína de reparación de interés e incube las muestras a temperatura ambiente durante una hora.

Después de lavar las células con PBS tres veces, agregue DAPI e incube las placas a temperatura ambiente durante cinco minutos. A continuación, incubar las muestras con anticuerpos secundarios. Después de lavar las celdas como antes, use el reactivo de montaje para montar la cubierta con el lado de la celda hacia abajo en los portaobjetos.

Presione con cuidado los cubreobjetos y utilice una toallita para absorber el exceso de reactivo de montaje. Selle los cubreobjetos con esmalte de uñas transparente de secado rápido y asegúrese de un sellado completo del cubreobjetos con el portaobjetos. Tome imágenes de microscopio confocal enfocándose en el canal DAPI.

Para definir los núcleos en imágenes de inmunofluorescencia, abra las imágenes confocales arrastrando el archivo de imagen a la ventana de ImageJ o seleccionando el importador de bioformatos en la barra de herramientas del complemento en ImageJ. A continuación, seleccione dividir canales. En Opciones de color, seleccione coloreado en el menú desplegable.

Seleccione Aceptar para abrir las imágenes DAPI e histona H2AX como ventanas independientes y elija la imagen DAPI. A continuación, seleccione la barra de herramientas de la imagen en la opción ajustar umbral para seleccionar los núcleos. A continuación, ajuste el umbral de la imagen deslizando la barra inferior de la ventana del umbral completamente hacia la derecha.

Ajuste la barra superior hasta que los núcleos aparezcan completamente rojos con contornos distintos y el fondo sea negro. A continuación, seleccione la barra de herramientas de análisis y la opción de análisis de partículas. Introduzca el tamaño mínimo del núcleo.

En el menú desplegable mostrar, seleccione esquemas y luego seleccione la opción agregar al administrador. Haga clic en Aceptar para abrir una ventana del administrador de ROI. Desde la ventana del gestor de ROI asigne números a los núcleos por selección.

Para utilizar ImageJ para cuantificar focos de H2AX e imágenes de microscopía de inmunofluorescencia, seleccione la ventana de focos de H2AX. A continuación, seleccione la barra de herramientas del proceso y elija buscar máximos para encontrar focos dentro de los núcleos. En el menú desplegable del tipo de salida, elija la opción de puntos individuales y seleccione la selección de puntos de vista previa para visualizar los focos máximos.

A continuación, introduzca un valor de tolerancia al ruido en función de la intensidad de la fluorescencia de la imagen. Desde la ventana del administrador de ROI, seleccione los núcleos para los que se deben cuantificar los focos de H2AX. Seleccione medida para medir el número de focos máximos dentro de los núcleos seleccionados.

Copie los valores de intensidad sin procesar y péguelos en el software para el análisis de datos. Después de asentar las células en placas de 96 pocillos con cubreobjetos, como se demostró anteriormente en este vídeo, induzca roturas de doble hebra mediante el uso de un agente transfectionario a base de lípidos para transfectar células con el vector de expresión I-SceI. Para adquirir imaginación después de lavar las células permeabilizadas y bloqueadas como se muestra anteriormente, agregue anticuerpos contra gamma H2AX y la proteína reparadora de interés.

Con 1x PBS, lave tres veces los deslizamientos de la cubierta de la placa de 96 pocillos. A continuación, incube los cubreplatos de la placa de 96 pocillos con anticuerpos secundarios. Finalmente, después de identificar las células que tienen un gran foco nuclear gamma H2AX, se cuentan manualmente aquellas que también muestran colocalización con la proteína de reparación de interés.

Esta figura muestra una discriminación de ruido de 90 y marca el número correcto de focos. Los núcleos en el borde y los focos fuera de los núcleos no se cuentan durante la cuantificación. El panel que se muestra aquí muestra una tolerancia de ruido baja de 50.

Se identifican numerosos máximos fuera del núcleo y dentro del núcleo. En esta célula se encuentra una alta tolerancia al ruido de 220. Solo se detectó un único foco.

En esta figura se representa la colocalización de un foco gamma H2AX y una proteína de reparación de interés. Aquí se muestra una celda sin transfectar, y una celda con foco H2AX gamma no nuclear se muestra en la parte superior derecha. A mayor aumento, se puede distinguir una imagen más clara de un verdadero foco interior y un foco no nuclear o exterior.

Finalmente, aquí se muestra un ejemplo de un foco nuclear gamma H2AX sin colocalización de una proteína de reparación. Una vez dominada, esta técnica se puede realizar en pocos días si se realiza correctamente. Siguiendo este procedimiento, se pueden realizar otros métodos, como la precipitación de comutadores, para identificar las interacciones entre las proteínas de reparación de interés.

Después de ver este video, debe tener una buena comprensión de cómo observar la formación y resolución de complejos de reparación del ADN mediante la inducción de roturas transitorias de doble cadena en el ADN. También aprenderá a distinguir sin ambigüedades la mala localización de los factores de reparación del reclutamiento tardío mediante la inducción de lesiones duraderas.