Caracterización de biopelículas acuáticas con citometría de flujo

Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de las ciencias ambientales, como los impactos de la contaminación química o el cambio climático en los ecosistemas acuáticos. La principal ventaja de esta técnica es que todos los pasos individuales son sencillos y rápidos de realizar. Aunque el objetivo del procedimiento es caracterizar biopelículas autótrofas, también se puede utilizar para caracterizar biopelículas heterótrofas y detectar partículas contaminantes como los microplásticos.

Para comenzar, seleccione un sitio de muestreo acuático donde crezca la biopelícula, que suele ser partes poco profundas de arroyos que tienen un flujo de agua lento a intermedio y lechos de arroyos pedregosos. Si el sitio no tiene suficiente superficie para la fijación de la biopelícula, puede usar sustratos artificiales donde puedan crecer las biopelículas. Mida las condiciones ambientales en el sitio de muestreo utilizando instrumentos portátiles para medir la conductividad, el pH, la temperatura del agua y la intensidad de la luz justo encima de la superficie de la biopelícula que se va a muestrear.

Con guantes protectores, recoja piedras que sean similares en tamaño, forma y tipo de cada sitio. Las piedras deben recogerse de áreas que estén expuestas a condiciones similares de flujo y luz. Además de la recolección de muestras de biopelícula y la medición de las condiciones de crecimiento en el sitio, obtenga muestras de agua para medir los parámetros químicos del agua.

Para procesar las muestras de biopelícula, primero filtre 15 mililitros de agua de arroyo del sitio a través de un filtro de 0,22 micrómetros. A continuación, utilice un cepillo de dientes suave para eliminar la biopelícula del sustrato hasta que quede completamente suspendida en un matraz. Fije las muestras de biopelícula con 0,01% de paraformaldehído y 0,1% de glutaraldehído.

Transfiera submuestras de la biopelícula a un microscopio óptico. Recurra al aumento adecuado para su muestra e identifique las especies presentes en las muestras de biopelícula. Preparar los cultivos para cada especie.

Cultivarlos de forma continua utilizando condiciones ambientales similares al entorno del que se tomaron las muestras de biopelícula. Una vez crecidas, disperse las células sonicándolas durante cinco a 10 segundos a 45 kilohercios. Coloque las células dispersas en una placa de 96 pocillos.

Una vez dispersos, registre los espectros de absorbancia y fluorescencia de cada especie utilizando un lector de placas. A continuación, configure el citómetro de flujo con divisores dicroicos y filtros para cubrir los rangos fluorescentes en los que se encontró que las diferentes especies tenían propiedades específicas. Para preparar una referencia de una sola especie, utilice los parámetros optimizados de citometría de flujo para medir las propiedades ópticas y fluorescentes de una sola especie.

A continuación, prepare las células dañadas y en descomposición tomando una submuestra de un mililitro de biopelícula diluida, centrifugándola a 8.000 g durante 10 minutos y, a continuación, volviendo a suspender el pellet en un mililitro de etanol al 90%. Guarde la suspensión durante la noche a cuatro grados centígrados y repita el proceso nuevamente al día siguiente. Utilizando la misma configuración optimizada de citometría de flujo, mida las propiedades ópticas y fluorescentes de las células dañadas y en descomposición.

Después de configurar los parámetros del citómetro de flujo y construir la base de datos de referencia, es hora de comenzar a recolectar muestras para la campaña de monitoreo. Las muestras deben recogerse y procesarse como se ha mostrado en los pasos anteriores, con la excepción de que la sonicación debe durar un minuto a 45 kilohercios. Una vez que esté listo para analizar, tome muestras del almacenamiento.

Para evitar bloquear el citómetro de flujo, filtre las submuestras a través de filtros de poros de 50 micrómetros, luego cargue uno o dos mililitros de las muestras individuales en el citómetro de flujo y mida las propiedades ópticas y fluorescentes de cada partícula. Repita la medición tres veces para cada muestra. Abra MATLAB y ejecute CYT como una caja de herramientas.

A continuación, importe los datos de citometría de flujo reducido como un archivo csv en el software CYT. A continuación, utilice la transformación de arco hiperbólico para transformar los canales fluorescentes de todas las muestras. Introduzca 150 como valor del cofactor.

Este valor funciona para la mayoría de las biopelículas fototróficas y citómetros de flujo, pero puede ser necesaria la optimización. Para el control de calidad, trace y compare visualmente los histogramas de muestras individuales y canales ópticos y fluorescentes individuales para asegurarse de que no haya valores atípicos en el nivel técnico y biológico de la replicación. Los valores atípicos se manifestarán en distribuciones ópticas fluorescentes significativamente desplazadas entre las réplicas.

A continuación, combine las réplicas técnicas en cada réplica biológica y submuestree las réplicas biológicas de modo que cada una esté representada por el mismo número de partículas. El número ideal de partículas analizadas por Barnes-Hut Stochastic Neighbor Embedding es de alrededor de 150.000. Para la comparación entre muestras, seleccione solo las muestras que se van a comparar y ejecute la incrustación de vecino estocástico de Barnes-Hut.

Una vez finalizado el algoritmo, aparecen nuevos canales, denominados bh-SNE1 y bh-SNE2. Visualice los datos de los canales resultantes como un diagrama de dispersión para mostrar todas las coordenadas de incrustación de vecino estocástico que contienen todas las partículas analizadas. Si los grupos no son visualmente separables, es probable que se hayan utilizado demasiadas o no suficientes partículas en el análisis.

Ajuste el número de partículas y repita el análisis. En el mapa viSNE, las partículas se colocan de acuerdo con la similitud y se agrupan en grupos visualmente separables. Inspeccione las propiedades fluorescentes ópticas de los grupos y marque y nombre aquellos que estén bien separados y tengan propiedades diferentes utilizando las herramientas de dibujo.

Para el análisis estadístico posterior, exporte los clústeres de viSNE a MATLAB. Utilizando el procedimiento aquí presentado, se analizaron muestras tomadas de varios sitios de un arroyo local en Suiza. Utilizando mapas viSNE, es posible distinguir entre diferentes biopelículas ambientales.

Aquí, seis muestras diferentes presentan diferentes densidades en varias partes del mapa viSNE. Los mapas viSNE que se muestran aquí están poblados por partículas con diferentes propiedades ópticas y de fluorescencia que dan pistas sobre el origen biótico/abiótico de las partículas y a qué grupo taxonómico pertenecen las partículas bióticas. Además, la proyección de la base de datos de referencia en el mapa viSNE puede ayudar a interpretar qué partes del mapa están pobladas por qué taxones y/o partículas abióticas.

También puede establecer qué subpoblaciones son diferentes entre las muestras. Aquí se muestra el número de partículas de cada subpoblación para cada una de las diferentes réplicas biológicas. Una vez dominada, esta técnica se puede realizar en dos horas desde la recolección de la muestra hasta el análisis final.

Siguiendo este procedimiento, se pueden utilizar otros métodos, como la clasificación celular activada por fluorescencia, para validar las predicciones de la agrupación visual. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo usar la citometría de flujo y el agrupamiento visual para analizar biopelículas acuáticas.